基于AgNPs@PCN-224纸基荧光传感材料及其在生物胺检测中的应用

基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料及其在生物胺检测中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物胺检测技术领域，具体是一种基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料及其在生物胺检测中的应用。


背景技术：

2.生物胺广泛存在于各类食品中，尤其在蛋白质和氨基酸丰富的食品含量较高，比如肉制品、发酵类食品、乳酪及奶制品及水产品。大量微生物生长会使蛋白质发生一系列降解反应，生成酮酸及胺类一些小分子物质，便会导致食品中生物胺的积累而超标。食品中常见的8种生物胺主要包括酪胺、组胺、腐胺、尸胺、2-苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺，其中组胺和酪胺既是食品中存在含量最高的，同时也是对人类健康危害最大的。组胺被认为是毒性最大的生物胺，其次是酪胺，腐胺和尸胺虽然毒性比较弱，但是它们可以抑制组胺和酪胺代谢酶的活性，从而会增强组胺和酪胺的毒性，还能够与(亚)硝酸盐反应生成亚硝胺等致癌物质，增加生物胺的毒性风险。
3.食品中生物胺的快速检测是目前亟待需要解决的问题。生物胺属于小分子物质，且大部分在可见光和紫外光波长范围内无明显吸收，也没有荧光物质，导致快速检测较为困难，传统的检测方法需要在检测前进行衍生化处理后再进行仪器分析，操作复杂且费时。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供通过合成agnps@pcn-224，且二胺氧化酶与不同浓度生物胺作用能产生双氧水，双氧水刻蚀agnps使荧光恢复。以荧光恢复量为指标，用于食品中生物胺的检测，从而建立快速检测生物胺的新方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料，包括1mg/ml的pcn-224、2.5mmol/l的agno3和0.1mol/l的nabh4，且1mg/ml的pcn-224、2.5mmol/l的agno3和0.1mol/l的nabh4的体积比为40:4:1。
7.基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料的制备方法，其具体步骤如下：
8.s1、mofs纳米材料pcn-224合成：取5，10，15，20-四(4-羧基苯基)卟啉tcpp、zrocl2和苯甲酸，使它们在超声的条件下均匀混合在的n，n-二甲基甲酰胺dmf中，并在90℃条件下反应5h，得到浓度为1mg/ml的pcn-224；
9.s2、agnps@pcn-224制备：按照体积比将浓度为1mg/ml的pcn-224中加入浓度为2.5mm(0.425mg/ml)的agno3搅拌1h，再向其加入浓度为0.1m(3.8mg/ml)的nabh4搅拌3h，得到agnps@pcn-224溶液后，在14000rpm离心20min，用超纯水洗涤3次，制得agnps@pcn-224。
10.本发明进一步设置为：步骤s2中5，10，15，20-四(4-羧基苯基)卟啉tcpp、zrocl2和苯甲酸的重量比为1：3：22。
11.本发明进一步设置为：步骤s2中的反应温度为40℃，且通过pbs缓冲溶液调节ph为
6.5。
12.基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料在生物胺检测中的应用，具体方法如下：
13.s1、样本验证:取不同浓度的生物胺，分别加入浓度为20μg/ml二胺氧化酶溶液，加入agnps@pcn-224和pbs缓冲溶液溶液，室温下反应20min后，得到不同浓度的检测样本，利用荧光谱仪测量不同浓度的检测样本在600-800nm处的荧光发射光谱；
14.s2、性能分析：根据步骤一中的荧光发射光谱的结果，制作光谱图和不同生物胺浓度的荧光强度折线图，发现在660nm处有最大的发射峰，并且随着生物胺浓度的增加，逐渐增加，并且在1
×
10-4
μm-100μm有良好的线性关系。
15.本发明进一步设置为：所述步骤一生物胺与二胺氧化酶溶液的体积比为1:1。
16.本发明进一步设置为：所述步骤一中的二胺氧化酶的ph值为7.0，反应温度35℃，反应时间30min。
