一种适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的HPLC分析方法与流程

一种适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法
技术领域
1.本发明属于分析化学领域，具体涉及一种适用于金丝桃苷和槲皮素体系的高效液相色谱法(hplc)分析方法。


背景技术：

2.金丝桃苷，又名槲皮素-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷。属于黄酮醇苷类化合物，具有易溶于乙醇、甲醇、丙酮和吡啶，通常条件下稳定的性质。金丝桃苷分布广泛，广泛存在于各种植物体内，如金丝桃科、蔷薇科、桔梗科、唇形科、杜鹃花科、葵科、藤黄科、豆科以及卫矛科等的果实与全草中。具有抗炎、解痉、利尿、止咳、降压、降低胆固醇、蛋白同化、局部和中枢镇疼以及对心、脑血管的保护作用等多种生理活性，是一种重要的天然产物。近年来，将金丝桃苷开发用于治疗抑郁、乙肝等疾病已成为国内外研究的热点。
3.槲皮素，又名栎精，槲皮黄素，溶于冰醋酸，碱性水溶液呈黄色，几乎不溶于水。可作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用。可用于治疗慢性支气管炎。对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。因具有金属螯合作用可作为油脂、抗坏血酸的抗氧化剂。因为槲皮素广泛存在于植物中，来源广泛，价格低廉，并具有上述功效，可作为药物的同时，也可作为替代抗生素的绿色饲料添加剂应用于畜牧生产。
4.在生物合成法合成金丝桃苷过程中，槲皮素是其前体物质，所以在检测金丝桃苷时同时会有槲皮素的存在，槲皮素会影响金丝桃苷的检测。现有技术中，有很多关于单一种物质分析方法的报道，但鲜有关于两种物质同时分析的方法报道。现有技术文献《hplc法同时测定莲房中金丝桃苷和槲皮素的含量》中采用80％甲醇溶解并配合超声波溶解样品，然后采用甲醇：乙腈：0.01mol/l磷酸＝35：10：55的流动相进行洗脱。利用此方法6min左右将金丝桃苷洗脱下来，15min左右将槲皮素洗脱下来。整个分析程序为30min。此方法金丝桃苷在0.05028～0.5531μg呈线性，槲皮素在0.04244～0.4668μg呈线性。由此可见，现有技术中的hplc分析方法，分析过程繁琐，分析程序时间过长，使用多种有机溶剂，给后续环保处理带来困难。
5.因此，亟待研究探寻一种更加高效的hplc分析方法，对金丝桃苷和槲皮素体系具有普适性，不仅可以简化分析过程，缩短分析时间，提高分析效率，而且还可以为未知浓度样品中金丝桃苷和槲皮素的含量测定提供更加准确、测量范围更宽的标准曲线，进而可以实现连续地对多个未知浓度样品中金丝桃苷和槲皮素的含量进行定量。


技术实现要素：

6.发明要解决的问题
7.针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一是将金丝桃苷和槲皮素分析用色谱柱与肽类分析用色谱柱统一，解决对肽类和金丝桃苷及槲皮素样品连续进行分析测定时，需要更换色谱柱而造成时间成本上浪费的问题。
8.本发明的又一目的是解决无需填加峰形改善剂，如酸类及盐类实现对金丝桃苷和槲皮素分析的问题。
9.本发明的再一目的是解决同一体系下对金丝桃苷和槲皮素样品连续进行hplc方法分析的同时，能够同时对二者进行准确定量的问题。
10.本发明的又一目的是解决采用常规使用的流动相并采用二元泵实现将金丝桃苷和槲皮素完全分离的同时缩短分析时间的问题。
11.本发明的再一目的是解决因为现有技术中金丝桃苷和槲皮素可测定的浓度范围窄而需对样品进行稀释所带来的误差大的问题。
12.此外，本发明的再一目的是解决现有技术中由于分析时间长导致生产效率低的问题。
13.用于解决问题的方案
14.本发明涉及：
15.1、一种适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：
16.第一步：设定液相色谱条件；
17.第二步：配制分析用流动相，其中；流动相a为超纯水；流动相b为甲醇；
