一种研究血管生成拟态的肝癌动物模型的构建方法

1.本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种研究血管生成拟态的肝癌动物模型的构建方法。


背景技术：

2.血管生成拟态(vasculogenicmimicry,vm)是一种肿瘤血管的生成方式。与传统的由内皮细胞组成的血管内壁不同，血管生成拟态的管腔由细胞外基质蛋白和肿瘤细胞构成，且与肿瘤的微循环系统相连。血管生成拟态是为早期肿瘤供给营养的结构，其不稳定的管腔也是促成肿瘤细胞逃逸，导致肿瘤转移的原因之一。建立稳定的、能够模拟血管生成拟态的肝癌动物模型对于了解肝癌发病机制、抗肿瘤药物筛选、挖掘新的治疗手段有很重要的意义。
3.目前，肝癌小鼠实验的造模方法主要分为转基因致瘤、化学诱导成瘤和肿瘤移植三种。肿瘤移植凭借易于获取的种植物、简便的操作和相对较短的成瘤时间，成为最常使用的肝癌动物实验造模方法。使用h22肝癌细胞株进行小鼠皮下移植成瘤是中国目前最常见的肝癌药理试验研究模型。然而此种造模方法存在如下缺陷：
①
肿瘤表面结痂坏死，镜下见弥漫性出血和炎症细胞浸润，破坏了血管生成拟态结构，影响对血管生成拟态结构的观察；
②
来源于腹水的h22肝癌细胞株夹杂着如间皮细胞、淋巴细胞、红细胞等容易造成种植物的不均一；
③
肿瘤生长迅速侵犯动物福利，违反动物伦理要求，迫使科研工作者不得不寻找可替代的模型，大大降低实验效率；
④
产生转移性腹水阻碍对治疗血管生成拟态药物的研究。


