一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液及其制备方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液及其制备方法。


背景技术：

2.单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, hsk)是常见、可致盲眼病，它主要由单纯疱疹病毒i型(hsv-1)感染所致。hsv-1原发感染后潜伏在三叉神经节（近年来认为角膜亦可能是潜伏场所），且易被反复激活而造成复发性hsk；后者远较原发性hsk常见且严重，治疗棘手，是长期以来眼科领域迫待解决的重要课题之一。其可表现为上皮型、基质型、内皮型等，发病机制迄今尚未完全明了，但基本病理是潜伏的病毒被激活释放到眼角膜后大量增殖所导致的组织炎性破坏或免疫病理损伤，因此，控制该病的关键在于能否迅速、有效地清除或杀伤角膜复发感染病毒，避免其大量增殖。现有研究已明确在病毒感染的过程中，巨噬细胞发挥了对病毒的吞噬、对病毒抗原的递呈及释放趋化因子、细胞因子等作用，招募更多的免疫细胞聚集至眼表清除病原体。目前主要通过全身或局部抗病毒药物治疗单纯疱疹病毒性角膜炎。但抗病毒药物仅能抑制病毒复制，难以彻底清除病毒，治疗效果差，而巨噬细胞可以在疾病的早期发挥上述功能，促进固有免疫和适应性免疫更迅速地清除病毒。因此，以巨噬细胞为靶向的免疫调控药物和治疗方法正成为新的单纯疱疹病毒性角膜炎免疫治疗研究方向。
3.糖蛋白d（gd）是hsv-1包膜糖蛋白之一，通过与宿主细胞表面的一些受体结合，帮助病毒进入宿主细胞，因此gd是病毒在感染期间中和抗体的主要目标。鉴于其在诱导保护性免疫方面的作用，以gd作为主要抗原，开发了亚单位、dna等疫苗，这表明gd有能力在目标物种中诱导强大的病毒中和抗体和强大的细胞介导免疫反应。
4.cd169阳性巨噬细胞是一种特殊的巨噬细胞，表面表达cd169（唾液酸黏附素，sialoadhesin，sn），可与含有唾液酸成分的配体结合。有文献报道，hiv-1病毒感染时，其包膜成分中的唾液酸可被cd169阳性巨噬细胞识别并吞噬，吞噬后的病毒抗原成分递呈给dc细胞从而激活t细胞，发挥细胞毒性t细胞的杀伤作用，清除病毒。因此推测将hsv-1抗原靶向cd169阳性巨噬细胞治疗hsk具有良好前景。
5.神经节苷脂是含有唾液酸的鞘糖脂，在哺乳动物脑组织中含量丰富。相较于其他人工化学合成的cd169配体，神经节苷脂属生物来源的含有唾液酸的物质，可以作为良好的靶向cd169阳性巨噬细胞的配体，减少副作用。
6.脂质体是一种纳米级的药物递送系统，在肿瘤以及一些眼科疾病中已有应用。但大部分脂质体的使用需静脉注射，眼科疾病需结膜下注射，眼表组织小，血液循环流量小，药物经静脉注射循环至眼表的药物少，作用效果较差；结膜下注射操作相对复杂，许多患者因畏惧操作或工作等原因不便使用，依从性较差。基于上述原因，本发明旨在开发一种新型脂质体眼用制剂— —滴眼液来达到药物缓释、作用时间久、患者使用方便以及经济实用的
功能。
7.尽管传统脂质体制剂可以实现药物缓释，但缺乏靶向性。因此，在保证脂质体安全性、稳定性、有效性的基础上，如何构建一种具有主动靶向性的脂质体体系，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

8.为解决上述问题，本发明公开了一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液及其制备方法。
9.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：发明的目的是提供一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液，所述治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液包括病原体抗原物质、靶向巨噬细胞的配体和脂质体辅料和磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液），所述病原体抗原物质为重组hsv-1 gd蛋白，所述靶向巨噬细胞的配体为神经节苷脂gm1，所述脂质体辅料包括二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中的任意一种或多种。
10.进一步地，以质量份数计，每1份重组hsv-1 gd蛋白对应其他原料的质量份数分别为：二硬脂酰磷脂酰胆碱为50-70份，所述胆固醇为15-20份，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺为5-10份，所述神经节苷脂gm1为10-20份；所述磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液）为5-10ml。
11.进一步地，以质量份数计，每1份重组hsv-1 gd蛋白对应其他原料的质量份数分别优选为：二硬脂酰磷脂酰胆碱为63份，所述胆固醇为19份，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺为6份，所述神经节苷脂gm1为12份；所述磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液）为5ml。