17.本发明进一步设置为：所述步骤一中的生物胺包括组胺、腐胺和尸胺，且步骤二中组胺、腐胺和尸胺的线性关系一致一种荧光传感的构建方法在生物胺检测中的应用。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
19.(1)利用具有荧光特性锆基卟啉类金属有机框架(metal organic framework，mof)纳米材料pcn-224构建荧光生物传感，利用银纳米粒子agnps的表面等离子共振作用，使pcn-224的荧光猝灭的特性合成agnps@pcn-224，同时二胺氧化酶与生物胺作用产生双氧水可将agnps@pcn-224表面的agnps刻蚀，使其荧光恢复，在荧光光谱仪的观察下，呈良好的线性关系，并且具有明显的荧光发射峰，从而实现对生物胺的可视化检测，检测速度快的同时，使用更为方便。
20.(2)该基于纳米材料agnps@pcn-224制备的方法及其在生物胺检测中的应用，操作简单、所需设备简单，且可应用与实际食品样品中的生物胺的检测，为检测食品的生物胺提供了一种新方法。
附图说明
21.图1为本发明pcn-224的荧光光谱图和三维荧光光谱图；
22.图2为本发明pcn-224和agnps@pcn-224的紫外光谱图；
23.图3为本发明pcn-224的电镜图；
24.图4为本发明验证例一中不同样本的紫外光谱图和荧光光谱图，插图中，离心管1显示pcn-224，管2和3是agnps@pcn-224在加入h2o2前后在365nm紫外灯照射下的照片；
25.图5为本发明不同双氧水浓度下的荧光发射光谱图；
26.图6为本发明660nm处不同双氧水浓度的荧光恢复标准曲线图；
27.图7为本发明不同生物胺浓度下的荧光发射光谱图；
28.图8为本发明660nm处不同生物胺浓度的荧光恢复标准曲线图；
29.图9为本发明特异性实验结果示意图；
30.图10为本发明对实际食品样品中的生物胺进行检测及加标回收试验表图；
31.图11为本发明可视化检测食品中生物胺的方法原理示意图。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.请参阅图1-11：
34.实施例一、
35.一种基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料的制备方法，具体包括以下步骤：
36.s1、mofs纳米材料pcn-224合成：取10mg tcpp，30mg zrocl2，220mg苯甲酸在超声的条件下均匀溶解在10ml n，n-二甲基甲酰胺(n，n-dimethylformamide，dmf)中，并转入50ml圆底烧瓶中，在90℃条件下反应5h。反应结束后，自然冷却，所得的深紫色的立方晶用dmf和丙酮洗，获得带有紫红色的pcn-224溶液。
37.s2、agnps@pcn-224制备：1ml 1mg/ml pcn-224中加入2.5mm 100μl agno3剧烈搅拌1h，再向其加入0.1m 25μl nabh4搅拌3h，得到agnps@pcn-224溶液后，在14000rpm离心20min，用超纯水洗涤3次后备用。
38.验证说明、
39.通过紫外和荧光的方法对合成的pcn-224和agnps@pcn-224进行表征，验证所需纳米材料合成，结果如附图1、附图2和附图3所示。
40.附图1中图1a、b是pcn-224的荧光光谱图和三维荧光光谱图。由图1a可知样品在660nm处有较强的荧光发射峰，由图1b可知pcn-224采用三维荧光光谱仪进行检测时，激发光谱ex的扫描范围为350～600nm，发射光谱em的扫描范围为600～750nm，并且可知在激发波长420nm，发射波长660nm处的荧光强度最大。
41.附图2中，通过对特征吸收峰的分析可以表明成功合成了pcn-224。pcn-224在518nm处有一个soret带，在553、592和648nm处有3个q带。而合成的agnps@pcn-224的吸收光谱与pcn-224相比，在相同的位置均出现了峰，且agnps@pcn-224的峰值值变得更大，这是由于agnps的吸收带的影响，表明agnps@pcn-224成功合成。
42.基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料在生物胺检测中的应用：
