绣球菌Stowart及其应用的制作方法

绣球菌stowart及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及绣球菌stowart及其应用。


背景技术：

2.绣球菌(sparassis crispa)是担子菌门，伞菌纲，非褶孔菌目，绣球菌科，绣球菌属的一种食药用大型真菌，野生资源稀少，虽已实现人工栽培，但因其菌丝生长速度慢、生物量低，导致绣球菌母种的制备周期较长。提高绣球菌中有效成分的含量并增强其功效有利于解决绣球菌的资源利用问题，并拓展其应用领域。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供绣球菌stowart。本发明还提供绣球菌stowart的应用及其产品。
4.本发明以保藏编号为cctcc no:m 2015275的绣球菌sc031菌株(绣球菌sc031菌株已于2015年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉，武汉大学，分类命名为绣球菌sparassis crispa sc031，保藏编号为cctcc no:m 2015275，该菌株已在专利申请cn104928189a中公开)为出发菌株，将其进行紫外线诱变并经筛选获得一株绣球菌诱变菌株，将其命名为绣球菌stowart，该菌株的菌丝体具有显著提高的多糖和糖蛋白含量，对于头发、头皮的功效显著提高，且具有较好的遗传稳定性。
5.具体地，本发明提供绣球菌(sparassis crispa)stowart，该菌株已于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072)，分类命名为绣球菌stowart，sparassis crispa stowart，保藏编号为cctcc no：m 20211503。
6.本发明提供一种菌剂，其含有所述绣球菌stowart。
7.优选地，上述菌剂中绣球菌stowart以活菌形式存在。更优选以孢子形式存在。
8.优选地，上述菌剂还含有冻干保护剂和/或载体。
9.上述菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂(例如：干粉菌剂)。
10.本发明提供以上所述的菌剂的制备方法，所述方法包括将绣球菌stowart经培养获得菌液的步骤。
11.本发明还提供一种绣球菌培养物，其由所述绣球菌stowart经培养得到。
12.以上所述的绣球菌培养物优选包含选自绣球菌stowart菌丝体、绣球菌stowart代谢产物、培养基成分中的一种或多种。
13.以上所述的绣球菌stowart菌丝体优选为灭活的菌丝体。
14.以上所述的绣球菌stowart代谢产物可包括胞外代谢产物和/或胞内代谢产物。其中，胞内代谢产物为将绣球菌stowart的菌丝体经破壁等处理得到。
15.本发明还提供一种绣球菌提取物，所述绣球菌提取物采用包括以下步骤的方法制备得到：将所述绣球菌stowart经培养得到培养物，将所述培养物经纤维素酶酶解处理得到
酶解物，将所述酶解物进行超声处理，再经固液分离后取上清液。
16.优选地，纤维素酶酶解处理的温度为40～50℃，ph为4.5～5.5，酶解时间为10～20min。
17.优选地，所述酶解处理包括：将绣球菌stowart的发酵液与水混合，加入ph调节剂调节ph为4.5～5.5，加入纤维素酶进行酶解处理，其中，水的添加量为发酵液质量的5-10倍；ph调节剂的添加量为占酶解体系总质量的0.2-1％，纤维素酶的添加量为占酶解体系总质量的1～3％。
18.优选地，超声处理的条件优选为：超声处理频率为15-25khz，功率为150-170w，温度为30-35℃，时间为30-40min。
19.优选地，在酶解处理前，先对培养物进行灭菌处理。
20.以上所述的绣球菌提取物的制备方法采用纤维素酶酶解配合超声处理的方法，工艺条件可控，绣球菌的活性成分提取率高，得到的绣球菌提取物中富含可经头皮吸收的小分子活性成分，可较好的滋养头皮和头发，修复受损头发内外部结构损伤。
21.作为本发明的一种优选方案，以上所述的绣球菌提取物的制备方法包括如下步骤：