18.第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相a：20～40％，流动相b：60～80％，流速：0.5～2ml/min；
19.第四步：配制多个含金丝桃苷和槲皮素样品的待测溶液，所述金丝桃苷和槲皮素样品为包含金丝桃苷和槲皮素中的一种或两种成分的样品；
20.第五步：采用所述分析程序对其中一个待测金丝桃苷和槲皮素样品的溶液进行测定，记录色谱图；
21.第六步：任选地根据各自对应的标准曲线计算金丝桃苷和槲皮素的含量；
22.第七步：采用流动相b清洗色谱柱1～5min；
23.第八步：重复第五步至第七步，对其他未测的待测金丝桃苷和槲皮素样品依次进行测定。
24.2、根据项目1所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：所述标准曲线通过配制同一体系下的金丝桃苷和槲皮素的标准溶液，并采用所述液相色谱条件进行测定而建立。
25.3、根据项目1或2所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：所述待测金丝桃苷和槲皮素样品的浓度为0.01～1.0g/l。
26.4、根据项目1或2所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：检测波长范围为300～400nm。
27.5、根据项目1或2所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：色谱柱为填料为c18的色谱柱。
28.6、根据项目1或2所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：色谱柱柱温为室温，进样量为5～10μl，进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为4～6min。
29.7、根据项目3所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：所述待测金丝桃苷和槲皮素样品的浓度为0.1～1.0mg/ml。
30.发明的效果
31.本发明发现了一种新的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其不但可以实现对金丝桃苷样品和槲皮素样品的连续分析测定，也可以实现对同时含有金丝桃苷和槲皮素的样品进行分析测定，且色谱峰峰形呈正态分布的同时，理论塔板数很可观；其次，本发明的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，可以实现5分钟内同时对金丝桃苷和槲皮素进行定性和定量分析。并且利用此方法对不同浓度的金丝桃苷和槲皮素混合样品同时进行分析，两种物质互不干扰，二者均可以得到很好的线性。
32.本发明的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法操作简单，可以实现连续分析测定金丝桃苷和槲皮素的同时，节约大量的时间成本和经济成本，大大简化了操作的复杂性。该技术不仅能够节省时间，分析所用的流动相为此行业常用成分，同时将此发明所用的色谱柱与本公司其他肽类分析所用色谱柱统一，使得在进行不同物质分析切换时无需人为地更换色谱柱，仅需更换流动相再对其清洗即可。从而使得利用此方法更利于全程自动化的实现。
附图说明
33.图1为实施例1中的相同浓度的金丝桃苷和槲皮素各浓度(浓度分别为0.01g/l、0.025g/l、0.05g/l、0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l、0.8g/l、1.0g/l)标准溶液的hplc图。
34.图2为实施例1中的相同浓度的金丝桃苷和槲皮素样品各浓度(浓度分别为0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/l)的峰面积-浓度线性关系图。
35.图3为实施例1中的相同浓度的金丝桃苷和槲皮素样品各浓度(浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0g/l)的峰面积-浓度线性关系图。
