乙酰乳酸合酶III调控亚基编码基因ilvH和其突变体及其生产L-氨基酸中应用的制作方法

乙酰乳酸合酶iii调控亚基编码基因ilvh和其突变体及其生产l-氨基酸中应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及乙酰乳酸合酶iii调控亚基编码基因ilvh和其突变体及其生产l-氨基酸中应用。


背景技术：

2.l-缬氨酸作为三大支链氨基酸(branched-chain amino acid，bcaa)的一种，属于必需氨基酸，在人和动物中不能合成，只能通过从外界补充获得。目前，l-缬氨酸被广泛用于食品和医药领域，主要包括食品添加剂、营养增补液及风味剂等；广泛用于化妆品制备、以及用作抗生素或者除草剂前体等；另外，随着对饲料质量和配比需求的提高，未来l-缬氨酸在饲料添加剂行业中的作用将越来越重要，需求量会越来越大，未来市场具有极大的潜力。微生物细胞可以直接合成l-缬氨酸，但胞内大量反馈抑制等调控网络极大地限制了野生细胞的生产能力。
3.l-异亮氨酸，属于支链氨基酸(branched chain amino acid，bcaa)，是人与动物自身不能合成而必需外源供给的八大必需氨基酸之一，具有多种生理功能，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质生成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。l-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三种，而目前在工业生产上实施的只有发酵法。目前l-异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌(黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌等)诱变选育而来。
4.因此，急需研究大量生产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的重组菌。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供ilvh突变蛋白或包含其的融合蛋白在制备氨基酸中的应用。
6.第一方面，本发明提供ilvh突变蛋白或包含其的融合蛋白；
7.所述ilvh突变蛋白为将乙酰乳酸合酶iii调控亚基ilvh蛋白的第47位氨基酸残基进行突变，得到的蛋白；
8.所述乙酰乳酸合酶iii调控亚基ilvh蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
9.(a1)包含seq id no：2所示氨基酸序列的蛋白质；
10.(a2)来源于细菌且与(a1)具有95％以上同一性且与细菌产氨基酸相关的蛋白质；
11.(a3)将(a1)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与细菌产氨基酸相关的由(a1)衍生的蛋白质。
[0012]“包含seq id no：2所示氨基酸序列的蛋白质”具体为“seq id no：2所示的蛋白质”。
[0013]
具体的，所述ilvh突变蛋白为如下(b1)-(b8)中任一种：
[0014]
(b1)将所述ilvh蛋白的第47位氨基酸残基由h突变为l得到的蛋白质；
[0015]
(b2)将所述ilvh蛋白的第47位氨基酸残基由h突变为q得到的蛋白质；
[0016]
(b3)将所述ilvh蛋白的第47位氨基酸残基由h突变为r得到的蛋白质；
[0017]
(b4)将所述ilvh蛋白的第47位氨基酸残基由h突变为p得到的蛋白质；
[0018]
(b5)将所述ilvh蛋白的第47位氨基酸残基由h突变为y得到的蛋白质；
[0019]
(b6)将所述ilvh蛋白的第47位氨基酸残基由h突变为n得到的蛋白质；
[0020]
(b7)来源于细菌且与(b1)-(b6)中任一具有95％以上同一性且与细菌产氨基酸相关的蛋白质；
[0021]
(b8)将(b1)-(b6)中任一所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与细菌产氨基酸相关的由(a1)衍生的蛋白质。
[0022]
氨基酸序列中使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。以上任一所述80％以上同一性具体可为85％以上同一性、90％以上同一性、95％以上同一性、96％以上同一性、97％以上同一性、98％以上同一性、99％以上同一性或99.5％以上同一性。
[0023]
第二方面，本发明还提供了相关生物材料，为如下(c1)-(c6)中任一种：
[0024]
(c1)编码第一方面所述ilvh突变蛋白的核酸分子；
[0025]
(c2)编码第一方面所述融合蛋白的核酸分子；
[0026]
(c3)具有(c1)或(c2)所述核酸分子的表达盒；
[0027]
(c4)具有(c1)或(c2)所述核酸分子的重组载体；
[0028]
(c5)具有(c1)或(c2)所述核酸分子的重组微生物；
[0029]
(c6)具有(c1)或(c2)所述核酸分子的重组细胞。
[0030]
包含ilvh突变蛋白的融合蛋白中除了具有ilvh突变蛋白之外，还具有其他氨基酸残基。
[0031]
所述其他氨基酸残基可组成其他功能区段，例如蛋白质标签、其他功能蛋白、连接肽等。
[0032]
所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述的蛋白质标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
[0033]
编码ilvh突变蛋白的核酸分子具体可为将编码ilvh蛋白的核酸分子进行密码子突变得到的核酸分子。
[0034]
编码ilvh蛋白的核酸分子为如下(d1)或(d2)或(d3)：
[0035]
(d1)编码区如seq id no:1所示的dna分子；
[0036]
(d2)来源于微生物或细胞且与(d1)具有80％以上同一性且编码所述蛋白质的dna分子；
[0037]
(d3)在严格条件下与(d1)杂交且编码所述蛋白质的dna分子。
[0038]
核苷酸序列中使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。以上任一所述80％以上同一性具体可为85％以上同一性、90％以上同一性、95％以上同一性、96％以上同一性、97％以上同一性、98％以上同一性、99％以上同一性或99.5％以上同一性。
[0039]
所述严格条件可为在0.1
×
sspe(或0.1
×
ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
[0040]
示例性的，所述进行密码子突变具体可为如下任一形式：将seq id no：1中第141位c突变为a，或第140和141的ac突变为ga，或第140位a突变为c，或第139位c突变为t，或第139位c突变为a。
[0041]
第三方面，本发明还保护第一方面所述ilvh突变蛋白、所述融合蛋白或者第二方所述生物材料的应用，为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：
[0042]
(ⅰ)在提高微生物或细胞的氨基酸产量中的应用；
[0043]
(ⅱ)在生产氨基酸中的应用；
[0044]
(ⅲ)在构建生产氨基酸的重组微生物或重组细胞中的应用。
[0045]
本发明还保护特定物质的应用，为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：
[0046]
(ⅰ)在提高微生物或细胞的氨基酸产量中的应用；
[0047]
(ⅱ)在生产氨基酸中的应用；
[0048]
(ⅲ)在构建生产氨基酸的重组微生物或重组细胞中的应用；
[0049]
所述特定物质包含如下(d1)-(d5)中任一种：
[0050]
(d1)用于提高第一方面所述ilvh突变蛋白或所述融合蛋白的核酸分子表达的物质；
[0051]
(d2)用于提高第一方面所述ilvh突变蛋白或所述融合蛋白丰度的物质；
[0052]
(d3)用于提高第一方面所述ilvh突变蛋白或所述融合蛋白的活性的物质；
[0053]
(d4)用于提高第一方面中所述ilvh蛋白的丰度的物质；
[0054]
(d5)用于提高第一方面中所述ilvh蛋白的活性的物质。
[0055]
第四方面，本发明还保护一种重组微生物或者重组细胞，是在出发微生物或出发细胞中过表达编码第一方面所述ilvh突变蛋白或其融合蛋白或其中的所述ilvh蛋白的核酸分子得到的。
[0056]
可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞或出发菌中，从而增加拷贝数。
[0057]
在本发明的一种实施方式中，通过将编码各个蛋白的核酸分子掺入微生物或者细胞的染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。
[0058]
在本发明的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的编码各个蛋白的核酸分子掺入微生物或细胞的染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。
[0059]
在本发明的一种实施方式中，将编码各个蛋白的核酸分子掺入表达载体中，将所述表达载体导入微生物或者细胞中，从而增加拷贝数。
[0060]
在本发明的一种实施方式中，将带有启动子序列的编码各个蛋白的核酸分子掺入表达载体中，将所述表达载体导入微生物或者细胞中，从而过表达所述核酸序列。
[0061]
如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的
表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、t7启动子、lac启动子、trp启动子、arabad启动子或cj7启动子。
[0062]
