一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒及其制备方法与应用

1.本发明属于生物制备技术领域，尤其涉及一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒及其制备方法与应用。


背景技术：

2.类外泌体样纳米颗粒(exosome-like nanoparticles，elns)是细胞所分泌的纳米级小泡，双层磷脂包围的囊泡状结构，携带独特的生物活性物质(如脂质、蛋白质、mirnas和次级代谢物等)。植物elns中蛋白含量丰富，多数为膜蛋白，可维持elns结构的稳定以及作为生物活性成分发挥作用。植物elns通常为可食用植物分泌的，具有安全可靠、副作用小的优点，还可作为药物载体。
3.目前，大量药食同源的植物被广泛用于各种疾病的治疗，而从这些植物中分离出的多糖、多酚等物质被视为治疗疾病的主要功能成分。近年来研究表明，植物中除了上述化学成分外，自身能够分泌elns。其中，软枣猕猴桃(actinidia arguta)，别名软枣子、奇异莓等，是猕猴桃科的一种多年生落叶藤本植物，其果实较小，皮薄无毛。果实中含有叶黄素、黄酮、多酚、天然肌醇和矿物质(p、ca、fe、zn等)等，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降低胆固醇、调节记忆力、抗糖尿病、抗过敏和抗疲劳等功能。因此，软枣猕猴桃是一种价值高、用途广、具有广阔发展前景的果实，但关于软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(actinidia arguta exosome-like nanoparticles，aaelns)的制备和功能作用研究暂无报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒及其制备方法与应用，该方法制备得到的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒结构完整、稳定性好，还具有显著的抗氧化活性。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
7.将软枣猕猴桃果实的汁液进行3500～4500g离心5～15min取上清液a、上清液a 6500～7500g离心15～25min取上清液b、上清液b 9500～10500g离心25～35min取上清液c、上清液c 119000～121000g离心65～75min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000～121000g离心65～75min得到沉淀2，pbs缓冲液重悬沉淀2，即得软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。
8.优选的，所述离心的温度为2～6℃。
9.优选的，所述软枣猕猴桃果实的汁液的制备包括将软枣猕猴桃果实研磨得到。
10.本发明还提供了上述制备方法制备得到的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。
11.优选的，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的平均粒径为157.8nm，zeta电位为-23.07mv。
12.本发明还提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备抗氧化产品中的应
用。
13.优选的，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒具有清除abts
+
·
和/或dpph
·
的活性。
14.本发明还提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备抗氧化损伤产品中的应用。
15.优选的，所述氧化损伤为h2o2所致的氧化损伤。
16.优选的，所述产品提高gsh-px和t-sod的活力，降低mda的含量。
17.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
18.本发明提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒及其制备方法与应用，本发明采用超高速梯度离心的方法制备软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒，该方法操作简单、快速，制备得到的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒结构完整性以及稳定性好，具有显著的抗氧化活性和抗氧化损伤活性，且该产品来源于可食用的软枣猕猴桃，安全性高，为抗氧化产品的筛选提供了一种更加安全可靠的新选择。
附图说明
19.图1为aaelns的形貌表征，a为aaelns超高速离心后沉淀在离心管底部的图片；b：透射电子显微镜观察aalens图片；
20.图2为aaelns的粒径和zeta电位表征，a为粒径分布；b为zeta电位；
21.图3为aaelns的rnas和蛋白质表征结果，a：琼脂糖凝胶电泳图；b：sds-page结果图；
