抗原结合蛋白的制作方法

抗原结合蛋白
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年7月31日提交的美国临时申请号63/059,387的优先权，其通过引用整体并入本文。
3.序列表
4.本技术含有已经以ascii格式电子提交的序列表，并且其据此通过引用整体并入本文。所述ascii副本创建于2021年7月6日，命名为pu66960_sl.txt，并且大小为265,335字节。
发明领域
5.本发明涉及与bmp1、tll1和/或tll2特异性结合的抗原结合蛋白及其药物组合物和用途。本发明还涉及含有抗原结合蛋白的药物组合物及其用途。
6.发明背景
7.纤维状胶原蛋白是支持组织完整性和维持细胞微环境以实现正常生理功能的细胞外基质主要部分。纤维状胶原蛋白家族的主要同种型胶原蛋白i-iii作为含有n末端和c末端前肽的原胶原蛋白前体而合成。原胶原蛋白通过脯氨酸羟基化进行翻译后修饰，并被分泌到血管周围间隙进行进一步加工。adamts(具有血小板反应蛋白重复的去整合素和金属蛋白酶(a distintegrin and metalloproteinase with thrombospondin repeats))家族的蛋白酶随后切割胶原蛋白的n末端前肽，而包括bmp1(骨形态发生蛋白1)、tll1(tolloid样1)和tll2(tolloid样2)在内的金属蛋白酶tolloid家族加工c末端的前肽(hopkins,d.r.et al.,matrix biology,2007,26,508-523)。n末端和c末端前肽的切割均容许胶原蛋白进一步成熟，导致在赖氨酸残基处交联并形成不可溶性纤维状结构(shoulders,m.d.et al.,annual review of biochemistry,2009,78,929-958)。
8.虽然bmp1、tll1和tll2蛋白由单独的基因编码，该家族还包括bmp1的同种型，其包括由相同基因产物的可替代的剪接获得的多种bmp1同种型(参见例如takahara,k.,et al.,the journal of biological chemistry,1994,269.32572-32578；以及cvetjeticanin,b.et al.,medical hypotheses,2014,83,656-658)。将最初发现的bmp1形式命名为bmp-1-1或bmp1-1。已经在转录水平上描述了由剪接变体rna转录本编码的其他bmp1同种型并用连续的后缀命名，例如，如bmp-1-2、bmp-1-3、bmp-1-4、bmp-1-5、bmp-1-6和bmp-1-7(参见，例如wozney et al.,science(1988),242:1528-1534；kessler etal.,science,(1996)271:360-362；li et al.,proc.natl.acad.sci.usa(1996),93:5127-5130；janitz et al.,j.mol.med.(1998),76:141-146；takahara et al.,j.biol.chem.(1994),269:32572-32578；以及ge and greenspan,birth defect res.(2006),78:47-68)。
9.在患有各种疾病的患者的血液中和在健康人体内循环时，许多bmp1同种型已经在蛋白质水平上得到了确认(参见，例如，国际专利公布号wo 2008/011193和wo 2013/163479，以及grgurevic et al.,j.am.soc.nephrol.(2011),21:681-692)。此外，bmp1在加
工在各种疾病中导致纤维化和疤痕组织的原胶原蛋白中的作用以及在患有各种疾病的患者中包含个体bmp1同种型的血液概况的发现，已经使bmp1成为开发新疗法的有吸引力的靶标(参见，例如wo 2008/011193；wo 2013/163479；grgurevic et al.,j.am.soc.nephrol.(2011),21:681-692,cvetjeticanin,b.et al.,medical hypotheses,2014,83,656-658；以及turtle et al.,expert opin.ther.patents(2004),14(8):1185-1197)。