如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本发明中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。
[0063]
在本发明的一些具体实施方式中，使用的载体是pet28a(+)载体、pk18mobsacb载体、pxmj19载体。
[0064]
示例性的，所述重组微生物可为实施例中制备的各个重组菌。
[0065]
第五方面，本发明还保护所述重组微生物或所述重组细胞在制备氨基酸中的应用。
[0066]
应用所述重组微生物制备氨基酸时，具体方法包括如下步骤：发酵所述重组微生物。
[0067]
本领域技术人员可以采用现有技术中的发酵方法进行发酵培养。也可通过常规试验进行发酵方法的优化和改进。可以在本领域中已知的发酵条件下在合适的培养基中进行微生物的发酵。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的ph。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。
[0068]
在培养中，培养物的温度可以是20-45℃(例如25℃-33℃)。
[0069]
所述方法还可包括如下步骤：从培养物中获得氨基酸。从培养物中获得氨基酸可通过各种方式实现，包括但不限于：用硫酸或氢氯酸等处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。
[0070]
示例性的，发酵培养时重组微生物的接种量为3.5％或10％。
[0071]
示例性的，发酵培养的培养基为表7所示的l-缬氨酸发酵培养基(示例性配方见实施例)。
[0072]
示例性的，发酵培养的培养基为l-异亮氨酸发酵培养基(示例性配方见实施例)。
[0073]
示例性的，发酵培养的培养条件见实施例。
[0074]
第六方面，本发明还保护一种提高微生物或者细胞的氨基酸产量的方法，包括如下步骤：将微生物或者细胞基因组中编码ilvh蛋白的核酸分子替换为编码ilvh突变蛋白或其融合蛋白的核酸分子。
[0075]
第七方面，本发明还保护一种提高微生物或者细胞的氨基酸产量的方法，包括如下任一步骤：
[0076]
e1)在微生物或细胞中过表达第一方面所述ilvh突变蛋白或其融合蛋白的核酸分子；
[0077]
e2)提高微生物或细胞中第一方面所述ilvh突变蛋白或其融合蛋白的丰度；
[0078]
e3)提高微生物或细胞中第一方面所述ilvh突变蛋白或其融合蛋白的活性；
[0079]
e4)在微生物或细胞中过表达第一方面中所述ilvh蛋白的核酸分子；
[0080]
e5)提高微生物或细胞中第一方面中所述ilvh蛋白的丰度；
[0081]
e6)提高微生物或细胞中第一方面中所述ilvh蛋白的活性。
[0082]
本发明还保护目的蛋白在调控微生物或者细胞的氨基酸产量中的应用。
[0083]
所述调控微生物l-氨基酸的产量可为上调(提高)或下调(降低)微生物中l-氨基酸的积累量(即促进或抑制l-氨基酸的生物合成)。
[0084]
进一步，所述调控为正调控，即目的蛋白含量增高，微生物或者细胞的氨基酸产量提高。以上任一所述目的蛋白为所述ilvh突变蛋白、所述融合蛋白或所述ilvh蛋白。
[0085]
所述氨基酸包括但不限于如下任一氨基酸或如下任意两种以上氨基酸的组合：异亮氨酸和缬氨酸。以上任一所述氨基酸可为l-氨基酸。所述l-氨基酸可包括l-缬氨酸、l-异亮氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-精氨酸、l-赖氨酸、l-谷氨酸、l-甘氨酸、l-丙氨酸、l-亮氨酸、l-甲硫氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-酪氨酸、l-半胱氨酸、l-苯丙氨酸、l-天冬酰胺、l-谷氨酰胺、l-天冬氨酸和/或l-组氨酸。
[0086]
进一步地，所述l-氨基酸可包括l-缬氨酸和/或l-异亮氨酸。
[0087]
以上任一所述细胞可为植物细胞或者动物细胞。所述细胞可为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。
[0088]
以上任一所述微生物可为细菌、藻类或真菌。具体的，所述真菌可为酵母菌。
[0089]
以上任一所述细菌可为其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia sp.)、欧文氏菌属(erwinia sp.)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)、黄杆菌属(flavobacterium sp.)、产碱菌属(alcaligenes sp.)、假单胞菌属(pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(bacillus sp.)、短杆菌属(brevibacterium sp.)、棒状杆菌属(corynebacterium sp.)、气杆菌属(aerobacter sp.)、肠杆菌属(enterobacteria sp.)、微球菌属(micrococcus sp.)、沙雷氏菌属(serratia sp.)、沙门氏菌属(salmonella sp.)、链霉菌属(streptomyces sp.)、普罗维登斯菌属(providencia sp.)等但不限于此。
[0090]
进一步地，所述细菌可为大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、北京棒杆菌(corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌(brevibacterium ammoniagenes，产氨短杆菌)、钝齿棒状杆菌(corynebacterium crenatum)或泛菌(pantoea)但不限于此。
[0091]
在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌(escherichia coli)，具体为大肠杆菌dh5α、大肠杆菌w3110、大肠杆菌cgmcc22721、谷氨酸棒杆菌atcc13032和/或谷氨酸棒杆菌cgmcc 20437。利用本发明所述ilvh蛋白或其变体构建的重组微生物或重组细胞可用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的缬氨酸和/或异亮氨酸，所生产的产物还可包括赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨
酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、α酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸和/或瓜氨酸。
[0092]
本发明的实验证明，在谷氨酸棒状杆菌中，谷氨酸棒状杆菌乙酰乳酸合酶iii调控亚基编码基因ilvh的过表达及点突变能提高其l-异亮氨酸的产量；同时，ilvh基因在大肠杆菌中的过表达及点突变能提高大肠杆菌中l-缬氨酸的产量。本发明构建的基因工程菌种，可以促进l-缬氨酸和/或l-异亮氨酸的积累，提高l-缬氨酸和/或l-异亮氨酸的产量，培育了符合工业化生产的高产、高质量菌种，对l-缬氨酸及l-异亮氨酸的工业化生产具有广泛的应用价值和重要的经济意义。
具体实施方式
[0093]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0094]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0095]
下述实施例中高效液相色谱法(hplc)分析l-缬氨酸的浓度的检测方法见参考文献：panjwani i,arain g m,khuhawar m y.determination of dopamine,glycine,tryptohan,valine,leucine and isoleucine using 4-dimethylaminobenzaldehyde by hplc in pharmaceutical samples[j].asian journal of chemistry:an international quarterly research journal of chemistry,2014,26(22):7 494-7 498.标准品：tmstandard 77425。
[0096]
下述实施例中高效液相色谱法(hplc)分析l-异亮氨酸的浓度的检测方法见参考文献：唐艳，李晶，吴涛.l-异亮氨酸高效液相色谱检测方法的研究[j].发酵科技通讯,2017,46(4):220-223。
[0097]
大肠杆菌cgmcc no.22721，已于2021年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmcc no.22721，分类命名大肠埃希氏菌escherichia coli。大肠杆菌cgmcc no.22721为l-缬氨酸生产菌。
[0098]
谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437中，已于2020年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmcc no.20437，分类命名谷氨酸棒杆菌corynebacterium glutamicum。谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437为l-异亮氨酸生产菌。
[0099]
实施例1、构建包含乙酰乳酸合酶iii调控亚基活性的乙酰乳酸合酶iii调控亚基突变型w3110菌株
[0100]
一、具有乙酰乳酸合酶iii调控亚基活性的ilvh突变型表达质粒的构建
[0101]
1、表达野生型ilvh基因的质粒的构建
[0102]