22.图4为不同储存时间和温度下aaelns的粒径变化结果，a为不同的储存温度aaelns的粒径随时间的变化结果；b为-80℃条件下，不同的储存时间aaelns的粒径变化结果；
23.图5为aaelns在不同ph(1.2、6.8和7.8)溶液中对其粒径的影响；
24.图6为aaelns的抗氧化性结果，a为aaelns对dpph
·
清除率；b为aaelns对abts
+
·
清除率；
25.图7为raw264.7细胞对aaelns的吸收的结果(标尺＝100μm)；
26.图8为aaelns对raw264.7细胞活力的影响；
27.图9为h2o2对raw264.7细胞活力的影响；
28.图10为aaelns对raw264.7细胞gsh-px、t-sod的活力和mda的含量的影响，a为gsh-px的活力；b为t-sod的活力；c为mda的含量。
具体实施方式
29.本发明提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
30.将软枣猕猴桃果实的汁液进行3500～4500g离心5～15min取上清液a、上清液a 6500～7500g离心15～25min取上清液b、上清液b 9500～10500g离心25～35min取上清液c、上清液c 119000～121000g离心65～75min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000～121000g离心65～75min得到沉淀2，pbs缓冲液重悬沉淀2，即得软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。
31.在本发明中，所述软枣猕猴桃果实的汁液的制备优选的包括将软枣猕猴桃果实研
磨得到，本发明采用研磨工艺保证了制备得到的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的结构完整性。本发明采用超高速梯度离心方法能够除去植物汁液中的果肉组织、杂细胞、细胞片段、细胞器等物质，从而制备纯化软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。作为一优选的实施方式，依次进行3700～4200g离心7～13min取上清液a、上清液a 6600～7300g离心17～23min取上清液b、上清液b 9800～10300g离心27～34min取上清液c、上清液c 119500～120500g离心68～72min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119500～120500g离心68～72min得到沉淀2，pbs缓冲液重悬沉淀2。所述离心的温度优选为2～6℃，进一步优选为3～5℃。
32.本发明还提供了上述制备方法制备得到的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。
33.在本发明中，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的平均粒径为157.8nm，zeta电位为-23.07mv，表明aaelns的稳定性好，囊泡数量6.5
×
10
12
particle/ml，囊泡数量(particles)与蛋白质或rna浓度的比值反应样品纯度，而aaelns的两者比值分别为1.08
×
10
12
particles/μg rna和7.56
×
10
11
particles/μg蛋白质，表明本发明的aaelns纯度高。同时本发明所述方法制备得到aaelns结构完整性好、还具有耐酸性。
34.本发明还提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备抗氧化产品中的应用。
35.在本发明中，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒具有清除abts
+
·
和/或dpph
·
的活性。上述抗氧化产品中，所述产品包括试剂或药物。所述产品还优选的包括药学上可接受的辅料，如粘合剂、赋形剂、稀释剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或多种。所述药物的剂型优选的包括片剂、丸剂、溶液剂、注射剂、颗粒剂、胶囊剂或喷剂。本发明中所述的药物可经口服、直肠、腹腔内、皮下、肌肉内、静脉内或鼻腔施用。
36.本发明还提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备抗氧化损伤产品中的应用。
37.在本发明中，所述氧化损伤优选为h2o2所致的氧化损伤。所述产品提高gsh-px和t-sod的活力，降低mda的含量。上述抗氧化损伤产品中，所述产品包括试剂或药物。所述产品还优选的包括药学上可接受的辅料，如粘合剂、赋形剂、稀释剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或多种。所述药物的剂型优选的包括片剂、丸剂、溶液剂、注射剂、颗粒剂、胶囊剂或喷剂。本发明中所述的药物可经口服、直肠、腹腔内、皮下、肌肉内、静脉内或鼻腔施用。
38.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
39.在以下的实施例中，所述试验所用材料、试剂名称及厂家见表1。
40.材料与试剂：
41.表1试验所用试剂名称及厂家
[0042][0043]