22.(1)制备绣球菌stowart种子液：将绣球菌stowart接入液体种子培养基，在23-29℃，120-160r/min的摇床，培养4-5d；
23.(2)将步骤(1)得到的种子液按照4-10％的接种量接种于发酵培养基中，于23-29℃，120-160r/min的摇床发酵4-5d，得到发酵液；
24.(3)将步骤(2)得到的发酵液灭菌后，与纤维素酶和水混合，加入柠檬酸调节ph至4.5～5.5后进行酶解处理得到酶解液，其中，纤维素酶的添加量为占酶解体系总质量的1～3％；水的添加量为发酵液质量的5-10倍；柠檬酸添加量为占酶解体系总质量的0.2-1％；
25.酶解处理温度为40～50℃，时间为10～20min；
26.(4)将步骤(3)得到的酶解液进行超声处理，经固液分离后取上清液，得到绣球菌提取物。
27.上述步骤(3)中，优选采用柠檬酸进行ph调节。
28.以上所述的种子培养基、发酵培养基的碳源为选自蔗糖、葡萄糖、核糖、乳糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇中的一种或多种。优选为蔗糖。
29.以上所述的种子培养基、发酵培养基的氮源为选自蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉中的一种或多种。优选为蛋白胨和酵母浸粉。
30.以上所述的种子培养基、发酵培养基还包含选自无机盐、维生素中的一种或多种。
31.优选地，所述种子培养基包括如下组分(g：ml)：蔗糖0.5～5％，蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸粉0.2～1.5％，磷酸氢二钾0.01～0.05％，硫酸镁0.01～0.05％，v
b1 0.01～0.05％。
32.优选地，所述发酵培养基包括如下组分(g：ml)：蔗糖0.5～5％，蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸粉0.2～1.5％，磷酸氢二钾0.01～0.05％，硫酸镁0.01～0.05％。
33.绣球菌stowart在上述培养基中具有更好的生长性能。
34.基于绣球菌stowart的功能，本发明提供该菌株的以下用途：
35.本发明提供所述绣球菌stowart或所述菌剂或所述绣球菌培养物或所述绣球菌提
取物在制备食品或药物中的应用。
36.本发明提供所述绣球菌stowart或所述菌剂或所述绣球菌培养物或所述绣球菌提取物在制备化妆品中的应用。
37.本发明提供所述绣球菌stowart或所述菌剂或所述绣球菌培养物或所述绣球菌提取物在制备具有修复受损头发和/或头皮滋养保湿功能的产品中的应用。
38.优选地，所述产品为化妆品。更优选为发用化妆品，包括但不限于洗发水、生发水、染发剂、护发素、发型处理剂、发乳、毛发营养化妆水。
39.本发明提供一种化妆品，所述化妆品含有所述绣球菌提取物。
40.优选地，所述绣球菌提取物在所述化妆品中的质量百分含量为0.1～15％。
41.作为本发明的一种实施方式，所述化妆品为洗发产品，所述洗发产品包含所述绣球菌提取物，还包含本领域允许的洗发产品的基质。
42.本发明的有益效果至少包括以下几点：
43.1、绣球菌stowart的菌丝体的多糖和糖蛋白含量显著高于出发菌。
44.2、绣球菌stowart经10次以上传代培养不退化，具有较高的遗传稳定性。
45.3、绣球菌stowart经发酵、提取制得的提取物具有较好的修复受损头发内外部结构损伤以及滋养护理头发和头皮的作用，可应用于化妆品领域，开发具有头发和头皮滋养护理功能的发用化妆品，在头发洗护用品中具有较高的应用价值，对于解决头皮和头发健康问题具有重要意义，同时提高了绣球菌资源的有效利用。
附图说明
46.图1为本发明实施例2中绣球菌stowart的生长性能测试结果。
47.图2为本发明实施例5中头发接触角的检测结果。
48.图3为本发明实施例5中洗发水修复干发梳理性的检测结果。
49.图4为本发明实施例5中洗发水修复湿发梳理性的检测结果。
具体实施方式
50.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
51.实施例1绣球菌stowart的获得
