一种抑制奥秘克戎Nsp13基因的siRNA及其应用的制作方法

一种抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna及其应用
技术领域：
：1.本发明涉及一种抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna及其应用，属于生物医药
技术领域：
：。
背景技术：
：：2.新型冠状病毒sars-cov-2，由该病毒引起的疾病被称为covid-19。新型冠状病毒主要通过直接接触、飞沫以及气溶胶途径传播。就健康影响而言，新型冠状病毒感染可影响身体的多个器官，包括肾脏、心脏和肺部。新型冠状病毒感染的临床表现通常为发烧、头痛、乏力等。严重者可出现高热昏厥、器官衰竭，甚至死亡。虽然部分患者可以治愈，但也有一些感染者可能出现不可逆的终生后遗症，如脑神经系统损伤、心脏损伤等，部分患者还会出现肺纤维化症状。3.新型冠状病毒非结构蛋白nsp13是一种高度进化保守的解旋酶和rna5’‑三磷酸酶，它利用核苷三磷酸水解产生的能量沿核酸方向移动，促进双链核酸的解链，在病毒复制过程中发挥至关重要的作用。同时，nsp13还参与了病毒rna的封盖，这可以保护它免受人类免疫系统的攻击。新型冠状病毒疫苗使免疫系统做好对抗病毒的准备，而抗病毒药物则通过干扰病毒机制的一个重要部分来治疗已经开始的感染。结合其已建立的核苷酸结合位点和药物形成，nsp13是开发泛冠状病毒疗法最有希望的候选靶点之一。虽然已经获得了不少新型冠状病毒nsp13的信息，但针对这一靶点的药物开发还相对缺乏，目前还没有针对该靶点的药物上市销售。4.在covid-19的药物治疗方面，nematavir和ritonavir片剂(辉瑞的口服抗病毒药物，销售名为paxlovid)被广泛用于住院风险最高的轻中度covid-19患者。世界卫生组织(who)称paxlovid是迄今为止高危患者的最佳治疗选择，并强烈建议将paxlovid用于病情严重且住院风险最高的非重症covid-19患者，如未接种疫苗的患者、老年人或免疫功能受损患者。此外，世卫组织更新了对吉利德抗病毒药物瑞德西韦(remdesivir)的建议，有条件地向有住院高风险的非重症患者推荐该药物。取代了之前的建议，即有条件地不向任何covid-19患者推荐瑞德西韦。此外，redesivir用于重症和危重症患者的建议正在根据新的证据进行更新。5.近年来，基因治疗研究取得了显著进展，已成为治疗癌症的有效方法。其中，rnai是一种利用rna等核酸分子抑制基因表达的有效方法。rnai因其特异性强、操作简单、效率高等特点，在基因功能研究、基因治疗和药物筛选等方面发挥着重要作用。被发现以来，rnai在治疗疾病方面表现出了巨大的前景，并为开发新的分子治疗药物提供了希望，这些药物可以干扰致病基因，特别是那些编码非药物靶点的基因，这些非药物靶点是传统疗法难以实现的。到目前为止，越来越多的研究证实sirna干扰在癌症、病毒感染等疾病的治疗中具有广阔的应用前景。技术实现要素：6.为解决上述技术问题，本发明提供一种干扰新型冠状病毒的sirna。7.本发明的第一个目的是提供一种抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna，所述的sirna的正义链的序列为5’‑ccaccacuuaaccgaaauuaugu-3’(ss)，反义链的序列为5’‑auaauuucgguuaaguggugguc-3’(as)。8.本发明中的sirna特异性靶向2019-ncov的nsp13基因。在本发明中，2019-ncov-nsp13，特异性指奥秘克戎ba.1毒株和奥秘克戎ba.2毒株，其余同源性高的毒株不一一列举。9.进一步地，所述的sirna还包括对其正义链和/或反义链进行化学修饰。10.进一步地，所述的化学修饰包括硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰中的一种或多种。11.进一步地，所述化学修饰是将sirna的正义链从5’端起第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21位碱基中核糖c-2’的羟基替换为氟原子，第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20位碱基中核糖c-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖；并将sirna的反义链从5’端起第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21位碱基中核糖c-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖。12.进一步地，所述化学修饰是将sirna的正义链从5’端起第2、3、4、5、6、7、17、18、19、20、21位的磷酸进行硫代修饰，反义链不进行化学修饰。13.进一步地，所述化学修饰是将sirna的正义链从5’端起第1、2、4、5、7、8、9、12、13、18、19、21、23位碱基中核糖c-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖；sirna的反义链从5’端起第2、22位碱基中核糖c-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖。14.本发明第二方面提供了sirna在制备治疗新型冠状病毒感染的核酸药物中的应用。15.进一步地，所述的sirna通过递送载体包裹制备成药物。16.进一步地，所述的药物通过雾化或静脉注射进行给药。17.本发明的有益效果是：18.本发明公开了一对特异性干扰新型冠状病毒的sirna，并提供了三种有效的化学修饰方法，可有效敲降2019-ncov-omicro-ba.1/ba.2的nsp13基因，可作为抗新型冠状病毒药物开发的有效靶点，为抗2019-ncov-omicro-ba.1/ba.2病毒提供有效的技术手段。