一种从红景天中分离并纯化得到红景天苷的方法

1.本发明涉及中药材中有效成分提取的技术领域，更具体地说，它涉及一种从红景天中提取得到红景天苷的方法。


背景技术：

2.红景天又名蔷薇红景天、扫罗玛布尔，被西藏人民称为“高原人参”，是最近几十年才被重视的东方民间草药。该植物在《神农本草经》、《藏药本草》、《本草纲目》等都有记载，是继人参、刺五加之后所发展的又一种重要保健药源植物。可用其防治多种疾病，具有抗氧化、抗衰老、镇静催眠、增强机体免疫力、抗肿瘤、保护心脑神经系统、改善认知功能等药理作用。其中的主要功能性成分红景天苷及其苷元(对酪醇)是评定红景天的品质指标。
3.文献报道的提取红景天苷的方法有回流提取法、高压或超高压提取法、闪式提取法、微波提取法、超声提取法、超临界co2萃取法、酶解法(包括纤维素酶解法、生物酶解法)、以及多种技术联用的提取方法等。目前国内外对红景天苷的提取和工艺优化基本上还是采用普通加热提取的方法，该方法得率低，溶剂消耗大、回收困难且设备投资大；操作繁琐，耗时长，通常需要3小时以上。
4.超声辅助提取技术是近年来兴起的中药有效成分提取技术，利用其超声波的强振动、高加速度、强空化效应、强搅拌作用来缩短天然产物有效成分进入溶剂的时间，加快提取过程，提高提出率并有效避免高温对有效成分的破坏。文献详细介绍了超声辅助技术的技术原理及其在天然产物中的应用，为天然产物提取应用提供了理论支持。文献对于超声波辅助提取红景天苷的技术也有提及，如卢永昌等研究了乙醇提取红景天有效成分，并对影响因素进行分析比较；苏波等把超声和微波相结合协同提取红景天苷。超声辅助技术比起单一、传统的热回流方法提取率有一定程度的上升，是现代中药有效成分提取技术的研究热点。
5.深共熔溶剂(des)是一种新型绿色溶剂，主要由氢键受体和氢键供体两类化合物组成，具有廉价易得、难挥发、无毒、可生物降解等优点，是传统溶剂的良好替代品。本发明以氯化胆碱为氢键受体，丙三醇等为氢键供体，制备了一系列的des，并以其做溶剂，在超声辅助的条件下提取红景天中的红景天苷，同时运用box-behnken响应面法对该提取工艺进行优化，以期为红景天中红景天苷的快速高效提取开发出新工艺，同时为后期的红景天苷的性能研究提供参考。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的问题，本发明目的在于提供一种红景天苷的提取方法。
7.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
8.一种从红景天中分离得到红景天苷的方法，包括如下步骤：
9.(1)将红景天根或茎烘干后称重，粉碎机粉碎过200目筛，得到红景天粉末，装瓶备用。
10.(2)将红景天粉末加入深共熔溶剂中(料液比为1:20，深共熔溶剂的含水量为20～40％)，于室温下超声提取30～60min(超声频率为20khz，超声功率200w)，获得粗提液。
11.上述深共熔溶剂(deep eutectic solvents,des)为氯化胆碱作为氢键受体(hba)与氢键供体(hbd)按照摩尔比1:1或1:2混合制得，所述氢键供体为丙三醇、乙二醇、1,2-丙二醇、丙二酸或尿素。
12.优选地，当所述丙三醇、乙二醇、1,2-丙二醇、尿素分别作为氢键供体时，与氯化胆碱的摩尔比均为2:1；所述丙二酸作为氢键供体时，与氯化胆碱的摩尔比为1:1
13.上述des可通过以下两种方法制备获得：
14.方法a：将氯化胆碱加入氢键供体后获得的混合液于80℃水浴条件下搅拌，直至混合液中的固体完全溶解或获得透明澄清的液体产物。
15.方法b：将氯化胆碱加入氢键供体后获得的混合液进行超声水浴反应，超声频率20～35khz，超声功率1000w，温度50℃，反应时间1h；之后进行电磁搅拌，搅拌温度50℃，搅拌速度500rpm，搅拌时间1h；循环进行上述超声水浴和电磁搅拌处理，直至混合液中的固体完全溶解或获得透明澄清的液体产物。