43.向200μl的生物胺(组胺、尸胺、腐胺；ph7)和200μl的干扰物质(半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、正己烷；ph7)分别加入200μl的20μg/ml二胺氧化酶溶液(ph7),在35℃温度条件下反应30min，再分别取200μl后的产物加入agnps@pcn-224溶液进行反应，最后移入比色皿中测定其荧光强度，结果如附图9所示，可以明显看出除了生物胺的反应产物的荧光强度较高，而干扰物质的反应产物的荧光强度较低，表明传感器对胺类检测有较好的特异性。
44.对实际食品样品中的生物胺进行检测及加标回收实验，首先，取20.0g的鱼肉与20.0ml的3％三氯乙酸混合，高速涡旋提5min后，10000r/min离心10min。取上清液加入20.0ml正己烷高速涡流5min去除脂肪。收集下层溶液，用naoh溶液调节ph至中性，pbs适当稀释，实际样品加标回收实验结果如附图10所示。
45.组胺、尸胺和腐胺均属于二胺类生物胺，这些等物质量的生物胺类与二胺氧化酶作用产生等物质量的双氧水，因此可以采用组胺作为生物胺的代表物进行实验。组胺、尸胺和腐胺均属于二胺类生物胺，课题组已验证这些等物质量的生物胺类与二胺氧化酶作用产
生等物质量的双氧水，因此采用组胺作为生物胺的代表物进行实验。本发明选用的mof材料其框架结构合成过程简单，并且对环境污染小。同时具有可调的多孔结构，能使基于mof的传感器的响应时间和灵敏度与其他荧光传感器相比可以提高4倍。pcn-224作为一个具有代表性的卟啉类化合物，具有很高的化学稳定性和热稳定性，使得pcn-224可以重复使用，同时作为一种多相催化剂，具有很高的催化效率。
46.验证例一、
47.选取100μl 0.35mg/ml pcn-224+100μl h2o、100μl 0.5mg/ml agnps@pcn-224+100μl h2o和100μl 0.5mg/ml agnps@pcn-224+100μl 10nm h2o2三组样品，利用荧光光谱仪，进行光谱分析，结果如附图4所示，从附图4中可以看出，pcn-224在660nm处表现出发射峰(黑色图谱)；当负载上银后，agnps的表面等离子共振作用，使得pcn-224的荧光猝灭，荧光强度明显下降(红色图谱)；而加入双氧水后，由于双氧水的刻蚀使得pcn-224荧光恢复(蓝色图谱)。在荧光仪中365nm的灯下照射的图像(插图)可以看出，pcn-224有紫色荧光，当负载上银后后，荧光猝灭；然而当加入双氧水反应后，荧光又恢复了。由此表明了pcn-224的荧光恢复agnps@pcn-224系统中，是h2o2对agnps蚀刻反应的结果。该方法可用于检测双氧水。
48.验证例二、
49.取100μl 0.5mg/ml新合成的agnps@pcn-224溶液，100μl不同浓度的过氧化氢溶液，然后35℃条件下反应5min，最后利用荧光光谱仪测定样品在600-700nm处的荧光强度，结果如附图5和附图6所示，其中附图5中在660nm处有最大荧光强度，且随着双氧水浓度的增加，pcn-224的荧光恢复程度逐渐增大，如附图6所示，在10～100nm呈现有良好的线性关系。
50.验证例三、
51.二胺氧化酶能分解生物胺产生双氧水，agnps@pcn-224体系的反应产物的荧光强度与生物胺浓度呈线性关系，故推断agnps@pcn-224体系的反应产物的荧光强度与生物胺浓度呈线性关系，具体验证包括如下步骤：
52.步骤一、样本验证：由于组胺、腐胺和尸胺均属于二胺类生物胺，本课题组已验证这三种生物胺均可与二胺氧化酶产生等量双氧水，这里选用组胺作为二胺类生物胺的代表物进行实验。取200μl不同浓度的组胺，加入200μl的20μg/ml二胺氧化酶溶液，35℃下反应30min后，加入agnps@pcn-224和pbs缓冲溶液溶液，室温下反应20min后，得到不同浓度的检测样本，利用荧光光谱仪测量不同浓度的检测样本在600-800nm处的荧光发射光谱；
53.步骤二、性能分析：根据步骤一中的荧光发射光谱的结果，制作光谱图和目标物不同浓度的荧光强度折线图，如附图7和附图8所示，其中附图7中发现在660nm处有最大的发射峰，并且随着生物胺浓度的增加，逐渐增加，如附图8所示，在0.1nm-100μm有良好的线性关系。
54.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