12.进一步地，所述的一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液的制备方法包括以下步骤：步骤（1）溶解脂质材料：将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、神经节苷脂gm1加入烧瓶中，以10-20ml氯仿－甲醇混合溶液作为溶剂搅拌10分钟，充分溶解，得到混合溶液；步骤（2）蒸馏：使用旋转蒸发仪蒸馏步骤（1）制得混合溶液，当溶剂完全蒸发，脂质材料混合物形成一层薄膜附着于烧瓶表面时，蒸馏结束，得到脂质膜；步骤（3）水合：向烧瓶中加入5-10ml磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液），同时加入重组hsv-1 gd蛋白（hsv-1），利用超声波清洗仪震荡5分钟，使步骤（2）所得脂质膜充分重悬，形成脂质体pbs溶液；步骤（4）分散：将步骤（3）中所得脂质体pbs溶液放置于超声细胞破碎仪中震荡分散2min，超声工作2s，间隔3s，功率270w，循环3次充分分散脂质体pbs溶液，得到治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液。
13.进一步地，所述治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液为一种靶向cd169阳性巨噬细胞的单唾液酸神经节苷脂gm1脂质体滴眼液，可定向将重组hsv-1 gd蛋白递送至眼表cd169阳性巨噬细胞，有效提高抗病毒免疫效应。
14.进一步地，步骤（1）中所述氯仿-甲醇混合溶液的体积比为氯仿：甲醇=2：1。
15.进一步地，步骤（4）中所述的治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液，分装后，4℃保存。
16.本发明还提供上述的一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液及其制备方法在制备抗单纯疱疹病毒性角膜炎药物中的应用。
17.本发明的有益效果为：1)_本发明为脂质体滴眼液，相比现有的其他脂质体类药物需静脉注射或结膜下注射，本品只需滴眼使用，更加方便，提高了患者的依从性。眼表有泪膜作为屏障保护角膜等眼表组织，通过步骤（4）分散使得本发明的脂质体滴眼液达到纳米级，可以有效的穿过泪膜屏障到达角膜等眼表组织，引起免疫反应，迅速彻底清除病毒；2)_本发明中脂质体的材料为磷脂、胆固醇、神经节苷脂，其中磷脂为细胞膜的主要成分，胆固醇和神经节苷脂均为人体天然成分，本发明的主要成分易于吸收，无毒无刺激性具有良好的生物相容性，对眼表无损害。且本发明将病原体抗原物质hsv-1 gd包裹于脂质体中，有利于巨噬细胞吞噬，促进了免疫反应的产生；3)_本发明中脂质体滴眼液首次采用了免疫治疗方法，通过生物来源的神经节苷脂，良好地靶向cd169阳性巨噬细胞，特异性递呈hsv-1抗原gd，促进固有免疫和适应性免疫更迅速地清除病毒，治疗hsk；所选择神经节苷脂gm1是良好的靶向cd169阳性巨噬细胞的配体。
附图说明
18.图1为本发明实施例1-3的制备流程图；图2为本发明实施例3的透射电镜图像；图3为本发明实施例1-3的平均粒径、电荷和分散性指数；图4为本发明实施例6的靶向脂质体滴眼液抑制单纯疱疹病毒性角膜炎小鼠角膜病毒复制示意图；图5为本发明实施例7靶向脂质体滴眼液抑制单纯疱疹病毒性角膜炎小鼠三叉神经节病毒潜伏示意图。
实施方式
19.下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
20.治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液以质量份数计，每1份重组hsv-1 gd蛋白对应其他原料的质量份数分别为：二硬脂酰磷脂酰胆碱为70份；所述胆固醇为15份；所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺为5份；所述神经节苷脂gm1为10份；pbs缓冲液为6ml。
21.参照图1所示，一种靶向巨噬细胞脂质体滴眼液的制备方法，其步骤以下包括：配置器具的准备：配置时使用的烧瓶等使用灭菌锅灭菌；溶解脂质材料：将上述组分的二硬脂酰磷脂酰胆碱 63mg、胆固醇 13.5mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 4.5mg、神经节苷脂gm1 9mg加入烧瓶中，以20ml氯仿-甲醇混合溶液（2：1, v：v）充分溶解，得到混合溶液；
蒸馏：使用旋转蒸发仪蒸馏，当溶剂完全蒸发，脂质材料混合物形成一层薄膜附着于烧瓶表面时，蒸馏结束；水合：向烧瓶中加入6ml的pbs缓冲液，同时加入重组hsv-1 gd蛋白 10μg，利用超声波清洗仪震荡，使脂质膜充分重悬，形成脂质体pbs溶液；样品分散：脂质体pbs溶液放置于超声细胞破碎仪中震荡分散2min，超声工作2s，间隔3s，功率270w，循环3次充分分散脂质体，得到治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液。将滴眼液分装，4℃保存。
实施例
22.治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液以质量份数计，每1份重组hsv-1 gd蛋白对应其他原料的质量份数分别为：二硬脂酰磷脂酰胆碱为50份；所述胆固醇为20份；所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺为10份；所述神经节苷脂gm1为20份；pbs缓冲液为8ml。
