一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法

1.本发明属于生物工程技术领域，涉及一种构建高产生物活性物质吩嗪-1-羧酸的工程菌株的方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.当今社会全球人口迅速增长，粮食供应面临巨大压力。同时粮食的生产受到各种病菌、虫害的严重威胁，人们不得不施用大量的农药来控制农业病菌、虫害。目前施用的农药大部分是化学合成农药，虽然防治效果不错，但存在污染生态环境、不易降解等特点，不符合现代社会可持续发展的理念。生物农药是一类来源于自然界的天然抗菌杀虫剂，与化学农药相比，生物农药具有毒性低、对环境友好和不易产生抗药性等明显优势，已经吸引了越来越多学者的关注并逐渐应用到生物防治实践当中。吩嗪-1羧酸就是近年来发现的生物农药的优秀代表，1％的吩嗪-1-羧酸悬液对水稻纹枯病、水稻稻曲病、水稻稻瘟病、小麦赤霉病、黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、西瓜枯萎病、辣椒疫病等具有良好的防治效果。而且在环境中可降解。由于以上特点，吩嗪-1羧酸在2011年被中国农业部授予农药证书，并被命名为“申嗪霉素”。
4.目前吩嗪-1-羧酸生产方法虽有化工方法，但条件苛刻，并且向环境释放有毒有害物质，所以主要由假单胞菌中的铜绿假单胞菌生产，但铜绿假单胞菌则是目前医院中一种比较常见的机会致病菌，并不太适合作为生产菌株来推广应用，发明人前期工作(专利cn112126611a)中通过基因工程方法获得了在48h能够生产吩嗪-1-羧酸7854mg/l的工程菌株qpca-7。但发酵效价依然不高。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法。以高产吩嗪-1羧酸的qpca-7作为出发株，通过陆续敲除新近发现的对吩嗪-1-羧酸具有负调控作用的gspc、algb等基因，将菌株吩嗪-1-羧酸的生产能力提升到10859.3mg/l。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供了一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株，所述工程菌株是敲除工程菌株qpca-7基因组中gspc基因和/或algb基因而得；
8.所述工程菌株qpca-7是敲除绿针假单胞菌qlu-1基因组中的phzo基因、lon基因、rsme基因、psra基因、pars基因、rpea基因和pykf基因中的一个或多个而得；
9.所述绿针假单胞菌qlu-1的保藏编号为cctcc no：m 2020108。
10.本发明通过基因工程手段，提高了菌株吩嗪-1-羧酸的发酵效价，降低了吩嗪-1-羧酸的生产成本。
11.本发明的第二个方面，提供了一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，包括：
12.敲除工程菌株qpca-7基因组中gspc基因和/或algb基因，即得。
13.在一些实施例中，敲除工程菌株qpca-7基因组中gspc基因的具体步骤包括：
14.采用pcr钓取并连接gspc基因的上下游片段，得到gspc-ud片段；
15.将所述gspc-ud片段连接质粒pk18mobsacb构建gspc基因敲除质粒pk18-gspc-ud；
16.将所述gspc基因敲除质粒pk18-gspc-ud导入大肠杆菌s17-1(λ)，再与绿针假单胞菌qpca-7进行双亲杂交培养，
17.筛选阳性克隆，即得敲除gspc基因的菌株qpca-8。
18.在一些实施例中，敲除工程菌株qpca-7基因组中algb基因的具体步骤包括：
19.采用pcr钓取并连接algb基因的上下游片段，得到algb-ud片段；
20.将所述algb-ud片段连接质粒pk18mobsacb构建algb基因敲除质粒pk18-algb-ud；
21.将所述algb敲除质粒pk18-algb-ud导入大肠杆菌s17-1(λ)，再与绿针假单胞菌qpca-7进行双亲杂交培养，
22.筛选阳性克隆，即得敲除algb基因的菌株。
23.本发明的有益效果
24.(1)本发明以高产吩嗪-1羧酸的qpca-7作为出发株，通过陆续敲除新近发现的对吩嗪-1-羧酸具有负调控作用的gspc、algb等基因，将菌株吩嗪-1-羧酸的生产能力提升到10859.3mg/l。
25.(2)本发明利用kb培养基发酵，产量达到10859.3mg/l，大大提高了菌株的产能，为后续工程菌株的工业化提供了坚实基础。
26.(3)本发明构建方法简单、实用性强，易于推广。
附图说明
27.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
28.图1为本发明实施例1中突变质粒pk18-gspc-ud构建电泳图；
29.图2为本发明实施例1中gspc基因双亲杂交双抗性平板筛选；