在以下实施例中，本发明所用的统计学分析：试验数据采用graphpad prism8软件分析和制图。通过spss 22.0软件统计分析，采用单因素方差分析(one-wayanova)，以最小显著差异(least significant difference，lsd)法进行两两比较，p《0.05具有统计学意义。
[0044]
实施例1
[0045]
一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(actinidia arguta exosome-like nanoparticles，aaelns)的制备方法，步骤如下：
[0046]
选用新鲜的软枣猕猴桃成熟期果实，清洗干净后研磨成汁，取汁液于50ml离心管中，在4℃条件下依次进行4000g离心10min取上清液a、上清液a 7000g离心20min取上清液b、上清液b 10000g离心30min取上清液c、上清液c120000g离心70min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1120000g离心70min，小心弃干净上清得到沉淀2，用pbs缓冲液溶解沉淀2，吹打混匀后为aaelns。以上操作均在无菌条件下进行。
[0047]
实施例2
[0048]
一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(actinidia arguta exosome-like nanoparticles，aaelns)的制备方法，步骤如下：
[0049]
选用新鲜的软枣猕猴桃成熟期果实，清洗干净后研磨成汁，取汁液于50ml离心管中，在3℃条件下依次进行3500g离心15min取上清液a、上清液a 6500g离心35min取上清液b、上清液b 9500g离心35min取上清液c、上清液c119000g离心75min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000g离心75min，小心弃干净上清得到沉淀2，用pbs缓冲液溶解沉淀2，吹打混匀后为aaelns。以上操作均在无菌条件下进行。
[0050]
实施例3
[0051]
一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(actinidia arguta exosome-like nanoparticles，aaelns)的制备方法，步骤如下：
[0052]
选用新鲜的软枣猕猴桃成熟期果实，清洗干净后研磨成汁，取汁液于50ml离心管中，在6℃条件下依次进行4500g离心5min取上清液a、上清液a 7500g离心25min取上清液b、上清液b 10500g离心25min取上清液c、上清液c121000g离心65min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1121000g离心65min，小心弃干净上清得到沉淀2，用pbs缓冲液溶解沉淀2，吹打混匀后为aaelns。以上操作均在无菌条件下进行。
[0053]
试验例1
[0054]
1.1实施例1制备得到的aaelns表征
[0055]
1.1.1将实施例1采用超高速离心后沉淀在离心管底部的aaelns进行拍照。
[0056]
1.1.2透射电子显微镜表征
[0057]
10μlaaelns加到碳涂层网格上，静置20min，pbs清洗，50μl 1％戊二醛液作用5min，双蒸水清洗2min(重复8次)，50μl乙酸双氧铀液作用5min，50μl甲基纤维素-乙酸双氧铀液作用10min。滤纸吸去多余液体，空气中干燥10min，80kv下拍摄电镜照片。
[0058]
由图1结果表明，明显看到沉淀在超离管底部，呈现米白色(黑色为记号笔标记)(图1a)。随后，利用透射电子显微镜对沉淀进行形貌观察(图1b)，aaelns呈茶杯托状结构(箭头所示)。表明本发明制备得到的aaelns具有类外泌体样纳米颗粒外形特点。
[0059]
1.1.3粒径和zeta电位表征
[0060]
用超纯水清洗样品池3～5次，aaelns与pbs按照1:1000(v/v)稀释，在室温下检测粒径和zeta电位。
[0061]
如图2a所示，样品粒径范围在78～220nm，平均粒径157.8nm，pdi指数0.211，囊泡数量6.5
×
10
12
particle/ml。表明aaelns具有较好的稳定性，符合elns的粒径大小分布。zeta电位的绝对值越高，表明体系越稳定，不易凝聚。aaelns的zeta电位为-23.07mv(图2b)，aaelns带负电荷，溶液体系相对稳定。
[0062]
1.1.4rnas表征
[0063]
1.1.4.1rnas提取
[0064]
参考trizol universal总rna提取试剂盒说明书，提取aaelns中的rnas。
[0065]
1.1.4.2琼脂糖凝胶电泳
[0066]
在超微量紫外分光光度计上测定rna浓度。选择上样量为1μg，设置aaelns组和加入等体积rnase后的无rna组，琼脂糖凝胶浓度1％，电泳电压80v，电泳时间30min，显影成像。
[0067]
1.1.5蛋白质表征
[0068]
1.1.5.1蛋白提取
[0069]