52.以保藏编号为cctcc no:m 2015275的绣球菌菌株sc031为出发菌株，对该菌株进行紫外线照射诱变和筛选。本发明对紫外线照射诱变的条件参数进行了优化并进行了大量的诱变和筛选试验，最终获得绣球菌stowart。诱变和筛选的基本步骤如下：
53.(1)将绣球菌菌株sc031活化后接种于pda斜面，在26℃恒温箱中培养6天，向斜面培养基中注入ph 6.0的磷酸缓冲液，然后用4层纱布过滤，稀释孢子浓度至10
6-107个/ml，用于诱变育种；
54.(2)采用15w的紫外线照射步骤(1)制备的孢子悬液2min，稀释后涂布平板，在26℃恒温箱中培养2天，用灭菌的牙签点对点植入装有pda固体培养基的96孔板中培养。将培养好的突变株用接种针逐个接种于250ml锥形瓶中进行培养，26℃，150rpm培养5天获得绣球菌菌丝体。
55.经诱变和筛选，获得一株性能优异的绣球菌菌株，将该菌株命名为绣球菌
stowart。绣球菌stowart已于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072)，分类命名为绣球菌stowart，sparassis crispa stowart，保藏编号为cctcc no：m 20211503。
56.实施例2绣球菌stowart的性能检测
57.1、生长性能检测
58.将绣球菌stowart和绣球菌sc031分别接种于液体种子培养基中，在26℃，150r/min的摇床，分别培养1，3，5d，培养结束时测定其菌丝体产量，绘制绣球菌stowart和sc031的生长曲线，其中，种子培养基组成为：3％蔗糖，1％酵母浸粉，1％蛋白胨，0.02％ kh2po4，0.01％mgso4，v
b1 0.01％。
59.结果如图1所示，绣球菌stowart的生长速率明显高于sc031，菌丝体的产量也明显高于出发菌株绣球菌sc031。
60.2、菌丝体的多糖和糖蛋白的含量检测
61.对绣球菌stowart的菌丝体多糖和糖蛋白进行提取和含量测定，具体方法如下：
62.取绣球菌stowart发酵液，在5000rpm条件下离心收集菌丝体，水洗2次，冻干菌丝体，粉碎后过80目筛。分别称取绣球菌stowart菌丝体干粉0.1g三份，各加入5ml蒸馏水，于80℃水浴浸提3h后，5000g/min离心6min，取上清测定菌丝体多糖和糖蛋白含量，结果如表1所示。其中，绣球菌菌株1、2、3、4为实施例1的诱变筛选过程中获得的其它几株性能相对较好的菌株，出发菌株和其它各诱变菌株使用相同的发酵培养条件。
63.发酵培养采用的发酵培养基包括如下组分(g：ml)：3％蔗糖，1％酵母浸粉，1％蛋白胨，0.02％ kh2po4，0.01％ mgso4。
64.发酵培养条件为：26℃，150r/min连续培养5天。结果表明，绣球菌stowart菌丝体的多糖和糖蛋白含量较出发菌株和其它筛选获得的菌株显著提高。
65.表1多糖和糖蛋白含量
[0066][0067][0068]
3、遗传稳定性分析
[0069]
对绣球菌stowart进行传代培养，每隔一代测定菌株的菌丝体的多糖、糖蛋白含量，共培养10代，考察绣球菌stowart的遗传稳定性，部分检测结果如表2所示，结果表明，绣球菌stowart具有较高的遗传稳定性。
[0070]
表2诱变菌株遗传稳定性考察
[0071]
代次多糖g/g糖蛋白mg/g
第1代0.46122第3代0.43123第6代0.46120第10代0.47121
[0072]
实施例3绣球菌stowart的发酵培养和提取物的制备
[0073]
对绣球菌stowart进行发酵培养并制备绣球菌提取物，具体方法如下：
[0074]
(1)制备绣球菌种子液
[0075]
将绣球菌stowart接入液体种子培养基，在23-29℃，120-160r/min的摇床，培养5d，种子培养基组成：3％蔗糖，1％酵母浸粉，1％蛋白胨，0.02％ kh2po4，0.01％mgso4，v
b1 0.01％；
[0076]
(2)发酵
[0077]
将绣球菌种子液按照5％的接种量接种于发酵培养基中，于26℃，150rpm培养5天，得到发酵液，发酵培养基组成：3％蔗糖，1％酵母浸粉，1％蛋白胨，0.02％ kh2po4，0.01％ mgso4；
[0078]
(3)发酵液提取