23.参照图1所示，所述治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液，制备方法包括以下步骤：配置器具的准备：配置时使用的烧瓶等使用灭菌锅灭菌；溶解脂质材料：将上述组分的二硬脂酰磷脂酰胆碱 48mg、胆固醇 19mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 9mg、神经节苷脂gm1 19mg加入烧瓶中，以10ml氯仿-甲醇混合溶液（2：1, v：v）充分溶解，得到混合溶液；蒸馏：使用旋转蒸发仪蒸馏，当溶剂完全蒸发，脂质材料混合物形成一层薄膜附着于烧瓶表面时，蒸馏结束；水合：向烧瓶中加入8ml的pbs缓冲液，同时加入病原体抗原物质hsv-1 gd 10μg，利用超声波清洗仪震荡，使脂质膜充分重悬，形成脂质体pbs溶液；样品分散：脂质体pbs溶液放置于超声细胞破碎仪中震荡分散2min，超声工作2s，间隔3s，功率270w，循环3次充分分散脂质体，得到治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液。将滴眼液分装，4℃保存。
实施例
24.治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液以质量份数计，每1份重组hsv-1 gd蛋白对应其他原料的质量份数分别为:二硬脂酰磷脂酰胆碱为63份；所述胆固醇为19份；所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺为6份；所述神经节苷脂gm1为12份。pbs缓冲液为5ml。一种靶向巨噬细胞脂质体滴眼液的制备方法，其步骤以下包括：参照图1所示，配置器具的准备：配置时使用的烧瓶等使用灭菌锅灭菌；溶解脂质材料：将上述组分的二硬脂酰磷脂酰胆碱 55mg、胆固醇 17mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 5mg、神经节苷脂gm1 10mg加入烧瓶中，以15ml氯仿-甲醇混合溶液（2：1, v：v）充分溶解，得到混合溶液；蒸馏：使用旋转蒸发仪蒸馏，当溶剂完全蒸发，脂质材料混合物形成一层薄膜附着于烧瓶表面时，蒸馏结束；水合：向烧瓶中加入5ml的pbs缓冲液，同时加入病原体抗原物质hsv-1 gd 10μg，
利用超声波清洗仪震荡，使脂质膜充分重悬，形成脂质体pbs溶液；样品分散：脂质体pbs溶液放置于超声细胞破碎仪中震荡分散2min，超声工作2s，间隔3s，功率270w，循环3次充分分散脂质体，得到治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液。将滴眼液分装，4℃保存。
实施例
25.实施例3的治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液的物理形态观察。
26.1.将样品取出10μl；2.吸取样品10μl滴加于铜网上沉淀1分钟，滤纸吸去浮液；3.磷钨酸10μl滴加于铜网上沉淀1分钟，滤纸吸去浮液；4.常温干燥3-5分钟；5.80-120 kv进行透射电子显微镜镜（jem-1400 plus, jeol, 日本）检测成像。
27.结果参照图2所示，图像显示本滴眼液中的脂质体形状大致为球形纳米结构。
实施例
28.脂质体的粒径、电荷和分散性指数的测定。
29.分别吸取实施1~3中的滴眼液50μl，加入比色皿，补充pbs缓冲液至4ml，然后将比色皿放入nanobrook 90plus zeta粒径分析仪的样品池中，使用动态光散射测定实施1~3的平均粒径、分散性指数(pdi)和zeta电位。结果如图3所示。
实施例
30.参照图4所示，小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型构建：使用30号针头在小鼠角膜水平垂直方向各做5次划痕，然后滴入5μl的hsv-1（mckrae, 1
ꢀ×ꢀ
106pfu/ml）分组及治疗情况：选取10只c57bl/6小鼠构建单纯疱疹病毒性角膜炎模型，为排除小鼠的个体差异对治疗效果的影响，统一选取右侧角膜造模。将小鼠分为2组实验组和空白对照组，实验组滴加实施例2中制备的滴眼液，空白对照组滴加pbs缓冲液。接种病毒前第15天，第10天，第5天滴入治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液。每天滴入4次，每次滴5μl。
31.于感染第3天取角膜进行qrt-pcr检测感染病毒基因表达，显示实验组hsv-1 gb水平明显下降。
实施例
32.参照图5所示，小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型构建：使用30号针头在小鼠角膜水平垂直方向各做5次划痕，然后滴入5μl的hsv-1（mckrae, 1
ꢀ×ꢀ
106pfu/ml）分组及治疗情况：选取10只c57bl/6小鼠构建单纯疱疹病毒性角膜炎模型，为排除小鼠的个体差异对治疗效果的影响，统一选取右侧角膜造模。将小鼠分为2组实验组和空白对照组，实验组滴加实施例3中制备的滴眼液，空白对照组滴加pbs缓冲液。接种病毒前第15天，第10天，第5天滴入治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液。每天滴入4次，每次滴5μl。