技术实现要素：

4.为此，本发明实施例提供一种研究血管生成拟态的肝癌动物模型的构建方法，该方法能在减轻动物负担的前提下，在体表完成动物模型的建立，并尽可能地保护血管生成拟态结构不被破坏，具有肝癌组织质量高、持续时间长、模型稳定，可重复性高的优点。
5.为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
6.一种研究血管生成拟态的肝癌动物模型的构建方法，所述方法包括：将肝癌细胞接种到小鼠腋下，选择生长良好而无变性坏死、呈粉色的瘤组织；将所述瘤组织切成边长为4-5mm的瘤组织块；将所述瘤组织块植入到小鼠腋下；对植入瘤组织的小鼠进行喂养，2-4天，得到肝癌动物模型。
7.进一步地，所述肝癌细胞为h22细胞。
8.进一步地，所使用的小鼠为spf级icr小鼠。
9.进一步地，所述小鼠的体重为20
±
2g，周龄为6～8周。
10.h22细胞为小鼠肝癌腹水瘤细胞，基本上采用细胞悬液注射法成瘤，但此方法建立的肿瘤存在肿瘤表面坏死结痂、肿瘤生长迅速、短时间内产生转移性腹水等问题。本发明首次将h22细胞以瘤块的形式建立肝癌模型，规避了传统造模方法产生的问题，并摸索出最佳瘤块种植体积以进行肝癌血管生成拟态的研究。另外，以往瘤块种植模型一般使用免疫缺
陷小鼠，其建立过程需要剖开小鼠腹部，将肝癌瘤块放置并固定于肝脏原位。本发明仅需在小鼠腋下形成小切口，顺着切口将瘤块送入腋下即完成了造模过程。相比原位瘤块种植法，本发明操作简便、实验效率高，减少了小鼠术后死亡的风险。
11.在一些具体的实施例中，所述方法包括如下步骤：
12.s1：复苏h22细胞，并于小鼠腹腔培养；
13.s2：待小鼠腹部膨隆，取第二代淡黄色腹水，稀释细胞至1
×
107个/ml；
14.s3：75％酒精消毒小鼠的右侧腋下皮肤；
15.s4：吸取0.2ml细胞悬液注射于右侧腋后皮下；
16.s5：植瘤后7-11天，将小鼠脱臼处死，并选出生长良好而无变性坏死、呈粉色的瘤组织；
17.s6：用手术刀将符合条件的瘤组织切成边长约4-5mm的小块，并浸泡于冷冻的生理盐水中；
18.s7：用动物剃毛器将小鼠右侧腋下的毛发剃去；
19.s8：75％酒精消毒受体小鼠的右侧腋下；
20.s9：用眼科剪剪开提拉部位的皮肤，形成—个长为0.6-0.8cm的小口；
21.s10：夹紧眼科镊子从小口插入，捣向腋下方向，松解皮肤与胸膜之间的粘连；
22.s11：用无钩眼科镊子夹取小块，将瘤块沿切口送入腋下；
23.s12：将小鼠放于饲养盒内喂养，观察2-4天，皮下瘤块无消退迹象即为造模成功。
24.进一步地，步骤s9-s11的步骤需要双人操作。
25.本发明实施例具有如下优点：
26.1、本发明采取瘤块种植法，挑选的肿瘤组织且统一切割为边长4-5mm的正方形大小，保证了种植物的稳定性，排除了因种植物的不均一而造成的瘤块大小和质量差异大的因素。
27.2、本发明建立的模型在造模15天内肿瘤没有出现坏死结痂，也没有形成转移性腹水，减轻了动物的痛苦，符合动物伦理的要求。
28.3、本发明形成的肿瘤组织，其血管生成拟态在镜下能够明确观察，模拟血管生成拟态在肝癌中的生长特性。
29.4、本发明建立的模型瘤块生长稳定，能延长实验周期观测药物的治疗及毒副作用，便于全方位评估药物的疗效及安全性。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
31.图1为本发明提供的肿瘤组织的生长趋势对比图；
32.图2为本发明提供的肿瘤组织表面坏死结痂的图像；
33.图3为本发明提供的肿瘤组织表面坏死结痂率；
34.图4为本发明提供的肿瘤组织用he染色后的病理形态(放大倍数：20x)；
35.图5为本发明提供的肿瘤组织经cd34-pas染色后的代表性图像(放大倍数：40x)，其中，黄色箭头指向血管生成拟态结构，红色箭头指向内皮依赖血管结构。
具体实施方式
36.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.实施例1
38.本实施例提供一种研究血管生成拟态的肝癌动物模型的构建方法：
39.s1：复苏h22细胞，并于体重为20
±
2g，周龄为6～8周，spf级icr小鼠腹腔培养；
40.s2：待小鼠腹部膨隆，取第二代淡黄色腹水，稀释细胞至1
×
107个/ml；
41.s3：75％酒精消毒小鼠的右侧腋下皮肤；
42.s4：吸取0.2ml细胞悬液注射于右侧腋后皮下；
43.s5：植瘤后8天出生长良好而无变性坏死、呈粉色的瘤组织(瘤体积约50-100mm3)；
44.s6：用手术刀将符合条件的肿瘤组织切成边长约4-5mm的小块，并浸泡于冷冻的生理盐水中；
45.s7：用动物剃毛器将体重为20
±
2g，周龄为6～8周，spf级icr小鼠右侧腋下的毛发剃去；
46.s8：75％酒精消毒受体小鼠的右侧腋下；
47.s9：用眼科剪剪开提拉部位的皮肤，形成—个长约0.7cm的小口；
48.s10：夹紧眼科镊子从小口插入，捣向腋下方向，松解皮肤与胸膜之间的粘连；
