基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒及测序方法

1.本发明涉及单细胞测序
技术领域：
：，具体地，涉及一种基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒及测序方法。
背景技术：
：：2.近年来，单细胞测序技术的蓬勃发展有助于生物医学科研工作者们去解读各类型细胞的异质性。细胞的异质性对于组织生物学和各种疾病如肿瘤、免疫性疾病等的研究具有重要意义，细胞间的基因表达水平都有着不同程度的差异，从而决定细胞在微环境中的命运和功能。针对分离单细胞的方法，最开始使用口吸管挑取单个细胞进行转录组建库测序或者基因表达定量分析，实验操作复杂、成本高且单次实验只能得到几十个细胞的信息；随后流式分选技术的发展，一次实验能分到数百个单细胞；最近几年内，以微流控芯片和微孔板技术为代表的一系列高通量单细胞测序方法的出现，使得单次实验通量可达上万级别。其中，基于微流控技术的代表研究有drop-seq（macosko,e.z.,etal.,highlyparallelgenome-wideexpressionprofilingofindividualcellsusingnanoliterdroplets.cell,2015.161(5):p.1202-1214.）与indrop技术（klein,allonm.,etal.,dropletbarcodingforsingle-celltranscriptomicsappliedtoembryonicstemcells.cell,2015.161(5):p.1187-1201.），另外商业化平台10×chromiumsinglecellgeneexpressionsolution也是基于微流控技术。基于微孔板技术的代表研究有microwell-seq（han,x.,etal.,mappingthemousecellatlasbymicrowell-seq.cell,2018.173(5):p.1307.）和seq-well（gierahn,t.m.,etal.,seq-well:portable,low-costrnasequencingofsinglecellsathighthroughput.natmethods,2017.14(4):p.395-398.），另外商用仪器bdrhapsodytmsingle-cellanalysissystem也基于此。3.以上技术在通量方面较过去已经有了较大提升，但单次实验通量仍然受限，提升通量需建立在重复多次实验的基础上，引入了实验批次效应。另外，上述技术主要基于消化单细胞或者是分选后的活细胞，不同类型的细胞对消化有着不同程度的偏好性，文库质量也随细胞活性有较大变化。近年来，另一种思路也被采用于单细胞测序，即利用表面活性剂对组织细胞提取细胞核，将其固定，进行胞内原位反转录反应。sci-rna-seq3（cao,j.,etal.,thesingle-celltranscriptionallandscapeofmammalianorganogenesis.nature,2019.566(7745):p.496-502.）与split-seq（rosenberg,a.b.,etal.,single-cellprofilingofthedevelopingmousebrainandspinalcordwithsplit-poolbarcoding.science,2018.360(6385):p.176-182.）首先对细胞/细胞核进行固定，随后将细胞均匀分到多孔板中，利用孔特异性的反转录引物给细胞打上第一轮标签；随后将细胞收集混合，再均匀地将其分到新的多孔板带上新的标记，最终通过多轮分子标记的组合区分单个细胞。单次实验通量随着每一轮标签数的增加而提升，可达百万级别。但以上技术依赖连接酶的方法连接捕获转录本后带标记的寡核苷酸序列，连接酶效率极低，基因捕获率随组合数的增加而急剧减少，成本高且操作复杂，得到的数据质量控制也较差。4.目前大部分转录组测序方法仅基于多聚t尾寡核苷酸引物捕获转录本，文库建立需经过tn5转座酶打断加接头，这使得测序得到的数据主要集中于多聚腺苷酸尾转录本以及3'端测序，3'端测序缺少rna分子的全长信息，另外胞内非多聚腺苷酸尾转录本无法被多聚t尾的引物所捕获，从而导致我们对于非编码rna的差异表达以及可变剪切等信息的缺失。最近，matq-seq（niu,m.,etal.,droplet-basedtranscriptomeprofilingofindividualsynapses.natbiotechnol,2023.p.1–13.doi:10.1038/s41587-022-01635-1.）以及vasa-seq（salmen,f.,etal.,high-throughputtotalrnasequencinginsinglecellsusingvasa-seq.natbiotechnol,2022.40,p.1780–1793.）等全长转录组测序技术的发展弥补了这一缺口。然而，目前单细胞全长转录组的方法在单次实验通量上仍然有限，另外，实验成本也处于较高水平，其中matq-seq和vasa-drop依赖于微流控设备，vasa-plate也需要借助分选仪器将单细胞分选到384孔板中，均受到不同程度仪器和设备的影响。因而，目前仍然缺乏一个不依赖于仪器，单细胞层面的超高通量超高灵敏度全长转录组平台。技术实现要素：5.