16.具体以较优的方法b做进一步说明：称取氯化胆碱(或其他生物碱氢键受体)和丙三醇(或其他有机酸、醇类氢键供体)依摩尔比例(1:1或1:2)加入样品瓶中混合均匀，采用水浴加热和超声辅助法，将hba和hbd按摩尔比例混合后于超声水浴中反应，超声频率20～35khz，超声功率1000w，温度50℃，反应时间1h；之后进行电磁搅拌，搅拌温度50℃，搅拌速度500rpm，搅拌时间1h；循环进行上述超声水浴和电磁搅拌处理，直至形成透明澄清的des产物。
17.以hba和hbd按摩尔比例摩尔比例1:2为例，所称取的氯化胆碱(hba)和丙三醇(hbd)的质量比为13.962:18.418；氯化胆碱(hba)与1,2-丙二醇(hbd)的质量比为13.963:15.218；氯化胆碱(hba)与尿素(hbd)的质量比为13.963:12.012。
18.(3)将粗提液以10000r min
–1离心5min(离心半径为6.36cm)，取上清液于容量瓶中，用18％甲醇定容，定容后的液体经0.45μm的微孔过滤器过滤得到红景天苷提取液。
19.进一步地，在上述步骤3之后，还包括步骤4：采用柱层析对步骤3获得的红景天苷提取液进行纯化。
20.进一步地，上述柱层析处理采用ab-18型大孔吸附树脂，以乙酸乙酯-石油醚混合液为流动相。
21.本发明还进行下述对照试验：
22.使用上述制备得到的des以及水、乙醇作为提取溶剂，进行红景天苷提取液的制备，其中水和乙醇作为对照组进行实验研究。取红景天粉末，分成平均几份，每份进行称重。各取一份红景天，加入一定比例的提取溶剂，利用超声波谱仪设置超声功率、提取温度以及超声时间，对红景天进行提取。
23.其中，使用本发明制备的des进行红景天苷提取液的制备：用氯化胆碱和丙三醇配制des提取液，提取液中含水量为20％。提取的具体操作步骤为：称取红景天粉末1.0g于具塞锥形瓶中，按照20:1的液料比加入含水量20％的des，室温条件下超声(200w，20khz)提取60min后，移取提取液2ml，10000r min
–1离心5min(离心半径为6.36cm)，取上清液1ml于5ml量瓶中，用18％甲醇定容，0.45μm微孔过滤器过滤得红景天苷提取液。
24.红景天苷纯化：以0.5％的碱性缓冲溶液和0.75％的碱性缓冲溶液进行梯度洗脱，所述碱性缓冲溶液的ph值为9～11，所述碱性缓冲溶液由磷酸钠盐配制。
25.在上述从红景天中分离得到红景天苷的方法中，作为一种优选实施方式，步骤1中红景天的选取选择大花红景天，产地为西藏地区，此地区的红景天所富含丰富的红景天苷等有效药理作用活性成分。
26.在上述从红景天中分离得到红景天苷的方法中，作为一种优选实施方式，步骤2中des的合成是利用超声辅助合成法合成，其中共有多种配方在调整摩尔比之后，获得了常温下稳定存在的des，可以发现其中含有苯环的酚酸，结构稳定，且空间位阻较大，均不形成液态稳定des。对于空间位阻较小的醇类及结构较为简单的尿素和丙三醇，更易获得常温下稳定存在的des，这对于后期合成新型des具有较大的借鉴意义。
27.在上述从红景天中分离得到红景天苷的方法中，作为一种优选实施方式，步骤2中制备不同含水量的des，需在氯化胆碱-丙三醇制备的des溶液中分别加入不同数量的超纯水，让体系的含水量为20％、30％、40％。用乙醇作提取剂时，使用60％、70％、80％、无水乙醇对红景天进行提取；纯水提取时不需要加入其他试剂；乙醇与水均作为对照使用。
28.在上述从红景天中分离得到红景天苷的方法中，作为一种优选实施方式，步骤2中液料比的升高使物料与溶剂接触更加充分，促进了红景天苷的溶出，有助于提取率升高，但是过多的提取溶剂削弱了超声波的能量，使超声波不能有效地破坏植物细胞壁。
29.在上述从红景天中分离得到红景天苷的方法中，作为一种优选实施方式，步骤4的纯化操作中，本发明选用在特定酸性条件下将红景天苷吸附在树脂上，以使其与极性较强物质以及色素、酸性沉淀的杂质分离。将吸附红景天苷的树脂用纯净水冲洗后，再在特定碱性条件下进行解吸，从而将极性较弱的杂质和部分色素留在树脂上，实现红景天苷有效的纯化，使产品纯度大幅提高。