55.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料，其特征在于，包括1mg/ml的pcn-224、2.5mmol/l的agno3和0.1mol/l的nabh4，且1mg/ml的pcn-224、2.5mmol/l的agno3和0.1mol/l的nabh4的体积比为40:4:1。2.根据权利要求1所述的基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料的制备方法，其特征在于，其具体步骤如下：s1、mofs纳米材料pcn-224合成：取5，10，15，20-四(4-羧基苯基)卟啉tcpp、zrocl2和苯甲酸，使它们在超声的条件下均匀混合在的n，n-二甲基甲酰胺dmf中，并在90℃条件下反应5h，得到浓度为1mg/ml的pcn-224；s2、agnps@pcn-224制备：按照体积比将浓度为1mg/ml的pcn-224中加入浓度为2.5mm的agno3搅拌1h，再向其加入浓度为0.1m的nabh4搅拌3h，得到agnps@pcn-224溶液后，在14000rpm离心20min，用超纯水洗涤3次，制得agnps@pcn-224。3.根据权利要求2所述的基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料的制备方法，其特征在于，步骤s2中5，10，15，20-四(4-羧基苯基)卟啉tcpp、zrocl2和苯甲酸的重量比为1：3：22。4.根据权利要求3所述的基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料的制备方法，其特征在于，步骤s2中的反应温度为40℃，且通过pbs缓冲溶液调节ph为6.5。5.根据权利要求1所述的基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料在生物胺检测中的应用，其特征在于，具体方法如下：s1、样本验证:取不同浓度的生物胺，分别加入浓度为20μg/ml二胺氧化酶溶液，加入agnps@pcn-224和pbs缓冲溶液溶液，室温下反应20min后，得到不同浓度的检测样本，利用荧光谱仪测量不同浓度的检测样本在600-800nm处的荧光发射光谱；s2、性能分析：根据步骤一中的荧光发射光谱的结果，制作光谱图和不同生物胺浓度的荧光强度折线图，发现在660nm处有最大的发射峰，并且随着生物胺浓度的增加，逐渐增加，并且在1
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μm-100μm有良好的线性关系。6.根据权利要求5所述的基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料及其在生物胺检测中的应用，其特征在于，所述步骤一生物胺与二胺氧化酶溶液的体积比为1:1。7.根据权利要求6所述的基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料及其在生物胺检测中的应用，其特征在于，所述步骤一中的二胺氧化酶的ph值为7.0，反应温度35℃，反应时间30min。8.根据权利要求7所述的基于agnps@pcn-224纸基荧光传感材料及其在生物胺检测中的应用，其特征在于，所述步骤一中的生物胺包括组胺、腐胺和尸胺，且步骤二中组胺、腐胺和尸胺的线性关系一致一种荧光传感的构建方法在生物胺检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于AgNPs@PCN-224纸基荧光传感材料及其在生物胺检测中的应用，包括1mg/mL的PCN-224、2.5mmol/L的AgNO3和0.1mol/L的NaBH4，且1mg/mL的PCN-224、2.5mmol/L的AgNO3和0.1mol/L的NaBH4的体积比为40:4:1。利用具有荧光特性锆基卟啉类金属有机框架纳米材料PCN-224构建荧光生物传感，利用银纳米粒子AgNPs的表面等离子共振作用，使PCN-224的荧光猝灭的特性合成AgNPs@PCN-224，同时二胺氧化酶与生物胺作用产生双氧水可将AgNPs@PCN-224表面的AgNPs刻蚀，使其荧光恢复，在荧光光谱仪的观察下，呈良好的线性关系，并且具有明显的荧光发射峰，从而实现对生物胺的可视化检测，检测速度快的同时，使用更为方便。使用更为方便。使用更为方便。


技术研发人员：马静 周梅 王世双 孙卫青 张宁 张思渺 黄宇彤
受保护的技术使用者：长江大学
技术研发日：2023.03.23
技术公布日：2023/8/14