为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在一种基于末端转移酶的超高通量超高灵敏度全长单细胞转录组测序方法（ultra-highthroughput,ultra-highsensitivityandfull-lengthsinglecelltranscriptomesequencing，uu-seq），该测序方法能够绕开低效的连接反应，从而一次性高效获得百万级别到千万级别的转录组，单细胞核提取无需进行单细胞消化分离，不受细胞活性与状态的限制。为此，本发明采用以下技术方案：本发明第一方面提供一种基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒，包括：反转录引物，5'-3'依次包括第一通用引物序列、第一细胞标签序列和捕获序列，所述捕获序列用于与rna杂交并延伸得到cdna序列；末端转移酶，用于向所述cdna序列的3'端添加第一连接序列；杂交引物，5'-3'依次包括第二通用引物序列、第二细胞标签序列和第二连接序列，所述第二连接序列与所述第一连接序列反向互补；第一pcr扩增引物组合，包括第一pcr扩增上游引物和第一pcr扩增下游引物，所述第一pcr扩增上游引物5'-3'依次包括所述第一通用引物序列的反向互补序列和第一文库扩增接头序列；所述第一pcr扩增下游引物5'-3'依次包括所述第二通用引物序列的反向互补序列、第三细胞标签序列和第二文库扩增接头序列。6.进一步地，所述捕获序列为随机序列或多聚t序列。优选地，所述随机序列包括5~10个随机合成的碱基，所述多聚t序列包括20~35个t碱基。7.进一步地，所述第一连接序列为多聚a序列，相应地，所述第二连接序列为多聚t序列。8.进一步地，所述第一细胞标签序列、所述第二细胞标签序列和所述第三细胞序列包括6~15个随机合成的碱基。9.更进一步地，所述试剂盒还包括用于提取细胞核的取核裂解液、用于对转录产物进行反转录的反转录缓冲液、用于将所述第一连接序列和所述第二连接序列杂交的杂交缓冲液、用于对核酸进行延伸的延伸试剂、用于pcr扩增的pcr扩增缓冲液和/或用于核酸纯化的核酸纯化试剂。10.本发明第二方面提供本发明第一方面任一所述的基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒进行测序的方法，包括以下步骤：s1，取待测的细胞或细胞核，对细胞或细胞核进行固定处理，并将固定后的细胞或细胞核均匀地分装到多孔板中；s2，向细胞或细胞核所在的每个孔中加入所述反转录引物，其中对于细胞核，所述捕获序列为随机序列，对于细胞，所述捕获序列为多聚t序列，加入每个孔中的反转录引物的所述第一细胞标签序列不同，在反转录试剂存在的情况下进行反转录反应，得到cdna序列，将细胞或细胞核收集并混合；s3，利用末端转移酶向所述cdna序列的3'端添加第一连接序列，之后将细胞或细胞核均匀地分装到另一多孔板中；s4，向细胞或细胞核所在的每个孔中加入所述杂交引物，加入每个孔中的杂交引物的所述第二细胞标签序列均不同，在杂交缓冲液存在的情况下使所述第一连接序列和所述第二连接序列杂交，杂交结束后，每个孔中加入双倍的封闭引物以封闭孔内多余的杂交引物，封闭结束后将所有细胞收集起来并混合，s5，混合后的细胞用洗液清洗掉多余的杂交引物后，根据所述第一细胞标签和所述第二细胞标签的组合数，调整细胞密度，再均匀地分至多孔板中并在延伸试剂存在的情况下进行延伸；s6，利用所述第一pcr扩增引物组合进行第一pcr扩增，加入每个孔中的第一pcr扩增下游引物的所述第三细胞标签序列均不同，得到测序文库，对测序文库进行高通量测序。11.进一步包括：利用包括测序接头序列的引物组合进行第二pcr扩增。12.优选地，步骤s1中，获得单细胞后，对细胞进行透化或利用取核裂解液提取细胞核，对透化后的细胞或提取的细胞核进行固定。13.优选地，步骤s1中，所述对细胞或细胞核进行固定处理的方法包括：（1）用1×pbs重悬细胞或细胞核，加入50倍体积2~5%pfa，冰上固定30min~1h，期间不时进行混匀；（2）加入7~8倍体积2.5m甘氨酸吹匀，置于冰上10~20min终止固定，期间不时混匀；（3）4℃，300~800g离心3~10min，清洗沉淀，30~50μm滤网过滤。14.任选地，在步骤s2之后，步骤s3之前，进一步包括进行外切酶切除多余所述反转录引物的步骤；任选地，在步骤s4中，在杂交之后，延伸之前，进一步包括对所述杂交引物进行封闭的步骤。15.本发明的有益效果相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明采用的3段细胞标签标记寡核苷酸序列包含多个功能区，所用序列包含通用引物序列、文库扩增接头序列、连接序列、3段细胞标签序列、捕获序列。基于末端转移酶的超高通量超高灵敏度全长单细胞转录组测序方法能够一次性标记并获得百万至千万级别的单细胞特异性转录组信息。和sci-rna-seq3或matq-seq方法比较，首先在通量上有着极大的优势，另外，由于在细胞标签标记的步骤仅依靠核酸杂交的方法，中间无需使用任何连接酶来做胞内连接反应，而是直接延伸来合成完整双链dna分子，提高反应效率的同时也大大降低了大规模高通量实验的成本。捕获序列中，随机引物反转录的设计可得到单细胞核全长转录组的信息，从而去分析核内可变剪切的活动，而多聚t序列适用于细胞内带多聚a尾转录本的捕获。该发明既适用于单细胞的测序，也适用于单细胞核的测序。整套实验成本低，操作简便，耗时短，无需借助于额外仪器、通量高，在单细胞测序领域有很好的实际应用价值和推广价值。附图说明16.图1示出了本发明单细胞转录组测序文库的流程示意图，其中单细胞核的示意图对应实施例1的流程。17.图2示出了本发明实施例2中人鼠混合细胞转录本分布（umi）与物种间交叉污染率。18.图3示出了本发明实施例3中293t细胞和3t3细胞基因数。19.图4示出了本发明方法与其他单细胞转录组测序方法学基因数随测序读长变化的比较。