30.本发明提取红景天苷的原理如下：深共熔溶剂(deep eutectic solvents,des)一种由氢键受体和氢键供体通过氢键而相互连接在一起的低熔点混合物，深共熔溶剂通过氢键相互连接在一起，导致氢键供体和氢键供体的离子或分子半径增大，如果离子所带电荷越少且离子的尺寸越大时，那么所需的能量就越低，最终导致熔点降低。des的熔点会显著低于原料的熔点。若氢键供体和受体，均来自于低毒或无毒的天然材料，则称之为天然深共熔溶剂。
31.des目前是创新尖端材料的一个重要工具，并一直为发展新的可持续、有效、经济和环境友好的进程作出重大贡献。des除了用于天然产物的提取之外，也应用于贵金属回收、材料掺杂、生物催化、药物递送等领域。在生物活性物质提取方面，用深共熔溶剂替代传统溶剂成为越来越普遍的做法。
32.通过实验发现，与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
33.深共熔溶剂因制备简单、毒性低、热稳定性好及生物降解性高，被认为是传统有毒有害有机溶剂和离子液体的潜在替代品。其良好的疏水性、高度可调的物理化学特性及其对有机和无机化合物的优异溶解能力可满足许多工业应用需求。深共熔溶剂通过静电作用、离子交换和氢键的协同作用实现了对目标物的高效分离、定向催化和改性。
34.为了最大限度地降低该提取方法的成本效益，增加其可持续性，本发明研究了没有任何预提取步骤的提取溶剂的可重复使用性。用新鲜des提取后，将固液混合物过滤，并
在不除去目标物的情况下重复使用溶剂，重新萃取目标物。在同等萃取条件下萃取后，利用高效液相色谱测定溶液中目标物的增量，从而判断des的可重复利用性。
35.以下通过具体实施例及对比例对本发明技术方案做进一步说明。
36.实施例1
37.(1)称取红景天粉末1.0g，装入具塞锥形瓶中备用。
38.(2)配置深共熔溶剂：氯化胆碱和丙三醇的摩尔比为1:2，称取14g氯化胆碱放入烧杯中，称量丙三醇时，在电子天平上先称量干净烧杯的质量，归零后称取18.5g丙三醇液体，将称量好的氯化胆碱加入丙三醇中进行搅拌。
39.(3)把配置好的氯化胆碱-丙三醇锥形瓶投入超声水浴中反应，超声频率20-35khz，超声功率1000w，超声温度50℃条件下超声1h。然后换为电磁搅拌，磁子搅拌温度50℃，搅拌速度500rpm，搅拌1h。如此用超声和电磁搅拌循环操作，直至形成透明澄清的深共熔溶剂des。
40.(4)将步骤(3)中的制备留用的des加入超纯水，在水浴超声中让水与des混合均匀，使其含水量达到30％，以此作为提取溶剂备用。
41.(5)步骤(1)中红景天粉末于具塞锥形瓶中，按照20:1的液料比加入含水量为30％的dess，室温条件下超声(200w，20khz)提取30min后，移取提取液待离心操作。
42.(6)在10000r
·
min
–1离心作用下离心5min(离心半径为6.36cm)，取上清液于容量瓶中，18％甲醇定容，0.45μm微孔过滤器滤过得红景天苷提取液。后续纯化为ab-18大孔树脂吸附纯化或者乙酸乙酯-石油醚(3:1，v/v)柱层析色谱进行纯化。未经纯化操作通过hplc检测所得红景天苷提取率为11.64mg
·g–1。
43.实施例2
44.(1)称取红景天粉末1.0g，装入具塞锥形瓶中备用。
45.(2)配置深共熔溶剂时，氯化胆碱和1,2-丙二醇的摩尔比为1:2，称取14g氯化胆碱放入烧杯中，称量1,2-丙二醇时，在电子天平上先称量干净烧杯的质量，归零后称取15.3g 1,2-丙二醇液体，将称量好的氯化胆碱加入1,2丙二醇中进行搅拌。
46.(3)把配置好的氯化胆碱-1,2-丙二醇投入超声水浴中反应，超声频率20-35khz，在超声功率1000w，超声温度50℃条件下超声1h。然后换为电磁搅拌，搅拌温度50℃，搅拌速度500rpm，搅拌1h。将超声反应和电磁搅拌反应循环使用，直至形成透明澄清的深共熔溶剂des，留用。