36.图4为实施例2中的金丝桃苷(0.5g/l)和槲皮素(0.5g/l)混合物的hplc图。
37.图5为实施例3中0.5g/l金丝桃苷的hplc图。
38.图6为实施例4中0.5g/l槲皮素的hplc图。
39.图7为实施例5中的金丝桃苷(0.5g/l)和槲皮素(0.5g/l)混合物的hplc图。
40.图8为比较例1中的金丝桃苷(0.5g/l)和槲皮素(0.5g/l)混合物的hplc图。
41.图9为比较例2中的金丝桃苷(0.5g/l)和槲皮素(0.5g/l)混合物的hplc图。
42.图10为比较例3中的金丝桃苷(0.5g/l)和槲皮素(0.5g/l)混合物的hplc图。
43.图11为比较例4中的金丝桃苷(0.5g/l)和槲皮素(0.5g/l)混合物的hplc图。
44.图12为比较例5中的金丝桃苷(0.5g/l)和槲皮素(0.5g/l)混合物的hplc图。
具体实施方式
45.本发明的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法包括以下步骤：
46.第一步：设定液相色谱条件；
47.第二步：配制分析用流动相，其中；流动相a为超纯水；流动相b为甲醇；
48.第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相a：20～40％，流动相b：60～80％，流速：0.5～2ml/min；
49.第四步：配制多个含金丝桃苷和槲皮素样品的待测溶液，所述金丝桃苷和槲皮素样品为包含金丝桃苷和槲皮素中的一种或两种成分的样品；
50.第五步：采用所述分析程序对其中一个待测金丝桃苷和槲皮素样品的溶液进行测定，记录色谱图；
51.第六步：任选地根据各自对应标准曲线计算金丝桃苷和槲皮素的含量；
52.第七步：采用流动相b清洗色谱柱1～5min；
53.第八步：重复第五步至第七步，对其他未测的待测金丝桃苷和槲皮素样品依次进行测定。
54.上述标准曲线通过配制不同浓度金丝桃苷和槲皮素的混合标准溶液，并采用上述hplc色谱条件进行测定，依据浓度和峰面积的线性关系而建立。
55.流动相为:流动相a为超纯水；流动相b为甲醇。分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相a：20～40％，流动相b：60～80％，优选流动相a：25～35％，流动相b：65～75％，更优选流动相a：30％，流动相b：70％。选择该范围能够获得最好的分析效果。流动相流速为0.5～2ml/min，优选1ml/min。流速选择很关键，提高流速可以缩短分析时间，然而本发明中金丝桃苷和槲皮素两种物质性质很接近，如果流速过快会使两种物质分不开，从而无法精确计算各自的浓度；流速过慢，会导致色谱峰峰宽加大，影响分析精度。同时为使两种目标物的峰能够完全显现，其浓度不宜过高，否则会导致目标峰封顶，从而即使在峰顶处有杂峰出现也无法判断；但浓度也不能太低，否则当有杂峰出现时，由于峰高过低会被误判断为基线不平所致。所以待测金丝桃苷和槲皮素样品的浓度在其线性范围内，即0.01～1.0g/l之间时，不仅可以实现对各物质的定性还可依据各自标准曲线实现对每种物质的准确定量。
56.所述待测金丝桃苷和槲皮素样品依照如下方法进行配制：例如，配制1.0g/l的样品时，先分别准确称取2.0mg金丝桃苷和槲皮素，将二者分别置于不同的离心管中，分别加入甲醇溶解并定容至1ml，即得浓度均为2.0g/l的金丝桃苷和槲皮素样品的母液。再分别吸取两种母液各500μl置于同一离心管中，即得两种物质浓度均为1.0g/l的混合溶液。
57.检测波长由待测的物质本身性质所决定，不受分析条件影响。经对两种物质进行全波长扫描，确定检测波长优选范围为300～400nm，更优选340～380nm，特别优选360nm。原因是：依据对金丝桃苷和槲皮素溶液的全波长扫描结果，显示二者均在360nm有较强的光吸收，故最优选360nm作为hplc分析的检测波长。
58.色谱柱为常规使用的色谱柱，优选填料为十八烷基硅烷键合相的色谱柱，例如依利特sin℃hrom ods-ap
59.流速一般设定为0.5～2ml/min，优选1ml/min。