30.图3为本发明实施例1中影印法筛选gspc基因双交换阳性单克隆；
31.图4为本发明实施例1中不同菌株吩嗪-1羧酸产量。
具体实施方式
32.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
33.一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，包括：
34.以高产吩嗪-1羧酸的qpca-7作为出发株，通过陆续敲除新近发现的对吩嗪-1-羧酸具有负调控作用的gspc、algb等基因，将菌株吩嗪-1-羧酸的生产能力提升到10859.3mg/l。
35.以gspc基因的无痕敲除为例介绍基因操作。
36.利用试剂盒提取qpca-7基因组；
37.在已经测序的qlu-1基因组序列中搜索gspc基因及其序列上下游序列，并通过pcr钓取并连接gspc基因的上下游片段:gspc-ud；
38.通过限制性内切酶酶切连接技术将gspc-ud片段连接质粒pk18mobsacb构建gspc基因敲除质粒pk18-gspc-ud；
39.通过热击转化将pk18-gspc-ud导入大肠杆菌s17-1(λ)；
40.将绿针假单胞菌qpca-7与大肠杆菌s17-1(λ)共同培养后涂布于kb(a
+k+
)双抗平板后挑选单菌落；
41.将单菌落涂布于含氨苄霉素的15％蔗糖kb平板，通过pcr筛选并验证qpca敲除gspc基因的菌株qpca-8；
42.在一些实施例中，所述gspc基因的序列如seq id no.1所示。
43.在一些实施例中，gspc基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.2所示。
44.在一些实施例中，gspc基因敲除引物包括：gspc-f1、gspc-r1、gspc-f2、gspc-r2，序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。
45.在一些实施例中，所述algb基因的序列如seq id no.7所示。
46.在一些实施例中，algb基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.8所示。
47.在一些实施例中，algb基因敲除引物包括：algb-f1、algb-r1、algb-f2、algb-r2，序列分别如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12所示。
48.在一些实施例中，通过相同方法在qpca-7基因组中相继敲除负调控基因gspc、algb后获得高产pca菌株qpca-9(gspc、algb基因双敲除株)，发酵后，利用乙酸乙酯提取后hplc检测，发现qpca-9在48h时可以产生10859.3mg/l的吩嗪-1-羧酸，为进一步大规模发酵生产奠定了基础。
49.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
50.qlu-1是一株可以生产吩嗪-1羧酸、2-羟基吩嗪等绿针假单胞菌，发明人前期工作(专利cn112126611a)中，以qlu-1为出发菌株，首先在敲除了修饰基因phzo获得菌株qpca，使菌株中催化pca转化成2-羟基吩嗪的phzo酶失活，菌株专一性积累pca，之后在菌株qpca基础上，先后在其基因组上敲除具有负调控作用的lon、rsme、psra、pars、rpea、pykf等基因获得在48h能够生产吩嗪-1-羧酸7854mg/l的工程菌株qpca-7。
51.以下实施例中，以专利cn112126611a中获得的工程菌株qpca-7作为出发菌株，通过陆续敲除新近发现的对吩嗪-1-羧酸具有负调控作用的gspc、algb等基因，将菌株吩嗪-1-羧酸的生产能力提升到10859.3mg/l。
52.实施例1
53.gspc基因敲除的具体步骤。
54.1、将来源于绿针假单胞菌qlu-1的绿针假单胞菌菌株qpca-7接种进lb(a
+
)培养基，30℃下摇床180rpm提取荡培养过夜，利用基因组提取试剂盒提取qpca-7的基因组，-20℃下保藏备用。
55.2、在已经测序的qlu-1基因组数据中搜索gspc基因及其基因上下游序列，利用qpca-7菌株基因组为模板，以gspc-f1/gspc-r1，gspc-f2/gspc-r2分别为引物扩增gspc基
因的上游片段gspc-u及线下游片段gspc-d；以gspc-u及gspc-d为模板，gspc-f1/gspc-r1为模板扩增gspc上下游融合片段gspc-ud(图1)；
56.3、将融合片段gspc-ud通过酶切连接的方法与敲除质粒pk18mobsacb构建重组质粒pk18-gspc-ud；
57.4、将重组质粒pk18-gspc-ud通过热击转化的方式导入大肠杆菌s17-1(λ)；
58.5、将大肠杆菌s17-1(λ)与假单胞菌qpca-7进行双亲杂交培养，将重组质粒pk18-gspc-ud导入假单胞菌qpca-7；