表达野生型ilvh基因的质粒pet28(a)-ilvh为将野生型ilvh基因及启动子(核苷酸序列如seq id no：3)克隆到表达载体pet28(a)的ecor i和hind iii酶切位点间，得到质粒pet28(a)-ilvh，该质粒含有野生型ilvh基因(seq id no：1)，表达野生型ilvh蛋白，该蛋白的氨基酸序列为seq id no：2，具体构建方法如下：
[0103]
以ncbi公布的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032基因组序列为模板，以引物pet28-pf/pet28-pr pcr扩增，获得野生型ilvh基因及其启动子片段(序列如seq id no：3)。回收后与经ecor i/hind iii酶切回收的表达载体pet28(a)(购自
takara公司，含有卡那霉素抗性)用nebuilder酶(购自neb公司)50℃连接30min，连接产物转化dh5α，涂布到含有卡那霉素(50mg/l)的2-yt琼脂平板上p25℃培养，获得含ilvh及其启动子的pet28(a)转化子pet28(a)-ilvh。对培养长出的单克隆用引物t7f/t7r和r taq pcr鉴定，pcr扩增出含有大小872bp片段的为含ilvh基因的pet28(a)阳性转化子pet28(a)-ilvh，该阳性转化子含有质粒pet28(a)-ilvh。
[0104]
2、ilvh随机突变质粒的获得
[0105]
为了获得编码乙酰乳酸合酶iii调控亚基基因ilvh的突变体，使用随机诱变试剂盒(agilent technologies,usa)制备了ilvh突变型基因质粒。以质粒pet28(a)-ilvh为模板，以引物pet28-pf/pet28-pr pcr扩增，获得了包含随机点突变的ilvh基因片段664bp。
[0106]
上述pcr扩增体系：5
×
hifi with mg
2+
buffer 10μl，dntp mixture(10mm)1.5μl，引物(10pm)各1.6μl，kapa hifi hotstart(1u/μl)0.5μl，补ddh2o至总体积50μl.
[0107]
pcr扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。
[0108]
回收的dna片段与经ecor i/hind iii酶切回收的表达载体pet28(a)(购自takara公司，含有卡那霉素抗性)用nebuilder酶(购自neb公司)50℃连接30min，连接产物转化dh5α，涂布到含有卡那霉素(50mg/l)的2-yt琼脂平板上p25℃培养。对培养长出的单克隆用引物t7f/t7r和r taq pcr鉴定，pcr扩增出含有大小872bp片段的为含ilvh随机突变的pet28(a)阳性转化子，提取质粒为ilvh随机突变质粒。
[0109]
pcr扩增体系：2
×
premix r taq 12.5μl，引物(10pm)各1μl，补ddh2o至总体积25μl。
[0110]
pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
[0111]
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
[0112]
pet28-pf:5'-actggtggac agcaaatggg tcgcggatcc gaattcgccg acattcacga agcc-3'(带下划线的核苷酸序列为pet28(a)同源臂序列)，
[0113]
pet28-pr:5'-ggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaagctttagatcttg gccggagc
[0114]-3'(带下划线的核苷酸序列为pet28(a)同源臂序列)。
[0115]
t7f:5'-cagcagccat catcatcatc-3'
[0116]
t7r:5'-atccggatat agttcctcc-3'
[0117]
二、具有乙酰乳酸合酶iii调控亚基活性的ilvh突变型菌株的构建
[0118]
为了鉴定步骤一中构建的突变载体的l-氨基酸生产性能，具体地，将步骤一中构建的ilvh随机突变质粒转化到大肠杆菌w3110菌株(atcc 27325)中(转化和鉴定同步骤一)，将阳性转化子在卡那霉素(50mg/l)的2-yt琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有丰富培养基30ml的500ml三角瓶中p25℃摇瓶发酵24h，发酵培养菌体长至od
600
＝0.2时加入终浓度0.1mm的iptg以诱导乙酰乳酸合酶iii调控亚基过表达。
[0119]
发酵培养结束后采用高效液相色谱法(hplc)分析l-缬氨酸的浓度，如表1所示。挑选具有比w3110对照的l-缬氨酸生产能力优越的菌株，即为w3110-ilvh突变株。
[0120]
上述丰富培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖30g/l，(nh4)2so
4 2g/l，h3po
4 0.5g/l，kcl 0.8g/l，mgso4·
7h2o 0.8g/l，feso4·
7h2o 0.05g/l，mnso4·
h2o 0.05g/l，
fm902酵母粉1.5g/l，玉米浆5g/l，糖蜜17g/l，甜菜碱0.5g/l，柠檬酸2g/l，v
h 20mg/l，vb
1 1.5mg/l，vb
3 1.5mg/l，vb
12 1.5g/l，氢氧化钠调节ph7.0。
[0121]
表1为w3110-ilvh突变株的高效液相色谱法l-氨基酸分析结果
[0122][0123]
如表1中所示，大肠杆菌w3110-ilvh突变株具有产部分l-缬氨酸的能力，其中突变株3产l-缬氨酸的能力更优越。
[0124]
通过从w3110-ilvh突变株3提取质粒对ilvh基因进行测序的结果，确认了ilvh突变株3含有ilvh突变的突变基因ilvh
h47l
，突变基因ilvh
h47l
的核苷酸序列为将野生型ilvh基因(seq id no：1)的第140位鸟嘌呤(a)突变为胸腺嘧啶(t)，该ilvh突变基因ilvh
h47l
编码的突变蛋白ilvh
h47l
，其氨基酸序列为将野生型ilvh基因编码蛋白(seq id no：2)氨基酸序列的第47位组氨酸(h)突变为异亮氨酸(l)，含有突变基因ilvh
h47l
的质粒命名为pet28(a)-h47l。
[0125]
pet28(a)-h47l与pet28(a)-ilvh相比，仅为将野生型ilvh基因(seq id no：1)替换为突变基因ilvh
h47l
，质粒pet28(a)-h47l表达突变蛋白ilvh
h47l
。该质粒按照常规方法制备。
[0126]
三、具有乙酰乳酸合酶iii调控亚基活性的ilvh突变体质粒的构建
[0127]
以随机突变的方式利用野生型大肠杆菌w3110获得了w3110-ilvh突变株3。为了获得更多ilvh突变株以提高其l-缬氨酸的生产能力，构建以上述ilvh突变位置的氨基酸用不同氨基酸取代的突变体。
[0128]
构建如下含有ilvh第47位ilvh不同氨基酸突变的质粒：pet28(a)-h47q、pet28(a)-h47r、pet28(a)-h47p、pet28(a)-h47y、pet28(a)-h47n，这些质粒与pet28(a)-ilvh相
比，仅为将野生型ilvh基因(seq id no：1)分别替换为突变基因ilvh
h47q
、突变基因ilvh
h47r
、突变基因ilvh
h47p
、突变基因ilvh
h47y
、突变基因ilvh
h47n
，质粒pet28(a)-h47q、pet28(a)-h47r、pet28(a)-h47p、pet28(a)-h47y、pet28(a)-h47n分别表达突变蛋白ilvh
h47q
、突变蛋白ilvh
h47r
、突变蛋白ilvh
h47p
、突变蛋白ilvh
h47y
、突变蛋白ilvh
h47n
。
[0129]
突变基因ilvh
h47q
的核苷酸序列为将野生型ilvh基因(seq id no：1)的第141位c突变为a，突变基因ilvh
h47q
编码的突变蛋白ilvh
h47q
，其氨基酸序列为将野生型ilvh基因编码蛋白(seq id no：2)氨基酸序列的第47位h突变为q。
[0130]
突变基因ilvh
h47r
的核苷酸序列为将野生型ilvh基因(seq id no：1)的第140和141的ac突变为ga，突变基因ilvh
h47r
编码的突变蛋白ilvh
h47r
，其氨基酸序列为将野生型ilvh基因编码蛋白(seq id no：2)氨基酸序列的第47位h突变为异亮氨酸r。
[0131]
突变基因ilvh
h47p
的核苷酸序列为将野生型ilvh基因(seq id no：1)的第140位a突变为c，突变基因ilvh
h47p
编码的突变蛋白ilvh
h47p
，其氨基酸序列为将野生型ilvh基因编码蛋白(seq id no：2)氨基酸序列的第47位h突变为p。
[0132]
突变基因ilvh
h47y
的核苷酸序列为将野生型ilvh基因(seq id no：1)的第139位c突变为t，突变基因ilvh
h47y
编码的突变蛋白ilvh
h47y
，其氨基酸序列为将野生型ilvh基因编码蛋白(seq id no：2)氨基酸序列的第47位h突变为异亮氨酸y。
[0133]
突变基因ilvh
h47n
的核苷酸序列为将野生型ilvh基因(seq id no：1)的第139位c突变为a，突变基因ilvh
h47n
编码的突变蛋白ilvh
h47n
，其氨基酸序列为将野生型ilvh基因编码蛋白(seq id no：2)氨基酸序列的第47位h突变为n。
[0134]
上述各个突变质粒构建中使用的引物名称和突变质粒名称如下如表2。
[0135]
表2为各个突变质粒构建中使用的引物名称和突变质粒名称
[0136][0137]
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
[0138]
h-qr:5'-ccgtgatgcg gttgatgcct tgtgtttcgg tctttgcaga-3'，
[0139]
h-qf:5'-tctgcaaaga ccgaaacaca aggcatcaac cgcatcacgg-3'，
[0140]