20.图5示出了本发明实施例4中成体c57bl/6j小鼠脑组织7万单细胞转录组数据t-sne分群示意图。具体实施方式21.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。22.基于现有技术的不足，发明人开发了一种基于末端转移酶的超高通量超高灵敏度全长单细胞转录组测序方法，该测序方法能够绕开低效的连接反应，从而一次性高效获得百万级别到千万级别的转录组，单细胞核提取无需进行单细胞消化分离，不受细胞活性与状态的限制。23.结合图1，对本发明的测序方法进行详细描述：s1，取待测的细胞或细胞核，对细胞或细胞核进行固定处理，并将固定后的细胞或细胞核均匀地分装到多孔板中；在本发明中，细胞的类型不受限定，可以是任何有细胞核的细胞，对细胞的活性状态也没有任何限定，可以是新鲜的细胞，也可以是培养的细胞系，还可以是将各种方式保存的包含细胞的组织样本处理后得到的细胞。在本发明的一些实施例中，所述细胞来源于培养的细胞系，用胰酶将细胞系消化成单细胞悬液，优选地，可以利用1×pbs清洗。24.在本发明中，多孔板中的每个孔可以包含多个细胞。通过标记第一细胞标签、第二细胞标签和第三细胞标签的组合，可以达到单细胞的分辨率。25.在本发明中，既可以将细胞进行透化后进行固定，也可以提取细胞核后对细胞核进行固定，也就是说，既适用于单细胞的测序，也适用于单细胞核的测序。在本发明的一些实施方案中，利用包含表面活性剂的取核裂解液对细胞进行裂解，得到细胞核。在本发明的一些具体实施方案中，所述取核裂解液中包括：0.1~0.2%igepalca-630、0.5~2mmdtt、0.1~0.5u/μlrnase抑制剂、0.05~0.2%tween-20、5~20mmtris-hcl（ph7.5）、3~15mmnacl、1~5mmmgcl2。在本发明的一些优选实施方案中，所述取核裂解液中包括：0.2%igepalca-630、1mmdtt、0.4u/μlrnase抑制剂、0.1%tween-20、10mmtris-hcl（ph7.5）、10mmnacl、3mmmgcl2。在本发明的一些具体实施方案中，利用取核裂解液将获得的单细胞悬液进行重悬，置于冰上裂解3~7min，期间用枪头反复轻柔吹打；再加入一定量rsbt洗液终止裂解反应，40μm滤网过滤，4℃，300~800g离心3~10min，其中，所述rsbt洗液包括3~15mmtris-hcl（ph7.5）、5~20mmnacl、1~5mmmgcl2和0.05~0.2%tween-20，无酶水现配，置于冰上备用。在本发明的一些优选实施方案中，所述rsbt洗液包括10mmtris-hcl（ph7.5）、10mmnacl、3mmmgcl2和0.1%tween-20，无酶水现配，置于冰上备用。26.进一步地，所述对细胞或细胞核进行固定处理的方法包括：（1）用1×pbs重悬细胞或细胞核，加入50倍体积2~5%pfa，冰上固定30min~1h，期间不时进行混匀；（2）加入7~8倍体积2.5m甘氨酸吹匀，置于冰上10~20min终止固定，期间不时混匀；（3）4℃，300~800g离心3~10min，清洗沉淀，30~50μm滤网过滤。27.在本发明的一些实施方案中，所述多孔板是指具有多个能够盛放细胞悬液的孔，例如24孔板、48孔板、96孔板、384孔板，本领域技术人员可以根据需要进行选择。28.s2，向细胞或细胞核所在的每个孔中加入所述反转录引物（反转录寡核苷酸引物），其中对于细胞核，所述捕获序列为随机序列，对于细胞，所述捕获序列为多聚t序列，在反转录试剂存在的情况下进行反转录反应，得到cdna序列，将细胞或细胞核收集并混合。29.所述反转录引物，5'-3'依次包括第一通用引物序列、第一细胞标签序列（细胞标签1）和捕获序列，所述捕获序列用于与rna杂交并延伸得到cdna序列，加入每个孔中的反转录引物的所述第一细胞标签序列不同。30.在本发明的一些实施方案中，所述第一通用引物序列是为后续进行pcr扩增时提供引物结合位点，如此，可以对每个反转录成功的cdna进行扩增。31.在本发明中，捕获序列与rna分子互补配对，提供反转录反应所需要的结合位点。在本发明的一些实施方案中，所述捕获序列可以是多聚t序列，可以与胞内带多聚a尾的转录本结合。在本发明的一些实施方案中，捕获引物序列也可以是随机合成的7个碱基。随机合成的序列与多聚t序列相比，有利于胞内非多聚a尾转录本的捕获，同时也提高了转录本的捕获效率，极大地提升了灵敏度。随机合成的序列同时可以作为分子标签，用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mrna。32.在本发明的一些具体实施方案中，反转录体系为6μl体系，包括1×反转录缓冲液，8%peg8000，0.5%triton-100，dntp0.5mm，maximahminus反转录酶100u和rnase抑制剂20u。进一步地，反转录反应的程序如下：8℃12sec，15℃30sec，20℃45sec，25℃1min，30℃1min，42℃2min，共10个循环，循环后42℃30min。33.更进一步地，反应结束后，加入10μl40mmedta终止反应，置于37℃烘箱中10min。34.在本发明的一些优选实施方案中，在步骤s2之后，进一步包括进行外切酶切除多余所述反转录引物的步骤。具体地：（1）配置外切酶体系50μl（1×exoꢀⅰ缓冲液，exoꢀⅰꢀ50u），将细胞核重悬于体系中，37℃烘箱，30min，10rpm。35.（2）加入等体积40mmedta终止反应，再加入pbst收集细胞核，4℃，500g离心5min，弃上清，再用pbst洗2次。