47.(4)向步骤(3)中的制备留用的des中加入超纯水，在水浴超声中让水与des混合均匀，制备出含水量30％作为提取溶剂，备用。
48.(5)将步骤(1)中红景天粉末于具塞锥形瓶中，按照20:1的液料比加入含水量为30％的des，室温条件下超声(200w，20khz)提取30min后，移取提取液待离心操作。
49.(6)在10000r
·
min
–1离心作用下离心5min(离心半径为6.36cm)，取上清液于容量瓶中，18％甲醇定容，0.45μm微孔过滤器滤过得红景天苷提取液。后续纯化为ab-18大孔树脂吸附纯化或者乙酸乙酯-石油醚柱层析色谱(3:1，v/v)进行纯化。未经纯化操作通过hplc检测所得红景天苷提取率为10.45mg
·g–1。
50.实施例3
51.(1)称取红景天粉末1.0g，装入具塞锥形瓶中备用。
52.(2)配置深共熔溶剂时，氯化胆碱和尿素的摩尔比为1:2，称取14g氯化胆碱放入烧杯中，称量尿素时，在电子天平上先称量干净烧杯的质量，归零后称取12.1g尿素溶液，将称量好的氯化胆碱加入尿素溶液中进行搅拌。
53.(3)把配置好的氯化胆碱-尿素锥形瓶投入到超声水浴中反应，超声频率20-35khz，超声功率1000w，超声温度50℃条件下超声1h。然后换为电磁搅拌，搅拌温度50℃，搅拌速度500rpm，搅拌1h。将超声反应与电磁搅拌反应循环使用，直至形成透明澄清的深共熔溶剂des，备用。
54.(4)向步骤(3)中的制备留用的des中加入超纯水，让含水量达到30％作为提取溶剂，并在水浴超声中让水与des混合均匀。
55.(5)将步骤(1)中红景天粉末于具塞锥形瓶中，按照20:1的液料比加入含水量为30％的des，室温条件下超声(200w，20khz)提取30min后，移取提取液待离心操作。
56.(6)在10000r
·
min
–1离心作用下离心5min(离心半径为6.36cm)，取上清液于量瓶中，18％甲醇定容，0.45μm微孔过滤器滤过得红景天苷提取液。后续纯化为ab-18大孔树脂吸附纯化或者乙酸乙酯-石油醚柱层析色谱(3:1，v/v)进行纯化。未经纯化操作通过hplc检测所得红景天苷提取率为9.98mg
·g–1。
57.对比例1(水提取)
58.(1)称取红景天粉末1.0g，装入具塞锥形瓶中备用。
59.(2)在其他条件不变的情况下，量取超纯水20ml，保持液料比为20:1，将纯水加入装有红景天的锥形瓶中。
60.(3)把配置好的水系红景天投入超声水浴中反应，超声频率20-35khz，超声功率1000w，超声温度50℃条件下超声1h。
61.(4)在10000r
·
min
–1离心作用下离心5min(离心半径为6.36cm)，取上清液于容量瓶中，18％甲醇定容，0.45μm微孔过滤器滤过得红景天苷提取液。此操作，水系超声提取离心后无大量沉淀，上清液浑浊。后续纯化操作无法进行。未经纯化操作通过hplc检测所得红景天苷提取率为3.82mg
·g–1。
62.对比例2(醇提取)
63.(1)先用粉碎机将红景天根茎粉碎，过120目筛后获得红景天苷粉。称取1.0g红景天粉末,用70％乙醇对红景天苷进行提取，液料比为20:1
64.(2)选取超声辅助-醇提法提取红景天苷，设定超声频率53hz、超声功率450w为固定值、超声温度为70℃，提取时间设定为60min。
65.(3)提取液经抽滤后，旋蒸浓缩、用乙醇重溶解定容，制得红景天苷粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝3:1，v:v)，制得红景天苷纯品。未经纯化操作通过hplc检测所得红景天苷提取率为6.58mg
·g–1。
66.des的热稳定性测试：
67.测定前所有深共熔溶剂于50℃真空干燥48h。实验在氮气保护下，升温速率为10℃/min，从室温25℃上升到500℃，绘制tga曲线，得到相应des的分解温度。
68.des的重复性实验：