操作均在冰上进行，4℃复溶aaelns，在4℃下10000g离心5min，用预冷pbs洗涤。加入等体积的ripa裂解液(ripa:pmsf:磷酸酶抑制剂＝100:1:1)，吹打混匀并置于冰上30min，每隔10min在漩涡混合仪上振荡30s。4℃条件下转速为12000g离心10min，将上清液转移到新的ep管中，即得aaelns总蛋白产物。
[0070]
1.1.5.2蛋白浓度测定
[0071]
按照bca法测定蛋白浓度。
[0072]
1.1.5.3sds-page
[0073]
(1)配胶
[0074]
根据sds-page凝胶试剂盒依次配置分离胶和浓缩胶。
[0075]
(2)sds-page电泳
[0076]
将样品在沸水浴中煮沸变性3～5min，80v恒压开始电泳，蛋白条带移至分离胶时，电压调至120v恒压，蛋白离开分离胶进入电泳液后停止电泳。
[0077]
(3)固定
[0078]
固定液配置：30ml无水乙醇和0.5ml戊二醛，双蒸水定容至100ml。将胶片放入固定液中30min。
[0079]
(4)染色
[0080]
染色液配置：准确称取1.25g考马斯亮蓝r-250，加入225ml甲醇和50ml冰醋酸，双蒸水定容至500ml。将胶片放入染色液中染色4h。
[0081]
(5)脱色
[0082]
脱色液配置：8ml乙酸和25ml甲醇，双蒸水定容至100ml。将胶片放入脱色液中，于脱色摇床脱色扩散，背景清晰后拍照。
[0083]
其中，样品提取得到的rna和蛋白浓度分别为6ng/μl和8.60μg/μl。囊泡数量(particles)与蛋白质或rna浓度的比值可以反应样品纯度，aaelns的两者比值分别为1.08
×
10
12
particles/μg rna和7.56
×
10
11
particles/μg蛋白质。而哺乳动物细胞elns的该值通常在109的范围内，较高颗粒与蛋白质比值表明本发明的aaelns可能比哺乳动物细胞衍生的elns每个囊泡含有更多的rnas和蛋白质。
[0084]
琼脂糖凝胶电泳结果表明，aaelns中存在小分子量的rna(图3a)。sds-page结果表明，样品蛋白的分子量在35kda以下(图3b)。综上，实施例1提取得到的样品具有外泌体的基本特征，可以确定为aaelns。
[0085]
1.2实施例1制备得到的aaelns的储存稳定性
[0086]
1.2.1时间对aaelns稳定性的影响
[0087]
将aaelns分别取10μl分装于多个ep管中，-80℃储存。aaelns与pbs按照1:1000(v/v)稀释，分别在第0、1、3、5、7、9、11、13、18、24、30d测定粒径的变化。
[0088]
1.2.2温度对aaelns稳定性的影响
[0089]
将aaelns，分别取10μl分装于多个ep管中，4℃和-80℃储存。aaelns与pbs按照1:1000(v/v)稀释，在第0、3、6、9、12、15d测定不同温度下的粒径。
[0090]
结果如图4所示，在-80℃条件下，aaelns放置30d粒径未发生明显变化；在4℃条件
下，0～6d内粒径没有显著变化，随着时间的增加，粒径出现不同程度的增加，可能有聚集现象，表明aaelns在-80℃条件下储存较稳定。综上，aaelns在4℃中短期(如6天内)保存，长期保存(如30d以上)需置于-80℃。
[0091]
1.2.3ph对aaelns稳定性的影响
[0092]
将aaelns取适量分装于ep管中，分别加入用蒸馏水、hcl和naoh配置的三种不同ph溶液(1.2，6.8和7.8)，放置于恒温震荡水浴锅中(37℃)，分别在第0和2h测定粒径。
[0093]
胃液、小肠液和结肠液的ph值分别约为1.2、6.8和7.8，探究aaelns在不同ph下的粒径稳定性，为aaelns口服递送提供参考数据。
[0094]
如图5所示，在0～2h内，aaelns在三种不同环境下粒径范围均有不同程度的增加。ph 1.2的酸性条件下，粒径基本不发生变化；在ph 6.8和ph 7.8的溶液中，粒径的跨度较明显。表明aaelns短时间内在酸性溶液中较稳定。
[0095]
1.3实施例1制备得到的aaelns的抗氧化性能
[0096]
1.3.1对aaelns进行化学和物理破坏
[0097]
在1mlaaelns中加入1μltriton x-100常温反应30min，进行化学解构。超声(开2s，关2s，总时间1min)处理aaelns，进行物理破坏。
[0098]
1.3.2dpph
·
清除活性
[0099]
取50μlaaelns，分别加入150μl dpph工作液，振荡混匀后室温避光反应30min，在517nm波长处测定吸光值，按公式1-1计算dpph
·
清除率。
[0100][0101]
式中：a0：蒸馏水代替样品溶液的吸光度；
[0102]
a1：样品与dpph工作液的吸光度；
[0103]
a2：样品与无水乙醇溶液的吸光度。
[0104]
dpph
·
在517nm处有强吸收，醇溶液呈紫色。当存在自由基清除剂时，与dpph单电子配对致使其吸收消失。tritonx-100可溶解脂质，超声通过高频率机械震荡破坏细胞膜，两者均可对磷脂膜造成伤害破坏aaelns结构。如图6a所示，aaelns具有清除dpph
·
的能力。triton x-100使aaelns清除dpph
·
能力显著下降4.45％(p《0.01)；超声后，aaelns清除dpph
·
能力显著下降9.24％(p《0.01)。
[0105]
1.3.3abts
+
·
清除活性
[0106]
取50μlaaelns，分别加入150μlabts工作液，振荡混匀后室温避光反应30min，在波长734nm处测定吸光值，按公式1-2计算abts+