10.细胞外基质(ecm)蛋白(包括胶原蛋白)的过度产生可以导致各种器官或组织的纤维化病变，这可能与组织硬度增加、实质取代、异常电导、硬化性伤口愈合(例如梗塞和烧伤)和/或细胞-细胞相互作用异常相关联。例如，在患有以下疾病的患者中一致地观察到纤维化和胶原蛋白产生增加：急性和慢性心脏病例如心力衰竭、心律失常、肥厚型心肌病和心肌梗塞(lopez,b.et al.,circulation,2010,121,1645-1654；ho,c.y.,et al.,new england journal of medicine,2010,363,552-563；kostin,s.et al.,cardiovascular research,2002,54,361-379；see,f.et al.,current pharmaceutical design,2005,11,477-487；cvetjeticanin,b.et al.medical hypotheses,2014,83,656-658)、慢性阻塞性肺病(“copd”)(salazar,l.m.,et al.,lung,2011,189,101-109)、肝硬化和非酒精性脂肪性肝炎(“nash”)(bataller,r.,et al.,journal of clinical investigation,2005,115,209-218)、特发性肺纤维化(chakraborty,s,et al.,expert opin investig drugs,2014,23,893-910)、胶原血管病例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和硬皮病(eckes,b.,et al.,j mol med,2014,92,913-924)、肌营养不良症(例如，serrano,a.c.,et al.,experimental cell research,2010,316,3050-3058；klingler,w.,et al.,acta myoligica,xxxi,2012,184-195)、慢性肾病(liu,y.,nature reviews nephrology,2011,7,684-696)、急性肾损伤(molitoris,b.,the journal of clinical investigation,2014,124,2355-2363；venkatachalam,m.a.et al.,am j physiol renal physiol 298:f1078-f1094,2010)、糖尿病肾病(sun,y.m.,et al.,biochemical and biophysical research communications,2013,433,359-361)、瘢痕瘤、伤口愈合、粘连、肥厚性瘢痕和其他与例如烧伤、手术和其他创伤相关联的疤痕(meier k.,et al.,expert opinion on emerging drugs,2006,11,39-47；malecaze,f.,et al.,investigative opthalmology and visual science,2014,55,6712-6721；van der weer,w.et al.,burns,2009,35,15-29)、以及中风、多发性硬化症和脊髓损伤(fernandez-klett,f.and piller,j.brain pathology,2014,24,404-13；rimar,d.et al.,arthritis&rheumatology,vol.66,no.3,march 2014,726-730)。因此，通过靶向bmp1、tll1和/或tll2途径减少过度的胶原蛋白产生和成熟可以是治疗纤维化病变(如这些疾病)的有效治疗策略。这得到了最近公开的研究的支持，这些研究在小型动物心脏病和肾病模型中使用抑制bmp1、tll1和/或tll2活性的药物(grgurevic,l,etal.,journal of the american society of nephrology,2011,21,681-692；he,w.,etal.,proceedings of the national academy of sciences,2010,107,21110-21115；cvetjeticanin,b.et al.,medical hypotheses,2014,83,656-658；国际专利公布号wo 2008/011193和wo 2013/163479)。
11.金属蛋白酶tolloid家族(bmp1、tll1和tll2)具有除胶原蛋白以外额外的底物，这些底物也可以有助于其在促进ecm蛋白产生中的作用。例如，已经显示赖氨酰氧化酶1(lox1)的原形式(pro-form)是bmp1的底物，并且bmp1的切割增强lox酶活性并因此诱导胶
原蛋白交联(uzel,m.i.,et al.,journal of biological chemistry,2001,276,22537-22543)。因此，bmp1经由该机制在病理性组织僵硬的发展中也发挥作用，例如在青光眼中(tovar-vidales,t.,et al.,investigative ophthalmology&visual science,2013,54,4741-4748)以及在心脏舒张功能障碍中(lopez,b.,et al.,american journal of physiology-heart and circulatory physiology,2010,299,h1-h9)。