60.色谱柱柱温为室温(通常为25℃)。
61.进样量为3～10μl，优选5μl。
62.进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为3～6min，优选5min。
63.下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。
64.以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。但是，应理解，这些实施例仅仅是示例性的，并不意图限制本发明。如无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原材料均为本领域常用的原材料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
65.实施例
66.实施例1.金丝桃苷和槲皮素的分析
67.仪器与条件：
68.采用agilent1260infinityii lc高效液相色谱仪及openlabcds2软件系统；以依利特sinochrom ods-ap(250
×
4.6mm)为分析柱，柱温25℃；检测波长为360nm。
69.实验步骤：
70.准确称取金丝桃苷和槲皮素标准品各2mg，混合置于离心管中，用甲醇定量至1ml，即得金丝桃苷和槲皮素的浓度分别为2g/l的母液。流动相：a：超纯水；b:甲醇。
71.洗脱浓度：a相30％；b相70％。
72.流速：1.0ml/min
73.温度:25℃
74.进样量：5μl
75.分析程序：采用上述洗脱浓度对样品进行等度洗脱。
76.以上述实验步骤中配制的2g/l母液为基础，准确吸取5μl、12.5μl、25μl、50μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl分别置于洁净的离心管中，对应的分别加入甲醇补充至1ml。即得金丝桃苷和槲皮素的浓度分别为0.01g/l、0.025g/l、0.05g/l、0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l、0.8g/l、1.0g/l的一系列标准溶液。
77.按照上述方法对上述标准溶液分别进行测定，记录色谱图，如图1所示。
78.此外，分别对各浓度的金丝桃苷和槲皮素谱图进行积分，得到对应浓度下的峰面积，分别绘制金丝桃苷和槲皮素的浓度和吸收峰峰面积的标准曲线，结果如图2所示，金丝桃苷和槲皮素浓度在0.01～1.0g/l时与对应峰面积呈线性关系。
79.金丝桃苷的浓度-峰面积线性回归方程如下所示：
80.y1＝a x+b
81.其中：y1：峰面积
82.x:金丝桃苷浓度
83.a:15949.06611
84.b:-26.19737
85.r2:0.99693
86.槲皮素的浓度-峰面积线性回归方程如下所示：
87.y
α
＝a x+b
88.其中：y
α
：峰面积
89.x:槲皮素浓度
90.a:9230.44497
91.b:15.18095
92.r2:0.99352
93.各浓度的金丝桃苷和槲皮素的保留时间和理论塔板数如下表所示：
[0094][0095][0096]
由上表可知，金丝桃苷和槲皮素浓度小于0.05g/l时峰面积与浓度关系虽然呈线性但分析误差较大，这里面误差包括样品配制时产生的操作误差和分析时产生的测量误差。显而易见，配制样品的浓度越低操作误差会越大。
[0097]
当金丝桃苷和槲皮素浓度范围均在0.1～1g/l时线性更好，且误差均小于10％，如图3所示。此时金丝桃苷的浓度-峰面积线性回归方程如下所示：
[0098]
y2＝a x+b
[0099]
其中：y2：峰面积
[0100]
x:金丝桃苷浓度
[0101]
a:5930.87223
[0102]
b:-85.32494
[0103]
r2:0.99982
[0104]
槲皮素的浓度-峰面积线性回归方程如下所示：
[0105]yβ
＝a x+b
[0106]
其中：y
β
：峰面积
[0107]
x:槲皮素浓度
[0108]
a:9064.11965
[0109]
b:17.27113
[0110]
r2:0.99412
[0111]