·
清除率。
[0107][0108]
式中：a0：蒸馏水代替样品溶液的吸光度；
[0109]
a1：样品与abts工作液的吸光度；
[0110]
a2：样品与pbs溶液的吸光度。
[0111]
abts在氧化剂作用下会氧化成绿色abts
+
·
，当存在抗氧化物时，就会抑制abts
+
·
的产生。如图6b所示，aaelns具有清除abts
+
·
的能力。当aaelns被超声和triton x-100处理后，aaelns清除abts
+
·
的能力显著下降，分别下降8.73％和6.10％(p《0.01)。
[0112]
综上，aaelns具有抗氧化能力。当采用物理或化学解构破坏aaelns后，显著降低了抗氧化能力，提示aaelns的抗氧化活性与结构完整性有密切关系。
[0113]
1.4实施例1制备的aaelns对raw264.7细胞氧化损伤的保护作用
[0114]
1.4.1细胞培养与传代
[0115]
raw264.7细胞贴壁生长，培养于完全培养基(含10％fbs的dmem培养基)中，置于37℃、5％co2饱和湿度的培养箱，每1～2d更换培养液。当细胞融合度为70～80％左右，进行传代，在培养瓶中留下少许培养液，细胞刮刀轻轻刮拭细胞，收集转移到装有新鲜培养液的离心管内，1000g离心5min，弃上清，加入完全培养基吹打混匀后置于细胞培养箱中培养。
[0116]
1.4.2细胞冻存
[0117]
按照1.4.1方法将细胞收集离心后，向细胞沉淀中加入冻存液(fbs:dmso＝9:1)，轻轻吹打混匀后分装至冻存管中，每管1～1.5ml，用封口膜封严，在冻存管上写明细胞名称、代数、冻存时间和冻存者；将冻存管放入异丙醇梯度冻存盒，-80℃冰箱过夜，再转入液氮罐长期保存。
[0118]
1.4.3细胞复苏
[0119]
从液氮灌中取出冻存细胞，将其放入37℃恒温水浴锅，冻存管顶部保持在液面以上以避免污染，使其迅速融化，并转移至15ml离心管，室温1000g离心5min，弃上清；加入完全培养基，充分吹打混匀成单细胞悬液，转移至细胞培养瓶，于细胞培养箱中培养。
[0120]
1.4.4细胞示踪
[0121]
(1)aaelns标记：在避光条件下，用pbs重悬100μg/mlaaelns，加入终浓度为5μm的pkh26染料，37℃摇床孵育20min，在120000g，4℃下，离心1h，弃上清(除去多余的染料)，用pbs重悬。
[0122]
(2)将pkh26-aaelns加入raw264.7细胞中，置于细胞培养箱中孵育。
[0123]
(3)分别用dio和dapi染细胞膜和细胞核，在0、1.5、3、6h激光共聚焦成像。
[0124]
为了探究raw264.7细胞是否可吸收aaelns，通过pkh26染料(红色)标记aaelns，与raw264.7细胞分别孵育0、1.5、3、6h后，dio染料(绿色)标记细胞膜，dapi染料(蓝色)标记细胞核，通过激光共聚焦显微镜成像。如图7所示，在1.5、3和6h分别观察到了红色的aaelns，aaelns的小尺寸有助于它们的扩散和进一步内化到细胞中。孵育1.5h后，raw264.7细胞的细胞核周围出现了一些红色斑点，荧光强度较弱；3h时，细胞核周围的红色斑点增多，并且在6h时红色斑点的荧光强度进一步增强，表明aaelns可被raw264.7细胞吸收，并运输到细胞核附近。
[0125]
1.4.5aaelns对细胞活力的影响
[0126]
在96孔板中每孔加入100μl密度5
×
105个/ml的细胞悬液，再加入100μl用不含血清的dmem高糖培养基配制的样品溶液，aaelns浓度为0、50、100、200、400和800μg/ml，每个浓度设置3个平行，在细胞培养箱中培养24h。mtt法检测细胞活力：
[0127]
各孔加入5mg/mlmtt溶液150μl，继续孵育4h，终止培养。弃上清后，每孔加150μl dmso，充分振荡，待蓝色结晶溶解后，用酶标仪在490nm波长下测定各孔od值。按照下列公式计算细胞活力：
[0128]
[0129]
式中：a0：空白组吸光度；
[0130]
a1：样品处理组吸光度。
[0131]
为了评估aaelns是否对raw264.7细胞具有毒性作用，分别用0、50、100、200、400、800μg/ml作用raw264.7细胞24h(图8)。mtt测定结果表明，与未处理的细胞相比，aaelns浓度低于400μg/ml时提高了raw264.7细胞活力，表明该浓度范围内aaelns对raw264.7细胞的生长代谢无明显的毒性；当aaelns作用浓度为800μg/ml时，细胞活力降低，但与对照组相比无显著影响。因此，选择aaelns浓度为100、200和400μg/ml进行后续试验。
[0132]
1.4.6h2o2诱导raw264.7细胞氧化损伤模型的建立
[0133]
按照1.4.5方法取细胞于96孔板中，加入200μl用不含血清的dmem完全培养基配制的h2o2溶液，h2o2的最终浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900μmol/l，每个浓度设置6个平行。培养8h，mtt法测定细胞活力。
[0134]
建立raw264.7细胞氧化损伤模型，探究不同浓度h2o2对raw264.7细胞活力的影响。如图9所示，随着h2o2浓度的增加，raw264.7细胞活均显著低于空白对照组(con组)(p《0.001)。当h2o2浓度大于800μmol/l，raw264.7细胞活力不再下降，可能是因为当细胞死亡数达到一定值后，细胞自身的保护机制发挥作用，使其受到h2o2刺激的损伤作用减弱。h2o2浓度为600μmol/l，此时细胞活力值为48.5