[0079]
将步骤(2)得到的发酵液(菌丝体含量约为1.68g/l)在121℃下灭菌20min，加入纯水，并加入柠檬酸调ph至5.0后，加入纤维素酶进行酶解处理得到酶解液，纤维素酶的添加量占酶解体系总质量的2％；水的添加量为发酵液质量的8倍；柠檬酸的添加量占酶解体系总质量的0.6％；酶解处理温度为43℃，时间为15min。然后超声处理酶解液，超声处理频率为20khz，功率为160w，温度为35℃，时间为35min。降至室温，即得到绣球菌提取物。
[0080]
实施例4含有绣球菌提取物的洗发水
[0081]
本实施例提供一种洗发水，其组成如下(质量百分含量)：实施例3的绣球菌提取物1％，洗发水基质99％。
[0082]
其中，洗发水基质的组成如下(质量百分含量)：
[0083]
月桂醇聚醚硫酸酯铵15％、甲基肉豆蔻酰基牛磺酸钠3％、月桂酰胺丙基甜菜碱7％，椰油酰胺mea 0.5％，聚季铵盐-47 2％，椰油酰基水解大豆蛋白0.1％，二亚油酰胺丙基pg-二甲基氯化铵磷酸酯钠0.2％，瓜儿胶羟丙基三甲基氯化铵0.2％，香精0.1％，碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.1％，去离子水71.8％。
[0084]
实施例5绣球菌提取物修复受损头发功能检测
[0085]
1、绣球菌提取物修复受损头发的外部毛鳞片损伤效果
[0086]
选取志愿者的健康头发，用十二烷基硫酸钠溶液洗涤后，漂洗干净，自然晾干待用。取头发原样4份，使用0.5g/l的naoh，在30℃浸泡1h，然后取出，漂洗至中性后自然晾干，制备受损头发。
[0087]
采用实施例4的洗发水对受损头发进行清洗处理，清洗后用清水冲净，自然晾干，将未处理(空白样)及处理后发束浸泡在0.2mol/l的硫酸铜溶液中15min，然后测试头发对铜离子吸附量。
[0088]
以含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水作为对照，绣球菌sc031的提取物的制备方法与实施例3中绣球菌stowart的提取物的制备方法相同，区别仅在于将绣球菌stowart替换为绣球菌sc031，含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水的配方与实施例4
的洗发水配方的区别仅在于将绣球菌stowart的提取物替换为绣球菌sc031的提取物，同时以洗发水基质(配方如实施例4中所述)作为对照。
[0089]
表3铜离子吸附量
[0090][0091]
头发受到损伤会使头发带负电荷而吸附铜离子，测定头发吸附铜离子量可以表征头发受损程度。头发受损程度越大，吸附的铜离子就越多。表3中的结果表明，与空白样和洗发水基质相比，实施例4的洗发水处理过的头发的铜离子吸附量明显降低，说明绣球菌stowart的提取物对头发外部毛鳞片损伤具有明显的修复作用，而且，实施例4的洗发水处理过的头发的铜离子吸附量明显低于含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水，表明绣球菌stowart的提取物对头发外部毛鳞片损伤的修复效果明显优于其出发菌株sc031。
[0092]
2、修复受损头发亲水亲油性效果
[0093]
选取三个月内进行过染烫的志愿者30人，每组10人，采集每名志愿者的头发记作空白组，使用实施例4的洗发水对受损头发进行清洗处理，每周使用3次，每周末采集一次志愿者的头发。
[0094]
以含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水作为对照，绣球菌sc031的提取物的制备方法与实施例3中绣球菌stowart的提取物的制备方法相同，区别仅在于将绣球菌stowart替换为绣球菌sc031，含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水的配方与实施例4的洗发水配方的区别仅在于将绣球菌stowart的提取物替换为绣球菌sc031的提取物，同时以洗发水基质(配方如实施例4中所述)作为对照。
[0095]
待3周实验结束后，采用wilhelmy平衡法，将各组头发在干发和湿发两种状态下插入水中，根据所受的力计算得到水在头发表面的接触角，结果如图2所示。