h-rr:5'-ccgtgatgcg gttgatgcct cgtgtttcgg tctttgcaga-3'，
[0141]
h-rf:5'-tctgcaaaga ccgaaacacg aggcatcaac cgcatcacgg-3'，
[0142]
h-pr:5'-ccgtgatgcg gttgatgccg ggtgtttcgg tctttgcaga-3'，
[0143]
h-pf:5'-tctgcaaaga ccgaaacacc cggcatcaac cgcatcacgg-3'，
[0144]
h-pr:5'-ccgtgatgcg gttgatgccg tatgtttcgg tctttgcaga-3'，
[0145]
h-pf:5'-tctgcaaaga ccgaaacata cggcatcaac cgcatcacgg-3'
[0146]
h-yr:5'-ccgtgatgcg gttgatgccg tttgtttcgg tctttgcaga-3'，
[0147]
h-yf:5'-tctgcaaaga ccgaaacaaa cggcatcaac cgcatcacgg-3'，
[0148]
上述各个突变质粒的构建方法具体如下：
[0149]
分别以步骤二中测序的质粒pet28(a)-h47l为模板，分别以表2中各自对应的引物和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得两条分别带有ilvh突变碱基的up dna片段和down dna片段，其中在140位点突变的up
140
dna片段大小为260bp，down
140
dna片段大小为418bp。pcr反应结束后，采用柱式dna凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收up和down dna片段。回收后的dna片段与经ecor i/hind iii酶切回收的表达载体pet28(a)用nebuilder酶(购自neb公司)50℃连接30min，连接产物转化dh5α，涂布到含有卡那霉素(50mg/l)的2-yt琼脂平板上p25℃培养。对培养长出的单克隆用引物t7f/t7r pcr鉴定，用r taq pcr扩增出含有大小872bp片段的为ilvh突变pet28(a)的阳性转化子，其中第47位的亮氨酸分别用表2中对应的各氨基酸取代的ilvh突变载体如表2中所列的名称进行命名。
[0150]
pcr扩增体系：5
×
hifi with mg
2+
buffer 10μl，dntp mixture(10mm)1.5μl，引物(10pm)各1.6μl，kapa hifi hotstart(1u/μl)0.5μl，补ddh2o至总体积50μl。
[0151]
pcr扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。
[0152]
pcr扩增体系：2
×
premix r taq 12.5μl，引物(10pm)各1μl，补ddh2o总体积25μl。
[0153]
pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
[0154]
四、具有乙酰乳酸合酶iii调控亚基活性的ilvh突变体菌株的构建
[0155]
为了鉴定步骤三中构建的突变载体对l-缬氨酸的生产性能，具体如下：
[0156]
将步骤二和三中构建的质粒pet28(a)-h47l、pet28(a)-h47q、pet28(a)-h47r、pet28(a)-h47p、pet28(a)-h47y、pet28(a)-h47n分别转化到大肠杆菌w3110菌株中(转化和鉴定同步骤一)，得到阳性转化子w3110-pet28(a)-h47l、w3110-pet28(a)-h47q、w3110-pet28(a)-h47r、w3110-pet28(a)-h47p、w3110-pet28(a)-h47y、w3110-pet28(a)-h47n，即为各个突变菌株；
[0157]
将阳性转化子分别在卡纳霉素(50mg/l)的2-yt琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有30ml丰富培养基的500ml三角瓶中p25℃摇瓶发酵24h，发酵培养菌体长至od
600
＝0.2时加入终浓度0.1mm的iptg以诱导乙酰乳酸合酶iii调控亚基过表达。
[0158]
发酵培养结束后采用高效液相色谱法(hplc)分析l-缬氨酸的浓度，各个突变菌株发酵结果如表3所示。
[0159]
由表3的发酵结果可知，突变株w3110-pet28(a)-h47l产l-缬氨酸的能力比w3110-pet28(a)-h47q、w3110-pet28(a)-h47r、w3110-pet28(a)-h47p、w3110-pet28(a)-h47y和w3110-pet28(a)-h47n更强。同时，发现w3110-pet28(a)-h47l具有产异亮氨酸能力。
[0160]
表3为w3110-ilvh(第47位点突变)突变株的高效液相色谱法l-氨基酸分析结果
[0161][0162]
实施例2、构建包含基因组上过表达的乙酰乳酸合酶iii调控亚基活性的ilvh和ilvh
h47l
的工程菌株
[0163]
依据ncbi公布的大肠杆菌(escherichia coli)w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术在l-缬氨酸生产大肠杆菌cgmcc no.22721的dmsa基因编码区内(经测序确认缬氨酸生产菌株cgmcc no.22721染色体上保留有野生型的dmsa基因)分别整合来自谷氨酸棒状杆菌的野生型ilvh基因和突变基因ilvh
h47l
，以此在高产菌株中更深入研究突变
型ilvh
h47l
基因对l-缬氨酸合成量的影响。
[0164]
一、sgrna的构建
[0165]
依据ncbi公布的大肠杆菌(escherichia coli)w3110基因组序列，使用crispr-rgen tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgrna靶序列，选择好合适的sgrna靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pgrb克隆载体末端序列，以便通过重组形成完整的sgrna质粒。
[0166]
扩增sgrna片段，无需模板，只需进行pcr退火过程即可，体系及程序如下。pcr反应体系：sgrna-1f(在dsma位点插入)10μl，sgrna-1r(在dsma位点插入引物)10μl；pcr反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用dna纯化试剂盒回收目的片段，得到sgrna-1，测定其dna浓度，并将浓度稀释至100ng/μl。
[0167]
提取pgrb质粒(addgene 71539)并用spe i酶切及去磷酸化处理，以防止pgrb质粒自连。酶切体系：10xbuffer 5μl，speⅰ2.5μl，pgrb质粒dna 3000-5000ng，补ddh2o至50μl。p25℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10xbuffer 5μl，pgrb质粒dna 1000-2000ng，ciap(takar 2250a)2.5μl，补ddh2o至50μl。p25℃处理1h后采用dna纯化试剂盒回收线性pgrb质粒。再利用gibson assembly试剂盒(new england公司)进行sgrna-1(在dsma位点插入)和pgrb质粒的重组。重组体系：neb组装酶2.5μl，线性pgrb质粒2μl，sgrna-1 0.5μl。50℃组装30min后将产物转化dh5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgrna-pf/sgrna-pr测序鉴定。将构建好的质粒命名为pgrb-sgrna-1。
[0168]
本实验所用引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，带下划线的碱基为pgrb克隆载体同源臂序列，小写突出字体的碱基为sgrna序列：
[0169]
sgrna-1f:5'-tgacagctagctcagtcctaggtataatactagtcacatacaaa
[0170]
ccttgttcaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg-3'
[0171]
sgrna-1r:5'-ccttattttaacttgctatttctagctctaaaacctgaacaagg tttgtatgtgactagtattatacctaggactgagctagctgtca-3'
[0172]
sgrna-pf：5'-gtctcatgagcggatacatatttg-3'
[0173]
sgrna-pr：5'-atgagaaagcgccacgct-3'
[0174]
二、pcr扩增基因组过表达的dna序列
[0175]
依据ncbi公布的大肠杆菌(escherichia coli)w3110基因组序列，设计并合成四对扩增上下游同源臂序列及ilvh或ilvh
h47l
基因编码区及启动子区的引物，以crispr/cas9基因编辑的方式分别在l-缬氨酸生产菌dmsa基因编码区后分别引入ilvh基因或ilvh
h47l
基因。
[0176]
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
[0177]
p1:5'-ttactgaccg aaatcgccgg-3'，
[0178]
p2:5'-acggcttcgt gaatgtcggc ttaacggtag cgttttatgg-3'，
[0179]
p3:5'-c cataaaacgc taccgttaag ccgacattca cgaagccgt-3'，
[0180]
p4:5'-acattaccgc aacgataaca ttagatcttg gccggagcca-3'，
[0181]