附图说明：19.图1是nsp13基因在2019-ncov-omicro-ba.1/ba.2基因组中的位置；20.图2是化学修饰结构式；21.图3是构建nsp13基因表达的质粒图谱；22.图4是萤火虫荧光素酶结构；23.图5是抑制nsp13基因表达的统计图；24.图6是ss1+as1电泳跑胶图。具体实施方式25.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。26.实施例1：2019-ncov-omicro-ba.1/ba.2nsp13基因sirna的设计27.我们选取开放阅读框orf1a中nsp13基因区域(图1)，下载ba.1和ba.2的序列，去除易突变区域，选取ba.1和ba.2的共同保守区域序列(seqidno.1所示)。设计sirna，设计时不以5’非翻译区和3’非翻译区及起始密码子附近的序列作为设计sirna的模板，最终设计了特异性序列。通过对序列的碱基分析，我们设计了sirna的化学修饰方法(图2)，通过筛选后，最终确定序列ss1、as1、ss2、as2、ss3、as3(表1)。通过核酸合成仪，采用固相合成的方法，得到sirna的粗产物，粗产物经aktaexplorer100纯化得到最终产物。28.表129.序号序列(5‘‑3’)注释ssccaccacuuaaccgaaauuaugu/asauaauuucgguuaaguggugguc/ss1cfcoafcocfaocfuoufaoafcocfgoafaoafuoufaoufgu‘o’为甲氧基修饰；‘f’为氟代修饰as1aouaoauouuocgoguouaoagougoguoggouc‘o’为甲氧基修饰ss2cc*a*c*c*a*c*uuaaccgaaa*u*u*a*u*gu‘*’为硫代修饰as2auaauuucgguuaaguggugguc/ss3cocoacocoacououoaacocogaaauouoauoguo‘o’为甲氧基修饰as3auoaauuucgguuaaguggugguoc‘o’为甲氧基修饰30.实施例2：体外构建nsp13基因31.以2019-ncov-omicro-ba.1/ba.2nsp13基因为目的序列，构建入vbultrastable质粒中，nsp13基因两端连接sall酶和xhol酶切位点，质粒图谱见图3。经酶切测序分析，质粒的构建及nsp13序列与预期相符。取甘油菌100ul到150ml液体培养基中，按比例加入amp，37℃震荡过夜。32.质粒抽提：33.1)菌液12000rpm离心1min，弃上清；34.2)向菌体沉淀假如7.5mlbufferp1，震荡混匀；35.3)加入7.5mlbufferp2，温和上下颠倒6-8次，室温放置5min；36.4)悬液中加入7.5mlbufferp4，上下混匀，出现白色沉淀，10000rpm离心10min，小心吸取上清到新的50ml离心管；37.5)加入0.1倍体积的内毒素清除剂到上清中，颠倒混匀，冰浴5min；38.6)室温放置10min，12000rpm离心10min，将含有dna的上层水相转移到新管，弃油状层；39.7)加入0.5倍体积的异丙醇，混匀，转移入吸附柱子中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；40.8)加入10ml漂洗液pw，12000rpm离心1min，弃废液，重复一次；41.9)离心管空转3min，彻底弃去残留的液体，室温晾干5min；42.10)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间滴加2ml灭菌注射用水，室温放置3min，10000rpm离心3min，收集质粒液体；43.11)质粒定量并稀释到相应浓度，-20℃分装保存备用。44.实施例3：萤火虫荧光素酶测定45.1)质粒和ss1+as1、质粒和ss2+as2、质粒和ss3+as3分别共转染cnez2细胞；46.2)24-48h后，弃去培养基，加入报告基因细胞裂解液；47.3)充分裂解后，12000g离心5min，取上清待测定；48.4)开启化学发光仪，测定间隔设为2s，测定时间设为10s；49.5)上清取100ul，加入酶标板中，再加入100ul萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀，读数。50.6)实验结果51.我们直接读取萤火虫荧光素酶的值，通过该的值的高低指示nsp13表达的水平，继而得出sirna沉默靶标的效果，即rna敲降效率。图4得到，当质粒与sinc(对照)共转染时，荧光值非常高，质粒与ss1+as1、ss2+as2或ss2+as2共转染时，荧光值远低于对照组，只有不到10％的表达量，当质粒与e-siluci(lusiferase的sirna)共转时，阳性对照组的荧光值非常低。这证明，ss1+as1、ss2+as2或ss3+as3敲降nsp13基因的效果显著。52.实施例4：实时荧光定量pcr测定53.1)质粒和sirna共转染方法参照实施例3；54.2)细胞培养液去除干净，每孔加500ulpbs润洗细胞，弃掉，2次；55.3)每孔加350ul裂解液rl，吹打细胞后，转移到过滤柱cs上，12000rpm×2min，收集滤液；56.4)向滤液中加350ul70％乙醇，混匀，混合液转移到吸附柱cr3中，12000rpm×1min，弃废液，吸附柱放回收集管中；57.5)吸附柱cr3中加入350ul去蛋白液pw1，12000rpm×1min，弃废液，吸附柱放回收集管中；58.6)吸附柱中加入80uldnasei，室温静置15min；59.7)吸附柱cr3中加入350ul去蛋白液pw1，12000rpm×1min，弃废液，吸附柱放回收集管中；60.8)吸附柱中加入500ul漂洗液rw，12000rpm×1min，弃废液，吸附柱放回收集管中，重复2次；61.9)2000rpm×1min，掉到残余废液。