36.s3，利用末端转移酶向所述cdna序列的3'端添加第一连接序列，之后将细胞或细胞核均匀地分装到另一多孔板中；在本发明的一些实施方案中，所述第一连接序列为多聚a序列，具体地：（1）配置末端转移酶体系50μl（1×末端转移酶缓冲液，cocl25mm，datp100μm，末端转移酶200u），将细胞核重悬于体系中，37℃烘箱，15min，10rpm。37.（2）加入等体积40mmedta终止反应，再加入pbst收集细胞核，4℃，500g离心5min，弃上清，再用pbst洗2次。38.在本发明中，完成末端转移酶加尾的细胞核可重悬在冻存液中于-80℃冰箱保存，短期内可随时取出，完成后续杂交延伸等步骤，这对临床稀缺珍贵的样品非常友好。39.s4，向细胞或细胞核所在的每个孔中加入所述杂交引物，所述杂交引物5'-3'依次包括第二通用引物序列、第二细胞标签序列和第二连接序列，所述第二连接序列与所述第一连接序列反向互补，加入每个孔中的杂交引物的所述第二细胞标签序列均不同，在杂交缓冲液存在的情况下使所述第一连接序列和所述第二连接序列杂交，杂交结束后，每孔加入双倍的封闭寡核苷酸引物以封闭孔内多余的杂交引物，封闭结束后将所有细胞收集起来并混合。40.在本发明的一些实施方案中，在第一连接序列为多聚a的情况下，所述第二连接序列为多聚t序列。41.在本发明的一些实施方案中，所述杂交的步骤如下：配置杂交工作液，重悬细胞，每孔3μl（1×杂交缓冲液，0.05-0.1%tritonx-100，10%peg8000），根据分孔数量配置杂交工作液，均匀地分到多个96孔板中，随后以排枪每孔加入2μl10μm的杂交引物，37℃烘箱，于旋转仪上以10rpm的转速旋转10min，随后转至室温继续杂交20min，10rpm。42.其中，10×杂交缓冲液包括100mmtris-hcl（ph8.0）、500mmnacl和10mmdtt，无酶水配置后于-20℃保存。43.进一步地，杂交结束后，加入杂交引物双倍量的封闭引物（封闭寡核苷酸），室温10rpm旋转15min。其中，所述封闭引物的序列为所述第二连接序列的反向正补序列，但其3'端为2',3'-二脱氧胞苷(ddc)，使其无法进行延伸，在后续延伸及pcr反应中有效地避免了不同标签引物彼此影响的可能性。44.s5，混合后的细胞用洗液清洗掉多余的杂交引物后，根据所述第一细胞标签和所述第二细胞标签的组合数，调整细胞密度，再均匀地分至多孔板中，对杂交产物进行延伸，配置延伸反应体系，每孔5μl（1×ꢀbluebuffer，dntp1mm，klenow酶0.625u，exoi2.5u，rnaseh0.125u），根据分孔数量配置延伸体系，重悬细胞，随后置于pcr仪中进行反应，程序如下：25℃30min，37℃10min，40℃5min，45℃5min，50℃5min，4℃hold。45.反转录形成的cdna和杂交寡核苷酸序列利用核苷酸杂交形成双链，直接用dna聚合酶将双链从5'端到3'端补齐，从而形成完整的dna双链，不需要额外加入连接酶做胞内连接反应，极大地提高了反应效率。46.s6，利用所述第一pcr扩增引物组合进行第一pcr扩增，其中，所述第一pcr扩增引物组合，包括第一pcr扩增上游引物和第一pcr扩增下游引物，所述第一pcr扩增上游引物5'-3'依次包括所述第一通用引物序列的反向互补序列和第一文库扩增接头序列；所述第一pcr扩增下游引物5'-3'依次包括所述第二通用引物序列的反向互补序列、第三细胞标签序列和第二文库扩增接头序列，加入每个孔中的第一pcr扩增下游引物的所述第三细胞标签序列均不同。47.进一步，将第一轮扩增后的产物构建转录组测序文库，进行上机测序，得到细胞对应的全长转录组信息。所述测序可以是基于任何原理的高通量扩增进行，包括但不限于桥连扩增、滚环扩增。48.在本发明中，通过第一细胞标签、第二细胞标签和第三细胞标签标识测序文库中每条序列的细胞来源。文库经过第一轮扩增之后，每个细胞的文库都带有独特的细胞标签组合，从而达到单细胞的分辨率。49.在本发明的一些具体实施方案中，3轮细胞标签均有768种寡核苷酸序列，实验单次通量理论可达百万至千万级别，有效地减少批次效应。优选的，第一细胞标签、第二细胞标签和第三细胞标签序列为随机合成的特异性片段，且每一种特异性片段分别单孔存放，用于在使用时实现各孔间序列不同。50.在本发明的一些实施方案中，在进行测序之前进一步包括：利用包括测序接头序列的引物组合进行第二pcr扩增。第一pcr扩增产物再进行第二轮扩增，可直接带上区分样本的i7index引物和p5测序接头，不需要另外使用文库构建试剂盒打断dna进行建库，所得数据序列没有3'端偏好性。51.当然，在进行第二pcr扩增之前和/或进行测序之前，还包括对产物进行纯化的步骤。具体地，本领域技术人员可以使用本领域常用的磁珠纯化方法进行纯化。52.针对该测序方法，相应的试剂可以包装成基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒，详细描述如下：所述基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒包括：反转录引物，5'-3'依次包括第一通用引物序列、第一细胞标签序列和捕获序列，所述捕获序列用于与rna杂交并延伸得到cdna序列；末端转移酶，用于向所述cdna序列的3'端添加第一连接序列；杂交引物，5'-3'依次包括第二通用引物序列、第二细胞标签序列和第二连接序列，所述第二连接序列与所述第一连接序列反向互补；第一pcr扩增引物组合，包括第一pcr扩增上游引物和第一pcr扩增下游引物，所述第一pcr扩增上游引物5'-3'依次包括所述第一通用引物序列的反向互补序列和第一文库扩增接头序列；所述第一pcr扩增下游引物5'-3'依次包括所述第二通用引物序列的反向互补序列、第三细胞标签序列和第二文库扩增接头序列。