p5:5'-tggctccgg ccaagatcta atgttatcgt tgcggtaatg t-3'，
[0182]
p6:5'-cagcttaact gcagctgcaa-3'。
[0183]
以w3110基因组dna为模板，以引物p1/p2和p5/p6及kapa hifi hotstart pcr扩
增，获得上同源臂719bp和下同源臂片段581bp；分别以atcc 13032基因组dna和质粒pet28(a)-h47l为模板，以引物p3/p4和kapa hifi hotstart分别pcr扩增ilvh和ilvh
h47l
基因632bp。pcr反应结束后，采用柱式dna凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的dna以引物p1和p6 overlap pcr分别获得基因组过表达dna重组片段up-ilvh-down(seq id no：4)和up-ilvh
h47l-down(seq id no：5)1792bp。
[0184]
pcr扩增体系：5
×
hifi with mg
2+
buffer 10μl，dntp mixture(10mm)1.5μl，引物(10pm)各1.6μl，kapa hifi hotstart(1u/μl)0.5μl，dna 1ul,补ddh2o至总体积50μl。
[0185]
pcr扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸150s；30个循环)，72℃过度延伸5min。
[0186]
三、感受态的制备及转化
[0187]
制备l-缬氨酸高产菌cgmcc no.22721感受态细胞。在50ml三角瓶(装液量10ml)中接一接种环cgmcc no.22721，37℃、220r/m，过夜培养。取过夜培养的cgmcc no.22721菌液1ml转接入500ml三角瓶(装液量50ml)中，37℃、220r/m，培养至od
600
＝0.6时，将菌液转入50ml离心管中，800 0r/min离心5分钟，收集菌体；加入40ml无菌水将菌体混匀，8000r/min离心5分钟，收集菌体；加入40ml10％甘油将菌体混匀，离心收集菌体，将离心后的菌体用1ml10％甘油混匀，分装入ep管中备用。
[0188]
将3μl pred-cas9质粒(addgene#71541)加入制备好的cgmcc no.22721感受态细胞中，混匀；将上述质粒和感受态混合液加入电转杯中冰浴15分钟，电击后加入恢复培养基，吸出加入ep管中，32℃、180r/min震荡培养1小时，离心收集菌体涂布于含100mg/l壮观霉素的2-yt平板上，32℃过夜培养；从过夜培养后的2-yt平板上挑取单克隆划线，即为cgmcc no.22721-cas9。
[0189]
制备l-缬氨酸高产菌cgmcc no.22721-cas9感受态细胞。当菌体长至od
600
＝0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ-red介导的同源重组。当od
600
＝0.6时，收集菌体制备感受态细胞，转化上述一获得的pgrb-sgrna-1质粒和上述二获得的基因组过表达dna片段(up-ilvh-down或up-ilvh
h47l-down)，涂布到含有壮观霉素(100mg/l)和氨苄霉素(100mg/l)的2-yt琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物p13/p14用r taq pcr鉴定，pcr扩增出含有大小1246bp的片段为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
[0190]
将阳性转化子接种于含壮观霉素(100mg/l)和终浓度至0.2％(质量体积百分含量，g/ml)的阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-1，挑选在壮观霉素(100mg/l)上生长而在氨苄霉素(100mg/l)上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素(100mg/l)上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，通过引物p15/p16用r taq pcr鉴定，pcr扩增出含有大小1227bp的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
[0191]
将转入pgrb-sgrna-1质粒和up-ilvh-down的阳性转化子命名为ypval-ilvh-001(不含突变点)，即为重组菌ypval-ilvh-001；
[0192]
将转入pgrb-sgrna-1质粒和up-ilvh
h47l-down的阳性转化子命名为ypval-ilvh-002(含突变点)，即为重组菌ypval-ilvh-002。
[0193]
重组菌ypval-ilvh-001含有单拷贝的seq id no：1所示的野生型ilvh基因；具体地，重组菌ypval-ilvh-001是在escherichia coli l-缬氨酸生产菌cgmcc no.22721基因
组上dmsa编码区终止密码子后插入为ilvh基因及其启动子(插入序列为seq id no：6的第1-592位，其中第74-592位为基因，第1-73位为启动子)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有单拷贝ilvh基因的重组菌ypval-ilvh-001可以显著和稳定地提高ilvh基因的表达量。
[0194]
重组菌ypval-ilvh-002含有突变基因ilvh
h47l
；具体地，重组菌ypval-ilvh-002是将escherichia coli l-缬氨酸生产菌cgmcc no.22721基因组上dmsa编码区终止密码子后插入突变型ilvh
h47l
基因及其启动子(插入序列为seq id no：6的第1-592位，且其中第213位的a突变为t，其他序列不变)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有单拷贝ilvh
h47l
基因的重组菌ypval-ilvh-002可以显著和稳定地提高ilvh基因的表达量。
[0195]
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
[0196]
p13:5'-tacccaggaa gagtggatgc-3'，
[0197]
p14:5'-tccatgggca agagtgcaga-3'，
[0198]
p15:5'-gccgacattc acgaagccg-3'，
[0199]
p16:5'-tcccatctca cacctccttc-3'。
[0200]
pcr扩增体系：2
×
premix r taq 12.5μl，引物(10pm)各1μl，补ddh2o总体积25μl。
[0201]
pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
[0202]
实施例3、构建包含点突变的ilvh基因编码区片段的重组载体(用于谷氨酸棒状杆菌基因操作)
[0203]
依据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc3032基因组序列，设计并合成6对扩增ilvh基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.20437(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的ilvh基因)的ilvh基因编码区(seq id no：1)中引入点突变，点突变后使野生型的ilvh基因突变为突变基因ilvh h47l
，突变基因ilvh h47l
的核苷酸序列为将ilvh基因的核苷酸序列(seq id no：1)中的第140位腺嘌呤(a)突变为胸腺嘧啶(t)，其他序列不变。
[0204]
采用nebuilder重组技术进行载体构建，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，红色加粗字体的碱基为突变位置：
[0205][0206]
构建方法：以谷氨酸棒杆菌atcc13032为模板，分别以引物p17/p18、p19/p20进行pcr扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为280bp和424bp的ilvh基因编码区的dna片段(ilvh
h47l up和ilvh
h47l down)。
[0207]
pcr扩增体系：5
×
hifi with mg
2+
buffer 10μl，dntp mixture(10mm)1.5μl，引物(10pm)各1.6μl，kapa hifi hotstart(1u/μl)0.5μl，补ddh2o至总体积50μl。
[0208]
pcr扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。
[0209]
将上述dna片段(ilvh
h47l up和ilvh
h47l down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过酶切(xbal i/bamh i)后纯化的pk18mobsacb质粒(购自addgene公司，质粒上含有卡那霉素抗性标记)用nebuilder酶(购自neb公司)50℃连接30min，连接产物转化dh5a后长出的单克隆经m13引物(m13f:5’tgt aaa acg acg gcc agt 3’，m13r:5’cag gaa aca gct atg acc 3’)pcr鉴定获得阳性重组载体pk18-ilvh
h47l
。将酶切正确的重组质粒pk18-ilvh
h47l
送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(h47l)的重组载体pk18-ilvh
h47l
保存备用。
[0210]
重组质粒pk18-ilvh
h47l