也已经显示bmp1切割tge-β结合蛋白(ltbp)，容许tgf-β作用增强以诱导进一步的胶原蛋白产生(ge,g.,et al.,journal of cell biology,2006,175,1 11-120)。bmp1对tgf-β的调节还可以在其他病理学中发挥作用，如癌细胞转移和侵袭的控制(wu,x.,et al.oncogene,2014,33,1506-1514)。类似地，bmp1、tll1和/或tll2还通过蛋白水解加工相互作用的蛋白来激活范围更广的其他tgf-β样分子，如bmp2和bmp4(hopkins,d.r.et al.,matrix biology,2007,26,508-523)。bmp1与其各种底物的联合作用表明，bmp1、tll1和tll2是组织ecm产生/成熟的关键调节物，并且金属蛋白酶tolloid家族的成员是抗纤维化治疗干预的特别有效的靶标。
12.bmp1、tll1和tll2还可以经由额外的底物加工影响其他生物学途径。具体地，它们可以经由促进肌肉抑制素(myostatin)的激活来影响肌肉生物学。肌肉抑制素是对肌肉生长进行负调节的激素(lee,s.j.,2004,annual review of cell&developmental biology,20,61-86)。已经证明了bmp1切割肌肉抑制素的抑制性前肽，从而增强肌肉抑制素的活性(wolfman n.m.,et al.,proceedings of the national academy of sciences,2003,100,15842-15846)。小鼠中tll2的敲除证明了肌肉质量增加，从而为tolloid金属蛋白酶和肌肉抑制素之间的联系提供了支持(lee,s.j.,plos one,2008,3,e1628)。因此，bmp1、tll1和/或tll2的抑制剂对肌肉功能或肌肉质量减退的疾病可以是有益的，这些疾病包括与例如心力衰竭、ckd、copd、癌症或老年相关联的肌营养不良症、肌肉减少症和恶病质(cachexia)。
13.总之，bmp1、tll1和tll2的生物学为它们在胶原蛋白加工、组装和交联中的关键作用提供了支持，导致维持组织完整性和适当的细胞微环境的纤维状胶原蛋白网络的形成。该蛋白质家族在纤维化病况的病因学中也发挥重要作用(例如在心脏、肺、骨骼肌、肾、肝脏、皮肤、脉管系统、神经系统和眼睛中)，并且这些金属蛋白酶的抑制剂可以作为抗纤维化剂为与纤维化相关的疾病的治疗提供广泛的益处，这些疾病例如心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、肥厚型心肌病、慢性肾病(ckd)、肾后性急性肾损伤(post-acute kidney injury)、糖尿病肾病、移植后移植物功能延迟、慢性阻塞性肺病(copd)、特发性肺纤维化(ipf)、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肌营养不良症(例如duchenne、becker、肢带型、先天性、面肩肱型、肌强直性、眼咽、远端型和emery-dreifuss)、青光眼、角膜疤痕、瘢痕疙瘩、伤口愈合、粘连、增生性疤痕、其他例如与烧伤、手术或其他创伤相关联的疤痕、中风、胶原血管病(如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和硬皮病)、脊髓损伤和多发性硬化症。此外，基于bmp1、tll1和tll2抑制剂对肌肉生长抑制素生物学的影响，它们在肌肉疾病中可以具有额外的治疗应用，特别是在与例如心力衰竭、ckd、copd、癌症或老年相关联的肌营养不良症(例如，duchenne、becker、肢带型、先天性、面肩胛肱型、肌强直性、眼咽、远端型和emery-dreifuss)、肌肉减少症和恶病质中。
14.发明概述
15.根据本发明的第一方面，提供了bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含：
16.(a)(i)选自来自seq id no:7、22、40、54、67、82、96、110、124、138、152、166、180、194、207和222的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:8、21、39、53、68、81、95、109、123、137、151、165、179、193、208和221的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
17.(b)包含与seq id no:7、22、40、54、67、82、96、110、124、138、152、166、180、194、207或222的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:8、21、39、53、68、81、95、109、123、137、151、165、179、193、208或221的序列至少80％相同的序列的vl区。