室温晾干吸附柱5min；62.10)吸附柱正中央滴加30uldepc水，室温放置2min，12000rpm×2min；63.11)定量。64.12)实验结果65.图5得到，ss1+as1、ss2+as2、ss3+as3和阳性组分别于sinc阴性对照组作比较，其中ss1+as1表达量较sinc只有13.3％，ss2+as2表达量较sinc只有46.5％，ss3+as3表达量较sinc只有62.5，阳性组表达量较sinc只有约25.0％。结果显示，这证明，ss1+as1、ss2+as2、ss3+as3敲降nsp13基因mrna的效果非常显著。66.实施例5：ss1+as1血清酶解验证67.1)取0.2mlpcr管，分别加入400ngss1+as1与0.5ul胎牛血清，用depc水补足5ul，37℃分别放置n小时，n＝72h、48h、24h、6h、4h、2h、0h；68.2)未化学修饰的ss+as的操作同上；69.3)跑电泳：向pcr小管中加至少1ul的6*loadingbuffer，混匀，上样，140v，15min；70.4)拍照；71.5)实验结果72.由图6得到，化学修饰的ss1+as1在血清中72h时，依然有部分存在未降解，显示出良好的抗酶解能力。ss+as在24h时全部讲解，其中ss+as0h泳道在跑胶过程中就发生快速降解了。73.综上所示，本发明提供的ss+as、ss1+as1、ss2+as2和ss3+as3，抑制了2019-ncov-omicro-ba.1/ba.2nsp13基因的表达；该序列经过化学修饰后，ss1+as1、ss2+as2和ss3+as3，还显著的提高了血清中的抗酶解能力，并且几乎没有细胞毒性。该三条序列可以用于体内、体外实验。本发明序列可作为抗新型冠状病毒药物开发的有效靶点，为抗2019-ncov-omicro-ba.1/ba.2病毒提供有效的技术手段。74.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本
技术领域：
：的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna，其特征在于，所述的sirna的正义链的序列为5
’‑
ccaccacuuaaccgaaauuaugu-3’，反义链的序列为5
’‑
auaauuucgguuaaguggugguc-3’。2.根据权利要求1所述的抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna，其特征在于，所述的sirna还包括对其正义链和/或反义链进行化学修饰。3.根据权利要求2所述的抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna，其特征在于，所述的化学修饰包括硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰中的一种或多种。4.根据权利要求2所述的抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna，其特征在于，所述化学修饰是将sirna的正义链从5’端起第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21位碱基中核糖c-2’的羟基替换为氟原子，第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20位碱基中核糖c-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖；并将sirna的反义链从5’端起第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21位碱基中核糖c-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖。5.根据权利要求2所述的抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna，其特征在于，所述化学修饰是将sirna的正义链从5’端起第2、3、4、5、6、7、17、18、19、20、21位的磷酸进行硫代修饰，反义链不进行化学修饰。6.根据权利要求2所述的抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna，其特征在于，所述化学修饰是将sirna的正义链从5’端起第1、2、4、5、7、8、9、12、13、18、19、21、23位碱基中核糖c-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖；sirna的反义链从5’端起第2、22位碱基中核糖c-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖。7.权利要求1～6任一项所述的抑制奥秘克戎nsp13基因的sirna在制备治疗新型冠状病毒感染的核酸药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的sirna通过递送载体包裹制备成药物。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物通过雾化或静脉注射进行给药。

技术总结
本发明公开了一种抑制奥秘克戎Nsp13基因的siRNA及其应用。本发明序列是针对2019-nCOV的Nsp13基因，可有效抑制新型冠状病毒复制时RNA解螺旋酶的功能。其中SS1的部分磷酸有硫代修饰。其中SS2的部分核糖有2


技术研发人员：李萍 徐维勇 蒙羽涵
受保护的技术使用者：硅羿科技（上海）有限公司
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/8/9