是将pk18mobsacb质粒的xbal i和bamh i识别位点间的片段(小片段)替换为seq id no：14所示的dna片段，保持pk18mobsacb载体的其他序列不变，得到的重组载体。
[0211]
重组载体pk18-ilvh
h47l
中含有突变基因ilvh
h47l
，该重组载体导入会导致菌株谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437中ilvh基因编码区的第140位腺嘌呤(a)突变为胸腺嘧啶(t),最终导致编码蛋白的第47位组氨酸(h)突变为亮氨酸(l)。
[0212]
实施例4、构建包含基因ilvh
h47l
的工程菌株
[0213]
构建方法：将实施例3中的等位替换质粒(pk18-ilvh
h47l
)通过电击转化入谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.20437中后，在培养基中进行培养。培养基成分和培养条件参见表4，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物p1和通用引物m13r(5’cag gaa aca gct atg acc 3’)进行鉴定，能扩增出673bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行pcr鉴定：
[0214]
p21:5'gccg acattcacga agccgt 3'，
[0215]
p22:5'ttagatcttg gccggagcca 3'。
[0216]
将得到的pcr扩增产物(592bp)通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行sscp(single-strand conformation polymorphis)电泳(以质粒pk18-ilvh
h47l
扩增片段为阳性对照，谷氨酸棒杆菌atcc13032扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，sscp电泳的page的制备及电泳条件参见表5，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株，即为阳性菌株。
[0217]
再次通过引物p17/p18 pcr扩增阳性菌株ilvh基因片段，并连接到pmd19-t载体进行测序，通过序列比对，阳性菌株中含有碱基序列发生突变(a140t)的ilvh突变基因ilvh
h47l
，该菌株为等位替换成功的阳性菌株，并被命名为cgmcc 20437-ilvh
h47l
(ypile-ilvh-001)。
[0218]
重组菌ypile-ilvh-001含有突变基因ilvh
h47l
，其为将谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.20437中的野生型ilvh基因等位替换为突变基因ilvh
h47l
，其他基因不变，得到的重组菌。
[0219]
表4为培养基的组成和培养条件
[0220][0221][0222]
表5为sscp电泳的page的制备及电泳条件
[0223][0224]
实施例5、构建谷氨酸棒状杆菌基因组上过表达ilvh基因和ilvh
h47l
基因的工程菌株
[0225]
采用nebuilder重组技术进行载体构建，依据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组序列，设计并合成扩增上下游同源臂片段及ilvh或ilvh
h47l
基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437中引入ilvh基因及ilvh
h47l
基因。
[0226]
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
[0227]
p23:5'cagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctag aatttcctgg agcagtgcgt 3'，
[0228]
p24:5'gaattagcca tttcgctttt gaattagcca tttcgctttt3'，
[0229]
p25:5'aaaagcgaaa tggctaattc aaaagcgaaa tggctaattc 3'，
[0230]
p26:5'agatctaact acttctcgtt agatctaact acttctcgtt3'，
[0231]
p27:5'agatctaact acttctcgtt agatctaact acttctcgtt 3'，
[0232]
p28:5'cagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtaccc tagctttcgg ccacgactgg 3'。
[0233]
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌atcc13032或实施例4制备的ypile-ilvh-001为模板，分别以引物p23/p24，p25/p26，p27/p28进行pcr扩增，获得上游同源臂片段666 bp(对应于谷氨酸棒杆菌cgmcc 20437 cg0680编码区终止子后，序列如seq id no：7所示)，ilvh基因及其启动子片段540 bp(序列如seq id no：8所示)或ilvh
h47l
基因及其启动子片段540bp(序列如seq id no：9所示)，和下游同源臂片段768 bp(对应于谷氨酸棒杆菌cgmcc 20437 cg0680编码区终止子后，序列如seq id no：10所示)。
[0234]
pcr反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式dna凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过xbal i/bamh i酶切后纯化的pk18mobsacb质粒(购自addgene公司，该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记)用nebuilder酶(购自neb公司)50℃连接30min，连接dh5a产物转化后长出的单克隆用m13引物(m13f:5’tgt aaa acg acg gcc agt 3’，m13r:5’cag gaa aca gct atg acc 3’)经pcr鉴定获得阳性整合质粒(得到560bp的为阳性)，分别为pk18-ilvh oe
0680
(采用上游同源臂片段、ilvh基因及其启动子片段和下游同源臂片段进行同源重组)、pk18-ilvh
h47l
oe(采用上游同源臂片段、ilvh
h47l
基因及其启动子片段和下游同源臂片段进行同源重组)，各个阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
[0235]
pcr扩增体系：2
×
premix r taq 12.5μl，引物(10pm)各1μl，补ddh2o总体积25μl。
[0236]
pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
[0237]
将测序正确的整合质粒(pk18-ilvh oe
cg0680
、pk18-ilvh
h47l
oe)分别电转化入谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437中，在培养基中进行培养(30℃)，培养基成分见表6，对培养产生的单菌落分别通过p29/p30引物进行pcr鉴定cg0680位点插入ilvh或ilvh
h47l
，pcr扩增出含有大小1080bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基(在固体培养基中加入15％的蔗糖，其他成分保持不变)上培养，对培养产生的单菌落进一步采用p31/p32引物进行pcr鉴定，扩增出大小为1260bp的菌为ilvh或ilvh
h47l
基因整合到谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437基因组上cg0680后的阳性菌株，分别命名为ypile-ilvh-002(不含突变点)和ypile-ilvh-003(含突变点)。
[0238]
表6为谷氨酸棒状杆菌固体培养基配方
[0239]
成分配方葡萄糖10g/l氯化钠3g/l磷酸氢二钾2g/l酵母粉5g/l蛋白胨10g/l氯化钾2g/l琼脂粉1.5％
[0240]
重组菌ypile-ilvh-002含有双拷贝的seq id no：1所示的野生型ilvh基因；具体地，重组菌ypile-ilvh-002与谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437相比，仅是在谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437的基因组中上cg0680基因后插入ilvh基因及其启动子(seq id no：8)，保持谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝
ilvh基因的重组菌可以显著和稳定地提高ilvh基因的表达量。
[0241]
重组菌ypile-ilvh-003含有seq id no：5所示的突变基因ilvh
h47l
；具体地，重组菌ypile-ilvh-003是将谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437基因组中的cg0680后插入ilvh
h47l
基因及其启动子(seq id no：9)，保持谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
[0242]
pcr鉴定引物如下所示：
[0243]
p29:5'caactcatca agggagcaat 3'，
[0244]
p30:5'ggggtgcctg tggattcaat 3'，