[0096]
头发受损程度与头发表面亲水疏水性有直接关系，头发受损程度越大，其亲水性越强。液体在固体表面铺展后，固/液界面经过液体内部到气/液界面的夹角，称为接触角。水在头发表面接触角越小，铺展越容易，亲水性越强。如图2所示，与染烫头发(空白组)相比较，使用实施例4的洗发水处理的头发，头发的接触角显著性增大，说明绣球菌stowart的提取物可以显著修复头发损伤，恢复头发的亲水亲油性。而且，实施例4的洗发水处理过的头发的接触角明显高于含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水，表明绣球菌stowart的提取物对受损头发亲水亲油性的修复效果明显优于其出发菌株sc031。
[0097]
3、修复头发梳理性的效果
[0098]
对实施例4的洗发水对于头发梳理性的修复效果进行分析，以含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水作为对照，绣球菌sc031的提取物的制备方法与实施例3中绣球菌
stowart的提取物的制备方法相同，区别仅在于将绣球菌stowart替换为绣球菌sc031，含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水的配方与实施例4的洗发水配方的区别仅在于将绣球菌stowart的提取物替换为绣球菌sc031的提取物，同时以洗发水基质(配方如实施例4中所述)作为对照。
[0099]
具体方法如下：
[0100]
选取三个月内进行过染烫的志愿者30人，每组10人，采集每名志愿者的头发，分别使用实施例4和对照组的洗发水清洗头发，使用1周后再采集志愿者的头发。
[0101]
使用自来水冲洗头发，毛巾擦去多余水分，至发束不滴水为止，用梳子梳通顺，用拉力测试仪测试湿发梳理性。
[0102]
然后用吹风机距离发束20cm处把头发吹至半干，用梳子梳通顺，自然晾干，用万能拉力测试仪测试干发的梳理性。测试结果如图3和图4所示。
[0103]
结果表明，实施例4的洗发水样品对头发的梳理性(湿发梳理性和干发梳理性)的作用明显优于各对照组。
[0104]
4、修复染烫受损头发效果
[0105]
验证实施例4的洗发水修复染烫受损头发的效果，以含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水作为对照，绣球菌sc031的提取物的制备方法与实施例3中绣球菌stowart的提取物的制备方法相同，区别仅在于将绣球菌stowart替换为绣球菌sc031，含出发菌株绣球菌sc031的提取物的洗发水的配方与实施例4的洗发水配方的区别仅在于将绣球菌stowart的提取物替换为绣球菌sc031的提取物，同时以洗发水基质(配方如实施例4中所述)作为对照。
[0106]
选取30名年龄在25-60岁之间的近一年内染烫过头发的志愿者，头发在染烫过程受到一定损伤，分成3组，每组10人，分别提供实施例4和各对照组的洗发水，使用时间为2个月，使用频率为每隔两天使用一次，考察该洗发水修复头发内部结构、强健头发的效果。志愿者在实验开始前测量头发断裂最大力和折断功，使用洗发水2个月后测量头发断裂最大力和折断功，对比头发强度变化。实验采用diastron张力仪对头发强度进行测试，结果如表4所示。
[0107]
表4头发断裂强度变化
[0108][0109][0110]
由表4可知，相比于使用前和对照组，使用实施例4的洗发水后，头发断裂最大力和
折断功明显增加，说明绣球菌stowart的提取物可以显著修复头发内部结构，提高头发强度。
[0111]
实施例6绣球菌提取物的头皮滋养保湿效果分析
[0112]
对实施例3的绣球菌提取物进行头皮滋养保湿效果分析，以出发菌株绣球菌sc031的提取物作为对照，绣球菌sc031的提取物的制备方法与实施例3中绣球菌stowart的提取物的制备方法相同，区别仅在于将绣球菌stowart替换为绣球菌sc031。
[0113]
具体方法如下：
[0114]