两种浓度范围下金丝桃苷和槲皮素的检测浓度及误差比较如下表所示：
[0112][0113][0114]
实施例2.金丝桃苷和槲皮素的线性关系验证
[0115]
在分析完实施例1样品之后，将色谱柱采用甲醇清洗5min。
[0116]
除了采用0.5g/l金丝桃苷和0.5g/l槲皮素的混合溶液之外，以与实施例1相同的方式对金丝桃苷和槲皮素进行hplc分析，其色谱图如图4所示。将金丝桃苷的峰面积分别代入标准曲线y1及y2，计算得到的浓度分别为：0.4948g/l和0.5011g/l，误差分别为1.04％和0.22％；将槲皮素的峰面积分别代入标准曲线y
α
和y
β
，计算得到的浓度分别为：0.4950g/l和0.5041g/l，误差分别为：1％和0.82％。所以每种物质的不同浓度区间的标准曲线准确性均较高，都适用于以此来对未知浓度的样品进行浓度计算。
[0117]
实施例3.0.5g/l金丝桃苷线性关系验证
[0118]
在分析完实施例1样品之后，将色谱柱采用甲醇清洗5min。
[0119]
准确吸取实施例1中的金丝桃苷母液250μl，用甲醇补充体积至1ml即得到浓度为0.5g/l的金丝桃苷溶液。以与实施例1相同的方式对金丝桃苷溶液进行hplc分析，其色谱图如图5所示。将其峰面积分别代入标准曲线y1及y2，计算得到的浓度分别为0.512和0.5235g/l，误差为2.4％和4.7％。
[0120]
实施例4.0.5g/l槲皮素线性关系验证
[0121]
在分析完实施例1样品之后，将色谱柱采用甲醇清洗5min。
[0122]
准确吸取实施例1中的槲皮素母液250μl，用甲醇补充体积至1ml即得到浓度为0.5g/l的槲皮素溶液。以与实施例1相同的方式对槲皮素溶液进行hplc分析，其色谱图如图6所示。将其峰面积分别代入标准曲线y
α
和y
β
，计算得到的浓度分别为0.527g/l和0.5367g/l，误差为5.4％和7.3％。
[0123]
实施例5.0.5g/l金丝桃苷和1g/l槲皮素混合溶液线性关系验证
[0124]
在分析完实施例1样品之后，将色谱柱采用甲醇清洗5min。
[0125]
准确吸取实施例1中的金丝桃苷母液250μl，槲皮素母液500μl加入同一离心管中，用甲醇补充体积至1ml，即得到浓度为0.5g/l的金丝桃苷和浓度为1.0g/l槲皮素的混合溶液。以与实施例1相同的方式对此混合溶液进行hplc分析，其色谱图如图7所示。对两种物质分别进行积分后得到各自的峰面积，将金丝桃苷的峰面积代入对应的标准曲线y1及y2，计算得到的金丝桃苷浓度分别为0.505g/l和0.5172g/l，误差为1.0％和3.4％；将槲皮素的峰面积分别代入对应的标准曲线y
α
和y
β
,计算得到的槲皮素浓度分别浓度为1.046g/l和1.0646g/l，误差为4.6％和6.5％。
[0126]
比较例1.
[0127]
将流动相中水的比例由30％降为10％，对应的将甲醇比例由70％提升至90％，对实施例2中浓度分别为0.5g/l的金丝桃苷和槲皮素混合样品进行分析测定，结果如图8所示，金丝桃苷与槲皮素的色谱峰连结到一起，分离失败。
[0128]
比较例2.
[0129]
除了将流动相中甲醇换为乙腈之外，以与实施例2相同的方式对0.5g/l的金丝桃苷和0.5g/l的槲皮素混合样品进行分析测定，结果如图9所示，相较于实施例1，二者的色谱峰仍然连结在一起，且各自的峰都出现不同程度的变形从而无法进行谱图分析。
[0130]
比较例3.
[0131]
除了将流动相中的水换为0.07％的磷酸水溶液之外，以与实施例2相同的方式对0.5g/l的金丝桃苷和0.5g/l的槲皮素混合样品进行分析测定，结果如图10所示，由图10和图4的比较可知，流动相中加入磷酸仍然可以实现对金丝桃苷和槲皮素混合体系的分析，但分析效果与本发明的方法相差无几。
[0132]
比较例4.
[0133]
除了将流动相中的水换为0.02m的磷酸盐水溶液之外，以与实施例2相同的方式对0.5g/l的金丝桃苷和0.5g/l的槲皮素混合样品进行分析测定，结果如图11所示，由图11和图4的比较结果可知，流动相中添加盐仍然能够对金丝桃苷和槲皮素混合体系进行分析，但分析效果较本发明的方法没有明显的提升。
[0134]
比较例5.