[0245]
p31:5'cgttcaggac gtagacggaa 3'，
[0246]
p32:5'actacgccgg catcccgggc 3'，
[0247]
实施例6、构建质粒上过表达ilvh基因或ilvh
h47l
基因的工程菌株
[0248]
采用nebuilder重组技术进行载体构建，依据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组序列，设计并合成一对扩增ilvh或ilvh
h47l
基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
[0249]
p33:5'gcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatcccc gccg acattcacga agcc 3'(带下划线的核苷酸序列为pxmj19上的序列)，
[0250]
p34:5'atcaggctgaaaatcttctctcatccgccaaaac gatcttggcc ggagccatg 3'(带下划线的核苷酸序列为pxmj19上的序列)。
[0251]
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌atcc13032和实施例4制备的ypile-ilvh-001为模板，以引物p33/p34进行pcr扩增，获得ilvh基因及其启动子片段671(序列如seq id no：11所示)、ilvh
h47l
基因及其启动子片段671bp(序列如seq id no：12所示)，对扩增产物进行电泳并采用柱式dna凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的dna片段与经ecor i/kpni酶切回收的穿梭质粒pxmj19(购自addgene公司，该质粒上含有氯霉素抗性作为筛选标记)用nebuilder酶(购自neb公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用m13r(-48)(5'agcggataac aatttcacac agga 3')/p34引物pcr鉴定,获得687bp片段为阳性子，将过表达质粒pxmj19-ilvh(含有ilvh基因)、pxmj19-ilvh
h47l
(含有ilvh
h47l
基因)送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。pcr扩增体系：2
×
premix r taq 12.5μl，引物(10pm)各1μl，补ddh2o总体积25μl。
[0252]
pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
[0253]
过表达质粒pxmj19-ilvh(含有ilvh基因)为将ilvh基因及其启动子片段671(序列如seq id no：11所示)替换pxmj19的ecor i/kpni酶切位点间的片段得到的质粒；
[0254]
过表达质粒pxmj19-ilvh
h47l
(含有ilvh
h47l
基因)为将ilvh
h47l
基因及其启动子片段671(序列如seq id no：12所示)替换pxmj19的ecor i/kpni酶切位点间的片段得到的质粒。
[0255]
将测序正确的pxmj19-ilvh(含有ilvh基因)、pxmj19-ilvh
h47l
(含有ilvh
h47l
基因)质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437中，在培养基中进行培养，培养基成分参见表6，对培养产生的单菌落通过引物m13r(-48)(5'agcggataac aatttcacac agga 3')/p34进行pcr鉴定，pcr扩增出含有大小687片段的为阳性菌株，被分别命名为ypile-ilvh-004(含pxmj19-ilvh质粒)和ypile-ilvh-005(含pxmj19-ilvh
h47l
质粒)。
[0256]
实施例7、构建基因组上缺失ilvh基因的工程菌株
[0257]
采用nebuilder重组技术进行载体构建，根据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌atcc13032的基因组序列，合成两对扩增ilvh基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
[0258]
p35:5'cagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctag accaagcaca acttcatggt 3'，
[0259]
p36:5'gcaatcagat taattgctgt gcccaggttt ccgttgttg 3'，
[0260]
p37:5'caacaa cggaaacctg ggc acagcaat taatctgatt gc 3'，
[0261]
p38:5'cagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtaccc agctcggtgt tgccgttctc 3'。
[0262]
构建方法：以谷氨酸棒杆菌atcc13032为模板，分别以引物p35/p36和p37/p38进行pcr扩增，获得ilvh的上游同源臂片段1109bp及ilvh的下游同源臂片段1144bp。
[0263]
对扩增的产物进行电泳并采用柱式dna凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的dna片段与经过xbal i/bamhi酶切后纯化的pk18mobsacb质粒(购自addgene公司，该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记)用nebuilder酶(购自neb公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用p35/p38引物经pcr鉴定获得阳性敲除载体pk18-δilvh，此重组质粒pk18-δilvh中包含δilvh的up-down dna 2215bp(序列如seq id no：13所示)。
[0264]
重组质粒pk18-δilvh为将序列seq id no：13第57-2159位所示的δilvh的up-down dna片段替换pk18mobsacb质粒的xbal i/bamhi酶切位点间的片段得到的质粒。
[0265]
将该质粒送测序，将测序正确的敲除质粒pk18-δilvh电转化入谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437，在培养基中进行培养，培养基成分参见表6，对培养产生的单菌落通过如下引物(上海invitrogen公司合成)进行pcr鉴定：
[0266]
p39:5'acca agcacaactt catggt 3'，
[0267]
p40:5'ccagctcggt gttgccgttc 3'。
[0268]
上述pcr同时扩增出大小2141bp及2660bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出2660bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用p39/p40引物进行pcr鉴定，扩增出大小为2141bp条带的菌株为ilvh基因编码区被敲除的阳性菌株cgmcc no.20437/δilvh。再次通过p39/p40引物pcr扩增阳性菌株ilvh片段，并连接到pmd19-t载体进行测序，将测序正确的菌株命名为ypile-ilvh-006(谷氨酸棒杆菌cgmcc 20437上的基因组上的ilvh基因被敲除)。
[0269]
实施例6、l-缬氨酸发酵实验
[0270]
将上述实施例构建的菌株和原始菌株大肠杆菌cgmcc no.22721在blbio-5gc-4-h型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表7所示的培养基和表8所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，取平均值，结果如表9所示。
[0271]
结果如表8所示，在大肠杆菌cgmcc no.22721中对ilvh及ilvh
h47l
过表达，有助于l-缬氨酸产量及转化率的提高。
[0272]
表7为发酵培养基配方(其余为水)
[0273]
成分配方硫酸铵14g/l
磷酸二氢钾1g/l磷酸氢二钾1g/l硫酸镁0.5g/l酵母粉2g/l硫酸亚铁18mg/l硫酸锰4.2mg/l生物素0.02mg/l维生素b12mg/lantifoam(cb-442)消泡剂)0.5ml/l70％葡萄糖(底糖)40g/l
[0274]
表8为发酵控制工艺
[0275][0276][0277]
表9为l-缬氨酸发酵实验结果
[0278][0279]
实施例7、l-异亮氨酸发酵实验
[0280]
将上述实施例构建的异亮氨酸生产菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌cgmcc no.20437在blbio-5gc-4-h型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以如下所所示的培养基和控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表10所示。
[0281]
l-异亮氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖13g/l，(nh4)2so
4 1g/l，h3po
4 0.5g/l，kcl 0.8g/l，mgso4·
7h2o 0.8g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，fm902酵母粉1.5g/l，玉米浆5g/l，糖蜜17g/l，通氨调节ph7.0.