18.在一个实施方案中，提供了包含以下6个cdr的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白：
19.rasqsvssyla(seq id no:1)的lcdr1；
20.dasnrat(seq id no:2)的lcdr2；
21.qqsdswppt(seq id no:3)的lcdr3；
22.gyyms(seq id no:4)的hcdr1；
23.winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)的hcdr2；和
24.dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)的hcdr3。
25.在一个实施方案中，提供了bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含与seq id no:7 100％相同的vh区和与seq id no:8 100％相同的vl区。
26.在一个实施方案中，提供了bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含与seq id no:9 100％相同的轻链和与seq id no:10 100％相同的重链。
27.根据本发明另一方面，提供了编码如本文所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白的多核苷酸序列。
28.根据本发明另一方面，提供了包含如本文所限定的多核苷酸序列的表达载体。
29.根据本发明另一方面，提供了包含如本文所限定的多核苷酸序列或如本文所限定的表达载体的重组宿主细胞。
30.根据本发明另一方面，提供了包含如本文所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白和药学上可接受的稀释剂或载剂的药物组合物。
31.根据本发明另一方面，提供了用于治疗有此需要的受试者的纤维化相关疾病或病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所限定的药物组合物。
32.根据本发明另一方面，提供了在治疗中使用的如本文所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所限定的药物组合物。
33.根据本发明另一方面，提供了在治疗纤维化相关疾病或病症中使用的如本文所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所限定的药物组合物。
34.根据本发明另一方面，提供了如本文所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所限定的药物组合物在制备用于治疗纤维化相关疾病或病症的药物中的用途。
35.根据本发明另一方面，提供了用于在有此需要的受试者中促进肌肉生长和/或改善肌肉功能的方法，其包括向受试者施用如本文所限定的治疗有效量的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所限定的药物组合物。
36.根据本发明另一方面，提供了在促进肌肉生长和/或改善肌肉功能中使用的如本文所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所限定的药物组合物。
37.根据本发明另一方面，提供了如本文所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所限定的药物组合物在制备用于促进肌肉生长和/或改善肌肉功能的药物中的用途。
38.附图简述
39.图1：fret测定测量抗bmp1/tll抗体分子对62.5pm人bmp-1活性的抑制。对13y039-4b06-4334、13y039-3e07-2944和13y039-8f02-2949绘制了剂量反应曲线。从75nm的最高浓度以3倍稀释系列在11个点间对抗体进行了测试。附图显示了一式两份数据点的平均值，以标准偏差作为误差条。
40.图2：fret测定测量抗bmp1/tll抗体分子对50pm小鼠bmp-1活性的抑制。对13y039-4b06-4334、13y039-3e07-2944和13y039-8f02-2949绘制了剂量反应曲线。从75nm的最高浓度以3倍稀释系列在11个点间对分子进行了测试。附图显示了一式两份数据点的平均值，以标准偏差作为误差条。
41.图3：fret测定测量抗bmp1/tll抗体分子对250pm生物素化的人tll-1活性的抑制。对13y039-4b06-4334、13y039-3e07-2944和13y039-8f02-2949绘制了剂量反应曲线。从75nm的最高浓度以3倍稀释系列在11个点间对分子进行了测试。附图显示了一式两份数据点的平均值，以标准偏差作为误差条。