59.6、通过蔗糖平板筛选(图2)、影印筛选(图3)及pcr筛选等方法共同筛选qpca-7gspc敲除株，即：敲除了gspc基因(qpca-7
△
gspc)，获得菌株qpca-8；
60.本发明在qpca-8基础上继续敲除了algb基因(qpca-7
△
gspc
△
algb)，获得菌株qpca-9，发酵后经hplc检测，发酵液中积累的吩嗪-1-羧酸有所提高(图4)，菌株qpca-9在48h能够生产吩嗪-1-羧酸10859.3mg/l。
61.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株，其特征在于，所述工程菌株是敲除工程菌株qpca-7基因组中gspc基因和/或algb基因而得；所述工程菌株qpca-7是敲除绿针假单胞菌qlu-1基因组中的phzo基因、lon基因、rsme基因、psra基因、pars基因、rpea基因和pykf基因中的一个或多个而得；所述绿针假单胞菌qlu-1的保藏编号为cctcc no：m 2020108。2.如权利要求1所述的吩嗪-1-羧酸高产工程菌株，其特征在于，所述gspc基因的序列如seq id no.1所示。3.如权利要求1所述的吩嗪-1-羧酸高产工程菌株，其特征在于，所述algb基因的序列如seq id no.7所示。4.一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，其特征在于，包括：敲除工程菌株qpca-7基因组中gspc基因和/或algb基因，即得。5.如权利要求4所述的吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，其特征在于，敲除工程菌株qpca-7基因组中gspc基因的具体步骤包括：采用pcr钓取并连接gspc基因的上下游片段，得到gspc-ud片段；将所述gspc-ud片段连接质粒pk18mobsacb构建gspc敲除质粒pk18-gspc-ud；将所述gspc基因敲除质粒pk18-gspc-ud导入大肠杆菌s17-1(λ)，再与绿针假单胞菌qpca-7进行双亲杂交培养，筛选阳性克隆，即得敲除gspc基因的菌株qpca-8。6.如权利要求4所述的吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，其特征在于，gspc基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.2所示。7.如权利要求4所述的吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，其特征在于，gspc基因敲除引物包括：gspc-f1、gspc-r1、gspc-f2、gspc-r2，序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。8.如权利要求4所述的吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，其特征在于，敲除工程菌株qpca-7基因组中algb基因的具体步骤包括：采用pcr钓取并连接algb基因的上下游片段，得到algb-ud片段；将所述algb-ud片段连接质粒pk18mobsacb构建algb基因敲除质粒pk18-algb-ud；将所述algb敲除质粒pk18-algb-ud导入大肠杆菌s17-1(λ)，再与绿针假单胞菌qpca-7进行双亲杂交培养，筛选阳性克隆，即得敲除algb基因的菌株。9.如权利要求4所述的吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，其特征在于，algb基因上下游融合片段的碱基序列如seq id no.8所示。10.如权利要求4所述的吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法，其特征在于，algb基因敲除引物包括：algb-f1、algb-r1、algb-f2、algb-r2，序列分别如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12所示。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株吩嗪-1-羧酸高产工程菌株的构建方法。以高产吩嗪-1羧酸的QPCA-7作为出发株，通过陆续敲除新近发现的对吩嗪-1-羧酸具有负调控作用的GspC、Algb等基因，将菌株吩嗪-1-羧酸的生产能力提升到10859.3mg/L。力提升到10859.3mg/L。力提升到10859.3mg/L。


技术研发人员：梁晓丽 曹宇飞 谭舒雅 刘开泉 赵彦 李玲 徐衍鹏 张淑玥 聂士昊 顾杰瑞
受保护的技术使用者：齐鲁工业大学（山东省科学院）
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/8/9