[0282]
l-异亮氨酸发酵培养条件：
[0283]
校正do 100％：温度p25℃、风量5l/min、转速800rpm、罐压0mpa，5min后标定；
[0284]
接种量10％；
[0285]
初始条件：ph7.0、培养温度p25℃、罐压0mpa、风量0.5l/min、转速400rpm；
[0286]
全程控制：1、溶氧＜30％时，依次提转速500rpm
→
600rpm
→
风量1l/min
→
700rpm
→
800rpm；2、发酵8h提罐压0.01mpa；12h提罐压0.02mpa
→
0.03mpa
→
0.04mpa
→
0.05mpa；
[0287]
残糖控制：f12h前0.1-0.5％；f12h后结合do要求控制残糖0.1-0.3％；
[0288]
流加物料：25％氨水、55％浓糖、10％泡敌；
[0289]
发酵周期：30h左右,控制过程以溶氧20-30％做提降风量标准。
[0290]
表10为l-异亮氨酸发酵实验结果
[0291][0292][0293]
由以上发酵结果可见，对于高产l-异亮氨酸菌株cgmcc no.20437，ilvh基因的氨基酸序列的点突变ilvh
h47l
，有助于l-异亮氨酸产量的提高，ilvh及ilvh
h47l
的过表达均能提高异亮氨酸的产量；ilvh的敲除不利于异亮氨酸的合成。

技术特征：
1.一种ilvh突变蛋白或包含其的融合蛋白，所述ilvh突变蛋白为将乙酰乳酸合酶iii调控亚基ilvh蛋白的第47位氨基酸残基进行突变，得到的蛋白；所述乙酰乳酸合酶iii调控亚基ilvh蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)包含seq id no：2所示氨基酸序列的蛋白质；(a2)来源于细菌且与(a1)具有95％以上同一性且与细菌产氨基酸相关的蛋白质；(a3)将(a1)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与细菌产氨基酸相关的由(a1)衍生的蛋白质。2.生物材料，为如下(c1)-(c6)中任一种：(c1)编码权利要求1所述ilvh突变蛋白的核酸分子；(c2)编码权利要求1所述融合蛋白的核酸分子；(c3)具有(c1)或(c2)所述核酸分子的表达盒；(c4)具有(c1)或(c2)所述核酸分子的重组载体；(c5)具有(c1)或(c2)所述核酸分子的重组微生物；(c6)具有(c1)或(c2)所述核酸分子的重组细胞。3.权利要求1所述ilvh突变蛋白、权利要求1所述融合蛋白、权利要求1中所述ilvh蛋白、或者权利要求2所述生物材料的应用；所述应用为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：(ⅰ)在提高微生物或细胞的氨基酸产量中的应用；(ⅱ)在生产氨基酸中的应用；(ⅲ)在构建生产氨基酸的重组微生物或重组细胞中的应用。4.特定物质的应用；所述应用为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：(ⅰ)在提高细菌氨基酸产量中的应用；(ⅱ)在生产氨基酸中的应用；(ⅲ)在构建生产氨基酸的重组微生物或重组细胞中的应用；所述特定物质为如下(d1)-(d5)中任一种：(d1)用于提高权利要求1所述ilvh突变蛋白或所述融合蛋白的核酸分子表达的物质；(d2)用于提高权利要求1所述ilvh突变蛋白或所述融合蛋白丰度的物质；(d3)用于提高权利要求1所述ilvh突变蛋白或所述融合蛋白的活性的物质；(d4)用于提高权利要求1或2中所述ilvh蛋白的丰度的物质；(d5)用于提高权利要求1或2中所述ilvh蛋白的活性的物质。5.一种重组微生物或重组细胞，是在微生物或细胞中过表达权利要求1或2所述ilvh突变蛋白或融合蛋白的核酸分子或权利要求1或2中所述ilvh蛋白的核酸分子得到的。6.权利要求5所述重组微生物或重组细胞在制备氨基酸中的应用。7.一种提高微生物或细胞的氨基酸产量的方法，包括如下步骤：将微生物或细胞的基因组中编码ilvh蛋白的核酸分子替换为编码权利要求1所述ilvh突变蛋白或其融合蛋白的核酸分子。8.一种提高微生物或细胞的氨基酸产量的方法，包括如下任一步骤：
e1)在微生物或细胞中过表达权利要求1所述ilvh突变蛋白或其融合蛋白的核酸分子；e2)提高微生物或细胞中权利要求1所述ilvh突变蛋白或其融合蛋白的丰度；e3)提高微生物或细胞中权利要求1所述ilvh突变蛋白或其融合蛋白的活性；e4)在微生物或细胞中过表达权利要求1中所述ilvh蛋白的核酸分子；e5)提高微生物或细胞中权利要求1中所述ilvh蛋白的丰度；e6)提高微生物或细胞中权利要求1中所述ilvh蛋白的活性。9.权利要求1所述ilvh突变蛋白或其融合蛋白或权利要求1或2中所述ilvh蛋白在调控微生物或者细胞的氨基酸产量中的应用。10.权利要求1所述突变蛋白或其融合蛋白或权利要求2中所述生物材料在制备含有氨基酸的食品、化妆品或医药中的应用。

技术总结
本发明公开了乙酰乳酸合酶III调控亚基编码基因ilvH和其突变体及其生产L-氨基酸中应用。本发明提供了ilvH突变蛋白或包含其的融合蛋白；所述ilvH突变蛋白为将乙酰乳酸合酶III调控亚基ilvH蛋白的第47位氨基酸残基进行突变，得到的蛋白；本发明的实验证明，在谷氨酸棒状杆菌中，谷氨酸棒状杆菌乙酰乳酸合酶III调控亚基编码基因ilvH的过表达及点突变能提高其L-异亮氨酸的产量；同时，ilvH基因在大肠杆菌中的过表达及点突变能提高大肠杆菌中L-缬氨酸的产量。氨酸的产量。


技术研发人员：杨立鹏 魏爱英 孟刚 赵春光 毕国东 张英 蔡卫卫
受保护的技术使用者：宁夏伊品生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/8/9