53.在本发明的一些实施方案中，所述捕获序列为随机序列或多聚t序列。在本发明的一些优选实施方案中，所述随机序列包括5~10个随机合成的碱基，所述多聚t序列包括20~35个t碱基。54.在本发明的一些实施方案中，所述第一连接序列为多聚a序列，相应地，所述第二连接序列为多聚t序列。55.在本发明的一些实施方案中，所述第一细胞标签序列、所述第二细胞标签序列和所述第三细胞序列包括6~15个随机合成的碱基。56.在本发明的一些实施方案中，还包括用于提取细胞核的取核裂解液、用于对转录产物进行反转录的反转录缓冲液、用于将所述第一连接序列和所述第二连接序列杂交的杂交缓冲液、用于对核酸进行延伸的延伸试剂、用于pcr扩增的pcr扩增缓冲液和/或用于核酸纯化的核酸纯化试剂。57.在本发明的一些具体实施方案中，所述取核裂解液中包括：0.1~0.2%igepalca-630、0.5~2mmdtt、0.1~0.5u/μlrnase抑制剂、0.05~0.2%tween-20、5~20mmtris-hcl（ph7.5）、3~15mmnacl、1~5mmmgcl2。在本发明的一些优选实施方案中，所述取核裂解液中包括：0.2%igepalca-630、1mmdtt、0.4u/μlrnase抑制剂、0.1%tween-20、10mmtris-hcl（ph7.5）、10mmnacl、3mmmgcl2。58.在本发明的一些实施方案中，还包括rsbt洗液，用于终止裂解反应。在本发明的一些实施方案中，所述rsbt洗液包括3~15mmtris-hcl（ph7.5）、5~20mmnacl、1~5mmmgcl2和0.05~0.2%tween-20，无酶水现配，置于冰上备用。在本发明的一些优选实施方案中，所述rsbt洗液包括10mmtris-hcl（ph7.5）、10mmnacl、3mmmgcl2和0.1%tween-20，无酶水现配，置于冰上备用。59.在本发明的一些实施方案中，所述反转录缓冲液包括5~10%peg8000，0.1~1.0%triton-100，dntp0.1~0.5mm，maximahminus反转录酶80~120u和rnase抑制剂12~25u。在本发明的一些优选实施方案中，所述反转录缓冲液包括8%peg8000，0.5%triton-100，dntp0.5mm，maximahminus反转录酶100u和rnase抑制剂20u。60.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。61.实施例以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。62.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。63.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。64.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。65.实施例1物种混合（人293t细胞系和鼠3t3细胞系）细胞实验1.试剂准备（1）rsbt洗液：10mmtris-hcl（ph7.5）+10mmnacl+3mmmgcl2+0.1%tween-20，无酶水现配，置于冰上备用；（2）取核裂解液：0.1~0.2%igepalca-630+1mm二硫苏糖醇（dtt）+0.4u/μlrnase抑制剂+0.1%tween-20+10mmtris-hcl（ph7.5）+10mmnacl+3mmmgcl2，无酶水现配，置于冰上备用；（3）pbst：1×pbs+0.05%tween-20，现配，置于冰上备用；（4）10×杂交缓冲液：100mmtris-hclph8.0+500mmnacl+10mmdtt，无酶水配置后于-20℃保存。66.（5）10×bluebuffer：100mmtris-hclph8.0+500mmnacl+100mmmgcl2+10mmdtt，无酶水配置后于-20℃保存。67.2.细胞核提取按照图1流程，首先用胰酶将两种培养细胞系分别消化成单细胞悬液，用1×pbs洗一遍后，分别用取核裂解液重悬，置于冰上裂解3~7min，期间用枪头反复轻柔吹打。加入取核裂解液3~6倍体积的rsbt洗液终止裂解反应，40μm滤网过滤，4℃，500g离心5min。68.3.细胞核固定（1）沉淀用100μl1×pbs重悬，加入5ml4%pfa，冰上固定30min~1h，期间不时用枪头吹打或颠倒混匀。69.（2）加入750μl2.5m甘氨酸吹匀，置于冰上15min终止固定，期间不时用枪头吹打或颠倒混匀。70.（3）4℃，500g离心5min，细胞沉淀用rsbt洗液洗两次，40μm滤网过滤，计数，将两种细胞系按照1:1混合。71.4.反转录（1）取2μl10μm反转录寡核苷酸引物到96孔板中，置于pcr仪中高温单链化3min，随后立即置于冰上，备用。72.反转录寡核苷酸序列为：5'-ccgcttggcctccgacttnnnnnnnnnnnnnnnnn-3'；其中，n表示a/t/c/g中的任一种，10n序列为随机合成的第一细胞标签序列（细胞标签1）；n表示a/t/c/g中的任一种，7n序列为随机合成的七个碱基，提供反转录反应所需要的结合位点。73.（2）配置反转录体系的其他组分6μl（1×反转录缓冲液，8%peg8000，0.5%triton-100，dntp0.5mm，maximahminus反转录酶100u，rnase抑制剂20u），用排枪将体系分到装有引物的96孔板中。将两种细胞调整至合适密度（约500万~2000万个/ml），分别在每孔中加入2μl细胞悬液。