69.用新鲜des萃取后，将固液混合物过滤，并在不除去目标物的情况下重复使用溶剂，重新萃取目标物。在同等萃取条件下萃取后，利用高效液相色谱测定溶液中目标物的增
量，从而判断des的可重复利用性。
70.dess种类及摩尔比如表1所示。实施例与对比例的提取率如表2所示。
71.表1des种类及摩尔比
[0072][0073]
表2实施例与对比例的提取率
[0074][0075][0076]
热稳定性：
[0077]
氯化胆碱作为原料，其固体熔点为302℃-305℃,des是由初始化合物的常温下固态转变为常温下稳定液态，由于氢键的存在导致熵增加，熔点降低。且可以知道溶剂熔点远低于原料的熔点，说明在一定温度下不超过原料熔点的温度下可以无限增加提取温度，进行产业化放大设计。
[0078]
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的保护范围之内。

技术特征：
1.一种从红景天中分离得到红景天苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将红景天根或茎烘干后粉碎，过200目筛，得到红景天粉末；(2)将红景天粉末加入深共熔溶剂中，于室温下超声提取一段时间，获得粗提液；(3)将粗提液离心，取上清液于容量瓶中，用18％甲醇定容，定容后的液体经微孔过滤得到红景天苷提取液。2.根据权利要求1所述的红景天苷分离获取方法，其特征在于：所述步骤2中，红景天粉末和深共熔溶剂的料液比为1:20；深共熔溶剂的含水量为30％。3.根据权利要求2所述的红景天苷分离获取方法，其特征在于：所述步骤2中，深共熔溶剂为氯化胆碱与氢键供体按照摩尔比1:1或1:2混合制得，所述氢键供体为丙三醇、乙二醇、1,2-丙二醇、丙二酸或尿素。4.根据权利要求3所述的红景天苷分离获取方法，其特征在于：所述丙三醇、乙二醇、1,2-丙二醇、尿素分别作为氢键供体时，与氯化胆碱的摩尔比均为2:1；所述丙二酸作为氢键供体时，与氯化胆碱的摩尔比为1:1。5.根据权利要求1所述的红景天苷分离获取方法，其特征在于：所述步骤2中，超声提取的时间为30～60min，超声频率为20khz，超声功率200w；所述步骤3中，对粗提液进行离心时的转速为10000rpm/min，离心半径为6.36cm，离心时间为5min；进行所述微孔过滤时采用0.45μm的微孔过滤器。6.根据权利要求3或4所述的红景天苷分离获取方法，其特征在于：所述步骤2中的深共熔溶剂的制备方法如下：将氯化胆碱加入氢键供体后获得的混合液于80℃水浴条件下搅拌，直至混合液中的固体完全溶解或获得透明澄清的液体产物。7.根据权利要求3或4所述的红景天苷分离获取方法，其特征在于：所述步骤2中的深共熔溶剂的制备方法如下：将氯化胆碱加入氢键供体后获得的混合液进行超声水浴反应，超声频率20～35khz，超声功率1000w，温度50℃，反应时间1h；之后进行电磁搅拌，搅拌温度50℃，搅拌速度500rpm，搅拌时间1h；循环进行上述超声水浴和电磁搅拌处理，直至混合液中的固体完全溶解或获得透明澄清的液体产物。8.根据权利要求1所述的红景天苷分离获取方法，其特征在于：还包括步骤4：采用柱层析对步骤3获得的红景天苷提取液进行纯化。9.根据权利要求8所述的红景天苷分离获取方法，其特征在于：所述的柱层析处理采用ab-18型大孔吸附树脂，以乙酸乙酯-石油醚混合液为流动相。

技术总结
本发明公开了一种从红景天中分离并纯化得到红景天苷的方法，步骤包括：将红景天根或茎烘干、粉碎、过200目筛，得到红景天粉末；将红景天粉末加入深共熔溶剂中，于室温下超声提取，获得粗提液；将粗提液离心，取上清液于容量瓶中，用18％甲醇定容，定容后的液体经微孔过滤得到红景天苷提取液。本发明的提取方法绿色高效、成本极低，易于工业化生产。易于工业化生产。


技术研发人员：胡祥正 张宁 刘靖
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/8/9