49.s11：用无钩眼科镊子夹取s6的小块，将瘤块沿切口送入腋下；
50.s12：将小鼠放于饲养盒内喂养。观察2-4天，皮下瘤块无消退迹象即为造模成功。
51.步骤s9-s11中所述操作方法需要双人操作。
52.对比例1
53.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法为细胞悬液注射法，动物为spf级km小鼠，其包括如下步骤：
54.s1：复苏h22细胞，并于体重为20
±
2g，周龄为6～8周，spf级km小鼠腹腔培养；
55.s2：待小鼠腹部膨隆，取第二代淡黄色腹水，稀释细胞至1
×
107个/ml；
56.s3：75％酒精消毒小鼠的右侧腋下皮肤；
57.s4：吸取0.2ml细胞悬液注射于右侧腋后皮下；
58.s5：将小鼠放于饲养盒内喂养，等待瘤块生成。当小鼠因肿瘤压迫而出现影响正常活动的表现或任何侵犯动物福利的情况时，立即给予安乐死。
59.对比例2
60.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至7.5
×
106个/ml。
61.对比例3
62.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2
中，稀释细胞至5
×
106个/ml。
63.对比例4
64.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至2.5
×
106个/ml。
65.对比例5
66.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至2
×
106个/ml。
67.对比例6
68.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至1.5
×
106个/ml。
69.对比例7
70.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至1
×
106个/ml。
71.对比例8
72.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至5
×
105个/ml。
73.对比例9
74.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至4
×
106个/ml；步骤s4中，细胞悬液的注射量为0.1ml。
75.对比例10
76.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至3
×
106个/ml；步骤s4中，细胞悬液的注射量为0.1ml。
77.对比例11
78.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至2
×
106个/ml；步骤s4中，细胞悬液的注射量为0.1ml。
79.对比例12
80.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其为对比例1的区别仅在于，步骤s2中，稀释细胞至1
×
106个/ml；步骤s4中，细胞悬液的注射量为0.1ml。
81.对比例13
82.本对比例提供的肝癌动物模型的构建方法，其与实施例1的区别仅在于，用spf级km小鼠替换spf级icr小鼠。
83.测试例1
84.分别采用实施例1、对比例1-13的方法进行建模，5只/组。
85.1、腹水形成率
86.表1腹水形成率
[0087][0088]
结果表明：在移植2.0
×
106个细胞数量入小鼠腋下后(对比例1)，造模第15天60％的小鼠出现了腹水。使用1.5
×
106、1.0
×
106、5.0
×
105个细胞数量造模时(对比例2-4)，在造模第13天各组分别有60％、20％、20％的小鼠形成腹水。当移植的细胞数量低于5.0
×
105个以及使用瘤块造模法时(对比例5-13、实施例1)，在采样时小鼠没有出现转移性腹水，减少造模引起的无关因素。
[0089]
2、肿瘤大小
[0090]
表2采样当天肿瘤质量超过小鼠体重10％的概率
[0091][0092]
表3采样当天肿瘤直径超过20mm的概率
[0093][0094]
肿瘤组织任一直径超过20mm被视为过大的肿瘤，过大的肿瘤和肿瘤质量超过小鼠体重10％的肿瘤均不符合动物伦理的要求。表2和表3结果表明：采用对比例1的方法造模，在造模后第15天，超过50％的小鼠的肿瘤组织过大，故于第15天对小鼠进行安乐死。同时，解剖后发现超过60％的肿瘤组织质量超过10％小鼠体重。采用对比例2的方法造模，在种植第13天也发现有20％的小鼠出现存在肿瘤组织质量超过小鼠体重10％和肿瘤直径超过20mm的情况。除了对比例4出现20％小鼠肿瘤过大，其余对比例及实施例均没有出现过大的肿瘤和肿瘤组织质量超过小鼠体重10％的现象，符合动物伦理的要求。
[0095]
参见图1所示，相比于对比例13，来源于实施例1的肿瘤组织的生长趋势更加明显，更利于观察造模成功后肿瘤组织的生长态势。