33.于感染第5天取三叉神经节进行qrt-pcr检测感染病毒基因表达，显示实验组hsv-1 gb水平明显下降。
34.需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

技术特征：
1.一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液，其特征在于，包括病原体抗原物质、靶向巨噬细胞的配体和脂质体辅料和磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液），所述病原体抗原物质为重组hsv-1 gd蛋白，所述靶向巨噬细胞的配体为神经节苷脂gm1，所述脂质体辅料包括二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中的任意一种或多种。2.如权利要求1所述的一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液，其特征在于，以质量份数计，每1份重组hsv-1 gd蛋白对应其他原料的质量份数分别为：二硬脂酰磷脂酰胆碱为50-70份，所述胆固醇为15-20份，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺为5-10份，所述神经节苷脂gm1为10-15份；所述磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液）为5-10ml。3.如权利要求2所述的一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液，其特征在于，以质量份数计，每1份重组hsv-1 gd蛋白对应其他原料的质量份数分别优选为：二硬脂酰磷脂酰胆碱为63份；所述胆固醇为19份；所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺为6份；所述神经节苷脂gm1为12份；所述磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液）为5ml。4.如权利要求1～3任一项所述的一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤（1）溶解脂质材料：将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、神经节苷脂gm1为原料加入烧瓶中，以10-20ml氯仿-甲醇混合溶液作为溶剂搅拌10分钟充分溶解，得到混合溶液；步骤（2）蒸馏：使用旋转蒸发仪蒸馏步骤（1）所得混合溶液，当溶剂完全蒸发，脂质材料混合物形成一层薄膜附着于烧瓶表面时，蒸馏结束，得到脂质膜；步骤（3）水合：向烧瓶中加入5-10ml磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液）同时加入重组hsv-1 gd蛋白，利用超声波清洗仪震荡5分钟，使步骤（2）中所得脂质膜充分重悬，形成脂质体pbs溶液；步骤（4）分散：将步骤（3）中所得脂质体pbs溶液放置于超声细胞破碎仪中震荡分散2min，超声工作2s，间隔3s，功率270w，循环3次充分分散脂质体pbs溶液，得到治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液。5.如权利要求4所述的一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述氯仿-甲醇混合溶液的体积比为氯仿：甲醇=2：1。6.如权利要求4所述的一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述得到治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液，分装后，4℃保存。7.一种如权利要求1-7任一项所述的一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液及其制备方法在制备抗单纯疱疹病毒性角膜炎药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液及其制备方法，以质量份数计，具体制备方法为：将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、神经节苷脂GM1加入烧瓶中，以氯仿-甲醇混合溶液溶解；蒸发溶剂得到脂质膜；加入磷酸盐缓冲液，同时加入重组HSV-1 gD蛋白，利用超声波清洗仪震荡，形成脂质体PBS溶液；于超声细胞破碎仪中震荡分散，得到治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的靶向脂质体滴眼液；本发明相比现有的其他脂质体类药物需静脉注射或结膜下注射，本品只需滴眼使用更加方便，提高了患者的依从性；纳米级的药物递送系统，有效的穿过泪膜屏障到达角膜等眼表组织，引起免疫反应，迅速彻底清除病毒。迅速彻底清除病毒。迅速彻底清除病毒。


技术研发人员：胡凯 沈文昊 王晨晨
受保护的技术使用者：南京鼓楼医院
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/8/14