随后置于pcr仪内进行反转录反应，程序如下：8℃12sec，15℃30sec，20℃45sec，25℃1min，30℃1min，42℃2min，共10个循环，循环后42℃30min。74.（3）反应结束后，加入10μl40mmedta终止反应，置于37℃烘箱中10min；（4）随后将96孔板中所有细胞收集到离心管中，4℃，500g离心5min，用pbst清洗两遍。75.5.外切（1）配置外切酶体系50μl（1×exoꢀⅰ缓冲液，exoꢀⅰꢀ50u），将细胞核重悬于体系中，37℃烘箱，30min，10rpm。76.（2）加入等体积40mmedta终止反应，再加入pbst收集细胞核，4℃，500g离心5min，弃上清，再用pbst洗2次。77.6.末端转移酶加尾（1）配置末端转移酶体系50μl（1×末端转移酶缓冲液，cocl25mm，datp100μm，末端转移酶200u），将细胞核重悬于体系中，37℃烘箱，15min，10rpm。78.（2）加入等体积40mmedta终止反应，再加入pbst收集细胞核，4℃，500g离心5min，弃上清，再用pbst洗2次。79.7.分板杂交、封闭（1）配置杂交工作液，重悬细胞，每孔3μl（1×杂交缓冲液，0.05-0.1%tritonx-100，10%peg8000），根据分孔数量配置杂交工作液，均匀地分到多个96孔板中，随后以排枪每孔加入2μl10μm的杂交引物（杂交寡核苷酸引物），37℃烘箱，10rpm旋转10min，随后转至室温继续杂交20min，10rpm。80.杂交寡核苷酸引物的序列如下：5'-aagcagtggtatcaacgcagagtacnnnnnnnnnntttttttttttttttttttt-3'；n表示a/t/c/g中的任一种，10n序列为随机合成的第二细胞标签序列；（2）杂交结束后，以排枪每孔加入2μl20μm封闭寡核苷酸工作液，室温10rpm旋转15min。81.封闭寡核苷酸序列为5'-aaaaaaaaaaaaaaaaaa-3'ddc。82.（3）每孔加入等体积pbst稀释杂交体系，将所有细胞核收集至离心管，4℃，500g离心5min，弃上清。再用pbst洗两遍，计数，调整到合适密度，具体密度需要根据前面第一、二轮细胞标签组合数确定。83.8.分板延伸配置延伸反应体系，每孔5μl（1×ꢀbluebuffer，dntp1mm，klenow酶0.625u，exoi2.5u，rnaseh0.125u），根据分孔数量配置延伸体系，重悬细胞，随后置于pcr仪中进行反应，程序如下：25℃30min，37℃10min，40℃5min，45℃5min，50℃5min，4℃hold。84.9.裂解、文库预扩增（1）在延伸完成后的细胞中，每孔加入1μl裂解液（0.1-0.15%sds，0.1mg/ml蛋白酶k），于pcr仪中55℃反应15min（热盖80℃）；（2）裂解后在体系中每孔加入等体积10%tween-20终止反应，离心充分混匀后置于冰上，加入pcr体系28μl（1×kapahifihotstartreadymix，扩增上游引物0.1~0.4mm，扩增下游引物0.1~0.4mm），其中下游引物带有孔特异性的细胞标签3，引物浓度视细胞数而定。85.扩增上游引物的核苷酸序列为：5'-ttgtcttcctaagaccgcttggcctccgactt-3'；扩增下游引物的核苷酸序列为：5'-aacgacatggctacgatccgacttnnnnnnnnnnaagcagtggtatcaacgcagagtac-3'，n表示a/t/c/g中的任一种，10n序列为随机合成的第三细胞标签序列。86.第一轮pcr程序如下：热盖105℃；72°c5min；95°c3min；98°c30sec，65°c30sec，72°c60sec，6个循环；72°c3min;10°chold。87.10.pcr产物纯化，第二轮pcr构建测序文库（1）产物纯化：反应完毕后，将一列8孔的液体收集到一个ep管中，用移液器量取其总体积（a），随后加入vahtsdnacleanbeads（诺唯赞）纯化磁珠，加入量为1.5a，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育8min。将ep管置于磁力架上5min以保证磁珠完全吸附，小心弃去上清，注意不要扰动到磁珠。加入1ml新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，注意加入乙醇时不要扰动到磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清，重复漂洗一次。保持ep管始终处于磁力架上，充分吸弃管底的乙醇，开盖空气干燥磁珠约5min。随后将ep管从磁力架上取出，加入24μl无酶水洗脱，使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。将反应管置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后（约5min）小心吸取23μl上清至新的灭菌pcr管中。88.（2）将纯化产物加入第二轮pcr体系（1×kapahifihotstartreadymix，0.1-0.2μmp5引物，0.1-0.2μmi7index引物）中，混匀离心，将反应管置于pcr仪中，运行如下程序：95°c5min；98°c30sec，65°c30sec，72°c60sec，循环数视情况而定；72°c3min；10°chold。89.11.