[0096]
3、移植瘤生长状况
[0097]
图2为肿瘤组织表面坏死结痂的图像。
[0098]
参见图3所示，来源于对比例1-12的肿瘤均出现不同程度的坏死结痂。对比例1在造模第11天有60％的小鼠肿瘤组织出现坏死结痂，造模第13天达到80％。对比例2有60％的小鼠肿瘤组织在造模第10天出现坏死结痂。对比例3在造模第8天、第10天和第12天分别有20％、80％和100％的小鼠肿瘤组织表面坏死结痂。对比例4有80％的小鼠肿瘤组织在第12天出现坏死结痂。对比例5-12在造模一周以内便出现了肿瘤组织表面坏死结痂。而采用瘤块种植法(对比例13、实施例1)在15天内没有出现肿瘤组织的结痂。
[0099]
参见图4所示，来源于对比例7的肿瘤组织以及来源于实施例1的肿瘤组织制成病理切片。这些肿瘤组织在固定时均没有剥离体表的皮毛，最大程度上保证瘤体的完整性。图4a显示来源于对比例7的肿瘤组织，切片可见瘤细胞向脂肪和肌肉组织内浸润性生长，见残留肌肉组织、脂肪细胞和胶原纤维。肿瘤组织边缘区域见巨噬细胞、淋巴细胞等浸润，伴随着大量血管和弥漫性出血。这些位置恰好与肉眼观察到的表面结痂坏死相对应，这些病理损伤直接影响对血管生成拟态的观察和计数。相反地，来源于实施例的组织形态完好，肿瘤坏死及血管增生主要见于肿瘤内部，且红细胞主要位于管腔内，未见明显的出血，见图4b。
[0100]
4、血管生成拟态
[0101]
表4血管生成拟态的量化(x
±
s)
[0102][0103]
参见表4，采用本发明瘤块种植法建立的肝癌模型，其肿瘤组织内部的vm数量、vm密度，以及vm密度和微血管密度的比值也能通过目测和计算机进行统计分析。
[0104]
参见图5，来源于实施例1瘤块种植模型的肿瘤组织进行cd34-pas分析：由肿瘤细胞围绕和pas染液标记，并显示为粉色管腔结构的血管生成拟态和棕色信号代表的内皮血管在镜下能被清晰地观察到。其中，a与b都展示了血管生成拟态的横向结构，而c展示了血管生成拟态的纵向结构。
[0105]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种研究血管生成拟态的肝癌动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将肝癌细胞接种到小鼠腋下，选择生长良好而无变性坏死、呈粉色的瘤组织；(2)将所述瘤组织切成边长为4-5mm的瘤组织块；(3)将所述瘤组织块植入到小鼠腋下；(4)对植入瘤组织的小鼠进行喂养，2-4天，得到肝癌动物模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述肝癌细胞为h22细胞。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所使用的小鼠为spf级icr小鼠。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠的体重为20
±
2g，周龄为6～8周。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：s1：复苏h22细胞，并于小鼠腹腔培养；s2：待小鼠腹部膨隆，取第二代淡黄色腹水，稀释细胞至1
×
107个/ml；s3：75％酒精消毒小鼠的右侧腋下皮肤；s4：吸取0.2ml细胞悬液注射于右侧腋后皮下；s5：植瘤后7-11天，将小鼠脱臼处死，并选出生长良好而无变性坏死、呈粉色的瘤组织；s6：用手术刀将符合条件的瘤组织切成边长约4-5mm的小块，并浸泡于冷冻的生理盐水中；s7：用动物剃毛器将小鼠右侧腋下的毛发剃去；s8：75％酒精消毒受体小鼠的右侧腋下；s9：用眼科剪剪开提拉部位的皮肤，形成—个长为0.6-0.8cm的小口；s10：夹紧眼科镊子从小口插入，捣向腋下方向，松解皮肤与胸膜之间的粘连；s11：用无钩眼科镊子夹取小块，并沿切口送入腋下；s12：将小鼠放于饲养盒内喂养，观察2-4天，皮下瘤块无消退迹象即为造模成功。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤s9-s11的步骤需要双人操作。

技术总结
本发明实施例公开了一种研究血管生成拟态的肝癌动物模型的构建方法。所述方法包括：将肝癌细胞接种到小鼠腋下，选择生长良好而无变性坏死、呈粉色的瘤组织；将所述瘤组织切成边长为4-5mm的瘤组织块；将所述瘤组织块植入到小鼠腋下；对植入瘤组织的小鼠进行喂养，2-4天，得到肝癌动物模型。本发明能在减轻动物负担的前提下，在体表完成动物模型的建立，并尽可能地保护血管生成拟态结构不被破坏，具有肝癌组织质量高、持续时间长，模型稳定，可重复性高的优点。高的优点。高的优点。


技术研发人员：黄覃凤 韦艾凌 王雪娟 吴明权 佘颖祺 叶臻 龙富立 官志杰 杨继峰
受保护的技术使用者：广西医科大学第一附属医院
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/9