选取志愿者20人，每组10人，分为2组，在头发处选取5*5cm剔除头发漏出头皮用于实验，采用德国ck皮肤水分测试仪corneometer cm825，将绣球菌提取物用于裸露头皮。在施用开始前，使用皮肤水分测试仪在恒定温度和恒定湿度(21℃和40％湿度)的条件下测定每个受试者的测试头皮水分含量，测定施用后的初始值(t0)以及30分钟(t1)和8小时(t2)的头皮水分含量的变化。
[0115]
表5头皮水分含量检测
[0116][0117]
测试结果如表5所示，结果表明，使用实施例3的绣球菌stowart提取物，使用后30min和8h的皮肤水含量较绣球菌sc031提取物显著提高，说明绣球菌stowart的提取物可以对头皮进行滋养保湿，提供头皮足够水分，延缓头皮衰老。
[0118]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.绣球菌(sparassis crispa)stowart，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20211503。2.一种菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的绣球菌(sparassis crispa)stowart。3.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括将所述绣球菌(sparassis crispa)stowart经培养获得菌液的步骤。4.一种绣球菌培养物，其特征在于，其由权利要求1所述的绣球菌(sparassis crispa)stowart经培养得到。5.一种绣球菌提取物，其特征在于，所述绣球菌提取物采用包括以下步骤的方法制备得到：将权利要求1所述的绣球菌(sparassis crispa)stowart经培养得到培养物，将所述培养物经纤维素酶酶解处理得到酶解物，将所述酶解物进行超声处理，再经固液分离后取上清液。6.根据权利要求5所述的绣球菌提取物，其特征在于，所述纤维素酶酶解处理的温度为40～50℃，ph为4.5～5.5，酶解时间为10～20min；和/或，所述超声处理的频率为15-25khz，功率为150-170w，温度为30-35℃，时间为30-40min。7.权利要求1所述的绣球菌(sparassis crispa)stowart或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的绣球菌培养物或权利要求5或6所述的绣球菌提取物在制备食品或药物中的应用。8.权利要求1所述的绣球菌(sparassis crispa)stowart或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的绣球菌培养物或权利要求5或6所述的绣球菌提取物在制备化妆品中的应用。9.权利要求1所述的绣球菌(sparassis crispa)stowart或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的绣球菌培养物或权利要求5或6所述的绣球菌提取物在制备具有修复受损头发和/或头皮滋养保湿功能的产品中的应用。10.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品含有权利要求5或6所述的绣球菌提取物。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及绣球菌Stowart及其应用。本发明提供的绣球菌(Sparassis crispa)Stowart保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211503。绣球菌Stowart的菌丝体的多糖和糖蛋白含量显著高于出发菌，具有较高的遗传稳定性，经发酵、提取制得的提取物具有较好的修复受损头发内外部结构损伤以及滋养护理头发和头皮的作用，可应用于化妆品领域，开发具有头发滋养护理功能的发用化妆品，同时提高了绣球菌资源的有效利用。菌资源的有效利用。


技术研发人员：郭智华 徐双华 田冉
受保护的技术使用者：北京中京丰创科技有限公司
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/8/14