文库纯化反应完成后，每孔加入0.4×反应体积（“×”数根据pcr产物体积计算而得，如“0.4×”表示0.4×50μl=20μl）的vahtsdnacleanbeads（诺唯赞）纯化磁珠20μl，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min后，将反应管置于磁力架上5min以保证磁珠完全吸附，小心转移上清至新的反应管中，丢弃磁珠。90.随后在每个反应管中加入0.8×反应体积的vahtsdnacleanbeads（诺唯赞）纯化磁珠40μl，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育8min。将反应管置于磁力架上5min以保证磁珠完全吸附，小心弃去上清，注意不要扰动到磁珠。加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，注意加入乙醇时不要扰动到磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清，重复漂洗一次。保持反应管始终处于磁力架上，充分吸弃管底的乙醇，开盖空气干燥磁珠约5min。随后将反应管从磁力架上取出，加入20μl无酶水洗脱，使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。将反应管置于磁力架上，待溶液澄清后（约5min）小心吸取20μl上清至新的灭菌pcr管中，取1μl用qubit3.0荧光剂测定双链浓度，剩余文库存于-20℃保存。91.实施例2测序文库单链化、环化反应（1）单链化根据实施例1文库大小，取1pmol（约300ng）于pcr管中，用无酶水将体积补至40μl。加入10μlsplintoligo，用移液器吹打混匀并短暂离心将反应液收集至管底，将pcr管置于pcr仪（提前预热）中，98℃变性3min。反应结束后立即置于冰上，冰浴2min后瞬时离心立即进行单链环化。92.（2）单链环化在单链化后的样品中加入15μlrapidsplintbuffer和5μlrapiddnaligase，用移液枪轻轻吹打10次以上混匀，瞬时离心将反应液收集至管底，置于pcr仪（热盖40℃）中，37℃环化反应15min。93.（3）酶切消化将反应后的样品瞬时离心，加入8μldigestionbuffer和2μldigestionenzyme，用移液枪轻轻吹打10次以上混匀，瞬时离心将反应液收集至管底，置于pcr仪（热盖40℃）中，37℃消化10min。94.（4）环化产物纯化将反应后的样品瞬时离心，加入130μl提前平衡至室温的vahtsdnacleanbeads，用移液器轻轻吹打10次直至完全混匀，室温孵育10min，将pcr管置于磁力架上5min以保证磁珠完全吸附，小心弃去上清，注意不要扰动到磁珠。加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，注意加入乙醇时不要扰动到磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清，重复漂洗一次。保持pcr管始终处于磁力架上，充分吸弃管底的乙醇，开盖空气干燥至磁珠表面无反光、无开裂。将pcr管从磁力架上取下，加入32μl无酶水进行dna洗脱，用移液器轻轻吹打至少10次直至完全混匀，室温静置孵育10min，瞬时离心，将pcr管置于磁力架上，静置至液体澄清（约3min），吸取上清转移到新的pcr管中，另取2μl环化后的产物用qubit3.0荧光剂进行单链dna浓度的测定。95.单链文库经过滚环扩增形成dnb，使用mgidnbseq-t7测序仪pe150测序模式，下机数据返回原始fastq数据进行根据三段寡核苷酸序列筛分，根据随机序列位置提取细胞标签，比对reads到人和小鼠参考基因组得到基因表达谱，进一步分析其中不同物种细胞单个细胞内检测到的转录本数量与单个细胞内污染交叉物种细胞转录本的情况，结果如图2所示，物种间转录组交叉污染率为0.28%，仅存在极少量的双细胞污染，说明该单细胞高通量测序平台的污染率极低。96.实施例3293t细胞系和3t3细胞系实验参照实施例1，按照图1所示流程进行实验，与实施例1不同之处在于，两种细胞系固定完之后不进行混合，按照反转录引物所带的细胞标签1将两种细胞分别进行反转录反应，其余操作类似。建好的文库同实施例2进行单链化、环化反应。进行深度饱和测序，返回的数据按照细胞标签拆分两种细胞系，分别比对到人和小鼠参考基因组，其中293t和3t3基因数分别约为12000和9000，如图3所示，说明该平台对基因检测的超高灵敏度。97.另外，综合几种已发表的方法学平台，包括10×gemomics商业化平台，同样基于split-pool原理的sci-rna-seq和split-seq以及全长转录组平台matq-seq和vasa-plate，基因数随测序读长变化的曲线图如图4显示，在相同的测序深度下，本平台能检测到更多基因数，从另一方面说明本平台的低成本，超高灵敏度。98.实施例4细胞亚型分群中的应用取8周大的c57bl/6j小鼠4只，为两公两母，取其脑组织，用1×pbs漂洗干净后于吸水纸上充分吸干水分，随后将脑组织置于研钵中，迅速倒入液氮，将组织快速研磨成粉末，用镊子夹取部分组织于取核裂解液中，冰上裂解2~5min，期间用枪头反复轻柔吹打。分板延伸每孔投入细胞数按照前面反转录和杂交的组合数确定，本实施例中每孔投入为1000，共投入约10万细胞用于文库构建，其余操作同实施例1。99.测序文库按照实施例2进行单链化、环化反应，最后使用mgidnbseq-t7测序仪pe150测序模式进行测序。100.测序原始数据进行筛分比对得到基因表达谱，使用r分析基因表达与亚群得到数据质控与细胞所属亚群可视化t-sne，根据实际测序深度过滤得到高质量数据细胞，筛选得到共约7万单细胞数据。