±
0.25％，达到了过半损伤。因此，后续选择浓度为600μmol/l的h2o2诱导raw264.7细胞8h来构建氧化损伤模型。
[0135]
1.4.7gsh-px、t-sod活力及mda含量测定
[0136]
待raw264.7细胞生长至对数期时用于试验，将raw264.7细胞浓度调整至1
×
104个/ml加入96孔板，贴壁培养24h后加入含有600μmol/l h2o2培养8h，不同浓度aaelns(100、200和400μg/ml)分别培养24h，另设置对照组(只加入完全培养基)和阳性对照组(完全培养基培养24h后，加入终浓度为600μmol/l的h2o2培养8h，后替换为完全培养基)。收集各孔细胞，根据gsh-px、t-sod活力及mda含量检测试剂盒的实验步骤进行操作，每组3个平行。
[0137]
本发明通过建立h2o2诱导的raw264.7细胞氧化损伤模型，探究aaelns抗氧化作用。gsh-px、t-sod的活力和mda的含量是评价氧化损伤的重要指标，当细胞氧化损伤后，可降低gsh-px和t-sod的活力，升高mda的含量。
[0138]
如图10所示，与未处理组相比，h2o2干预后降低了raw264.7细胞中gsh-px和t-sod的活力，升高了mda的含量，表明h2o2处理后对细胞造成了氧化损伤。aaelns干预后，提高了gsh-px和t-sod的活力，降低了mda的含量。具体来说，与h2o2组相比，其余四组的gsh-px和t-sod的活力均显著降低(p《0.01)；除aaelns的浓度为200μg/ml这一干预浓度外，均显著降低了mda的含量(p《0.05)。表明本发明aaelns能够通过提高gsh-px和t-sod的活力，降低mda的含量改善h2o2导致的氧化损伤。
[0139]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将软枣猕猴桃果实的汁液进行3500～4500g离心5～15min取上清液a、上清液a6500～7500g离心15～25min取上清液b、上清液b9500～10500g离心25～35min取上清液c、上清液c119000～121000g离心65～75min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000～121000g离心65～75min得到沉淀2，pbs缓冲液重悬沉淀2，即得软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心的温度为2～6℃。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述软枣猕猴桃果实的汁液的制备包括将软枣猕猴桃果实研磨得到。4.一种权利要求1～3任意一项所述制备方法制备得到的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。5.根据权利要求4所述的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒，其特征在于，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的平均粒径为157.8nm，zeta电位为-23.07mv。6.权利要求4所述的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备抗氧化产品中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒具有清除abts+
·
和/或dpph
·
的活性。8.权利要求4所述的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备抗氧化损伤产品中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述氧化损伤为h2o2所致的氧化损伤。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品提高gsh-px和t-sod的活力，降低mda的含量。

技术总结
本发明提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒及其制备方法与应用，属于生物制备技术领域，包括将软枣猕猴桃果实的汁液进行3500～4500g离心5～15min取上清液a、上清液a6500～7500g离心15～25min取上清液b、上清液b9500～10500g离心25～35min取上清液c、上清液c119000～121000g离心65～75min取沉淀1，将沉淀1用无菌PBS缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000～121000g离心65～75min得到沉淀2，PBS缓冲液重悬沉淀2，即得。该方法操作简单、快速，制备得到的AAELNs具有显著的抗氧化活性。性。性。


技术研发人员：徐红艳 夏广军
受保护的技术使用者：延边大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/14