[0135]
除了将流动相中水的比例提升至80％，相应的甲醇比例降低至20％之外，以与实施例2相同的方式对0.5g/l的金丝桃苷和0.5g/l的槲皮素混合样品进行分析测定，结果如图12所示，由图12可知，没有检测到任何物质。分析其原因为两种物质均为非水溶性物质，当采用高比例水相进行洗脱时并不能将二者洗脱因此未被检测到。
[0136]
本发明经实验验证，采用100％甲醇可以将样品完全溶解，无需借助超声波来助溶。采用流动相为甲醇：水＝70：30来进行洗脱，利用本发明的方法3.4min左右将金丝桃苷洗脱下来，3.9min左右将槲皮素洗脱下来。整个分析程序为5min。并且利用本发明的分析方法，金丝桃苷和槲皮素分别在0.01～1g/l呈线性，但在0.1～1g/l线性范围内误差更小，均在10％以下。由此可见，本发明无论从流动相配比上还是分析时间上均优于现有的参考文献。此外按照本发明的色谱条件连续对实施例1进行高效液相色谱分析时，在测样的过程中，该流动相配比可以近乎无残留的将金丝桃苷和槲皮素全部洗脱。
[0137]
另外，在现有技术中的流动相需要事先进行配比且流动相需要采用高比例有机相配合高比例磷酸才能将其洗脱，而且必须要有三元泵才能够实现分析。而本发明无需进行事前的流动相准备工作，流动相组成更简单，只要具备二元泵即可实现分析，更易于操作。同时此发明将分析用色谱柱与本公司大多数物质分析用色谱柱统一，更利于实现自动分析，节省由于更换色谱柱造成的时间成本和人力成本。并且本发明方法较现有技术文献《hplc法同时测定莲房中金丝桃苷和槲皮素的含量》中的分析时间缩短至该技术文献的1/3.5，该现有技术文献的方法分析时间至少需要17.5min，而本发明仅需5min，这在工业生产上将产生巨大的意义。
[0138]
综上可知，本发明的适用于金丝桃苷和槲皮素的hplc分析方法可以将体系中的两种物质成功分离并能够形成稳定呈线性的标准曲线，可以准确的计算体系中金丝桃苷的浓度，因此可对未知浓度的样品进行浓度标定。且此方法操作简单，此外还可以对单独的金丝桃苷和槲皮素进行连续分析，不仅可以节约大量的时间成本和经济成本，而且大大简化了操作的复杂性的同时有着很好的分析效果。
[0139]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：第一步：设定液相色谱条件；第二步：配制分析用流动相，其中；流动相a为超纯水；流动相b为甲醇；第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相a：20～40％，流动相b：60～80％，流速：0.5～2ml/min；第四步：配制多个含金丝桃苷和槲皮素样品的待测溶液，所述金丝桃苷和槲皮素样品为包含金丝桃苷和槲皮素中的一种或两种的样品；第五步：采用所述分析程序对其中一个待测金丝桃苷和槲皮素样品的溶液进行测定，记录色谱图；第六步：任选地根据标准曲线计算金丝桃苷和槲皮素的含量；第七步：采用流动相b清洗色谱柱1～5min；第八步：重复第五步至第七步，对其他未测的待测金丝桃苷和槲皮素样品依次进行测定。2.根据权利要求1所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：所述标准曲线通过分别配制金丝桃苷和槲皮素的标准溶液，并采用所述液相色谱条件进行测定而建立。3.根据权利要求1所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：所述待测金丝桃苷和槲皮素样品的浓度为0.01～1.0g/l。4.根据权利要求1或2所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：检测波长范围为300～400nm。5.根据权利要求1或2所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：色谱柱为填料为c18的色谱柱。6.根据权利要求1或2所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：色谱柱柱温为室温，进样量为5～10μl，进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为4～6min。7.根据权利要求3所述的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的hplc分析方法，其特征在于：所述金丝桃苷和槲皮素样品的浓度分别为为0.1～1g/l。

技术总结
本发明涉及一种适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的HPLC分析方法，其特征在于：第一步：设定液相色谱条件；第二步：配制分析用流动相，其中；流动相A为超纯水；流动相B为甲醇；第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：20～40％，流动相B：60～80％，流速：0.5～2mL/min；第四步：配制多个含金丝桃苷和槲皮素样品的待测溶液；等。本发明的适用于连续测定金丝桃苷和槲皮素体系的HPLC分析方法操作简单，连续测定金丝桃苷和槲皮素时，节约大量的时间成本和经济成本，大大简化了操作的复杂性，同时有着很好的分析效果。另外，能够对同时含有上述两种物质的样品进行测定并可以同时准确标定两种物质的浓度。准确标定两种物质的浓度。准确标定两种物质的浓度。


技术研发人员：王海梅 张志乾 王嘉鹏 吴奕瑞 王帆 朱家平 罗嘉雯
受保护的技术使用者：态创生物科技（广州）有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/13