单细胞水平分群如图5所示，一共得到48个细胞群，包括不同脑区的多种神经元以及多种胶质细胞亚型等，说明该方法对大规模高通量单细胞转录组有较高的灵敏度和细胞亚型高分辨能力。101.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒，其特征在于，包括：反转录引物，5'-3'依次包括第一通用引物序列、第一细胞标签序列和捕获序列，所述捕获序列用于与rna杂交并延伸得到cdna序列；末端转移酶，用于向所述cdna序列的3'端添加第一连接序列；杂交引物，5'-3'依次包括第二通用引物序列、第二细胞标签序列和第二连接序列，所述第二连接序列与所述第一连接序列反向互补；第一pcr扩增引物组合，包括第一pcr扩增上游引物和第一pcr扩增下游引物，所述第一pcr扩增上游引物5'-3'依次包括所述第一通用引物序列的反向互补序列和第一文库扩增接头序列；所述第一pcr扩增下游引物5'-3'依次包括所述第二通用引物序列的反向互补序列、第三细胞标签序列和第二文库扩增接头序列。2.根据权利要求1所述的一种基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒，其特征在于，所述捕获序列为随机序列或多聚t序列。3.根据权利要求1所述的一种基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒，其特征在于，所述第一连接序列为多聚a序列，相应地，所述第二连接序列为多聚t序列。4.根据权利要求1所述的一种基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒，其特征在于，所述第一细胞标签序列、所述第二细胞标签序列和所述第三细胞序列包括6~15个随机合成的碱基。5.根据权利要求1~4任一所述的一种基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒，其特征在于，还包括用于提取细胞核的取核裂解液、用于对转录产物进行反转录的反转录缓冲液、用于将所述第一连接序列和所述第二连接序列杂交的杂交缓冲液、用于对核酸进行延伸的延伸试剂、用于pcr扩增的pcr扩增缓冲液和/或用于核酸纯化的核酸纯化试剂。6.利用权利要求1~5任一所述的基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒进行测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，取待测的细胞或细胞核，对细胞或细胞核进行固定处理，并将固定后的细胞或细胞核均匀地分装到多孔板中；s2，向细胞或细胞核所在的每个孔中加入所述反转录引物，加入每个孔中的反转录引物的所述第一细胞标签序列不同，在反转录试剂存在的情况下进行反转录反应，得到cdna序列，将细胞或细胞核收集并混合；s3，利用末端转移酶向所述cdna序列的3'端添加第一连接序列，之后将细胞或细胞核均匀地分装到另一多孔板中；s4，向细胞或细胞核所在的每个孔中加入所述杂交引物，加入每个孔中的杂交引物的所述第二细胞标签序列均不同，在杂交缓冲液存在的情况下使所述第一连接序列和所述第二连接序列杂交，杂交结束后，每个孔中加入双倍的封闭引物以封闭孔内多余的杂交引物，封闭结束后将所有细胞收集起来并混合，s5，混合后的细胞用洗液清洗掉多余的杂交引物后，根据所述第一细胞标签和所述第二细胞标签的组合数，调整细胞密度，再均匀地分至多孔板中并在延伸试剂存在的情况下进行延伸；s6，利用所述第一pcr扩增引物组合进行第一pcr扩增，加入每个孔中的第一pcr扩增下游引物的所述第三细胞标签序列均不同，得到测序文库，
对测序文库进行高通量测序。7.根据权利要求6所述的测序方法，其特征在于，在对测序文库进行高通量测序之前，进一步包括：利用包括测序接头序列的引物组合进行第二pcr扩增。8.根据权利要求6所述的测序方法，其特征在于，步骤s1中，获得单细胞后，对细胞进行透化或利用取核裂解液提取细胞核，对透化后的细胞或提取的细胞核进行固定。9.根据权利要求6所述的测序方法，其特征在于，步骤s1中，所述对细胞或细胞核进行固定处理的方法包括：（1）用1
×
pbs重悬细胞或细胞核，加入50倍体积2~5% pfa，冰上固定30min~1h，期间不时进行混匀；（2）加入7~8倍体积2.5m甘氨酸吹匀，置于冰上10~20min终止固定，期间不时混匀；（3）4℃，300~800g离心3~10min，清洗沉淀，30~50μm滤网过滤。10.根据权利要求6~9任一所述的测序方法，其特征在于，任选地，在步骤s2之后，步骤s3之前，进一步包括进行外切酶切除多余所述反转录引物的步骤；任选地，在步骤s4中，在杂交之后，延伸之前，进一步包括对所述杂交引物进行封闭的步骤。

技术总结
本发明公开了一种基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒及测序方法，属于单细胞测序技术领域。所述试剂盒包括：反转录引物，包括第一细胞标签序列和捕获序列；末端转移酶，用于反转录得到的cDNA序列添加第一连接序列；杂交引物，用于添加第二细胞标签序列；还包括含有第三细胞标签序列的第一PCR扩增引物组合。本发明的试剂盒和方法能够一次性标记并获得百万至千万级别的单细胞特异性转录组信息，并且直接延伸来合成完整双链DNA分子，提高反应效率的同时也大大降低了大规模高通量实验的成本，并且操作简便，耗时短，无需借助于额外仪器、通量高，在单细胞测序领域有很好的实际应用价值和推广价值。用价值和推广价值。用价值和推广价值。


技术研发人员：郭国骥 韩晓平 杨蕾 王雪怡 汪仁英
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/8/1