42.图4：fret测定测量抗bmp1/tll抗体分子对500pm人tll-2活性的抑制。对13y039-4b06-4334、13y039-3e07-2944和13y039-8f02-2949绘制了剂量反应曲线。从75nm的最高浓度以3倍稀释系列在11个点间对分子进行了测试。附图显示了一式两份数据点的平均值，以标准偏差作为误差条。
43.图5：fret测定测量抗bmp1/tll抗体分子对800pm生物素化的小鼠tll-1活性的抑制。对13y039-4b06-4334、13y039-3e07-2944和13y039-8f02-2949绘制了剂量反应曲线。从75nm的最高浓度以3倍稀释系列在11个点间对分子进行了测试。附图显示了一式两份数据点的平均值，以标准偏差作为误差条。
44.图6：fret测定测量抗bmp1/tll抗体分子对2.5nm大鼠tll-1活性的抑制。对13y039-4b06-4334、13y039-3e07-2944和13y039-8f02-2949绘制了剂量反应曲线。从75nm的最高浓度以3倍稀释系列在11个点间对分子进行了测试。附图显示了一式两份数据点的平均值，以标准偏差作为误差条。
45.图7：fret测定测量抗bmp1/tll抗体分子对2.5nm大鼠tll-2活性的抑制。对13y039-4b06-4334、13y039-3e07-2944和13y039-8f02-2949绘制了剂量反应曲线。从75nm的最高浓度以3倍稀释系列在11个点间对分子进行的测试。附图显示了一式两份数据点的平均值，以标准偏差作为误差条。
46.图8：fret测定测量抗bmp1/tll抗体分子对750pm生物素化的cyno tll-1活性的抑制。对13y039-4b06-4334、13y039-3e07-2944和13y039-8f02-2949绘制了剂量反应曲线。从75nm的最高浓度以3倍稀释系列在11个点间对分子进行了测试。附图显示了一式两份数据点的平均值，以标准偏差作为误差条。
47.图9：fret测定测量抗bmp1/tll抗体分子对8nm生物素化的cyno tll-2活性的抑制。对13y039-4b06-4334绘制了剂量反应曲线，对其从600nm的最高浓度以3倍稀释系列在22个点间进行了测试。附图显示了一式两份数据点的平均值，以标准偏差作为误差条。
48.图10：通过elisa测量的13y039-4b06-4334(hek表达的和cho表达的抗体)与人c1q
的结合。
49.图11：抗bmp-1/tll抗体13y039-4b06-4334对潜在复合物切割的抑制—msd测定以测量释放的肌肉生长抑制素。
50.图12：小鼠angii/pe模型中研究的来自动物的血浆bmp1活性。为了参考，在未接受过渗透泵或i.p注射(最右侧的白色条)的未经处理小鼠中确定了血浆bmp1水平。化合物a-d是克隆为反向嵌合mab的抗体，具有在小鼠igg2a laga fc和小鼠κ上的人可变区(本文将4b06-4334称为化合物a并将3e07-2944称为化合物b)以及在大鼠igg2b laga fc和大鼠κ上的人可变区(本文将4b06-4334称为化合物c并将3e07-2944称为化合物d)。(通过未配对t检验比较的angii/pe相对于盐水，*p《0.05；通过单因素anova比较的angii/pe相对于mab组，#p《0.05，####p《0.0001；rsv对照相对于剂量配对的化合物a或e07，####p《0.0001)。
51.图13：小鼠angii/pe模型中来自选择的组的血浆picp测量。通过多重免疫印迹测量了picp水平。每个凝胶含有所有angii/pe+盐水样品以及其他测试组之一。在每个凝胶上，将所有条带强度归一化为相应的angii/pe+盐水组的平均值。然后将数据组合在一张图表中以进行可视化。(通过未配对t检验比较的angii/pe+盐水相对于其他组，****p《0.0001)。
52.图14：angii/pe模型中化合物a对骨骼肌质量的影响。处理组上方黑色显示的百分比是指超过angii/pe组的归一化的腓肠肌重量的增加，而红色显示的百分比是指超过模型窗口的增加(盐水-盐水组与angii/pe-盐水组的区别。)(通过未配对t检验比较的angii/pe相对于盐水，**p《0.01；通过单因素anova比较的angii/pe相对于mab组，#p《0.05，###p《0.001，####p《0.0001)。
53.图15：angii/pe模型中化合物a对总血浆肌肉生长抑制素(mstn)水平的影响。通过elisa测量了总血浆肌肉生长抑制素。相对于angii/pe对照表达倍数变化。(通过未配对t检验比较的angii/pe相对于盐水，**p《0.01；通过单因素anova比较的angii/pe相对于mab组，##p《0.01，####p《0.0001；rsv对照相对于剂量配对的化合物a或化合物b，##p《0.01，###p《0.001，####p《0.0001)。
54.图16：小鼠angii/pe研究中左心室羟脯氨酸(hdxp)含量。计算相比于angii/pe组的百分比变化。(通过未配对t检验比较的angii/pe相对于盐水，****p《0.0001；通过单因素anova(单侧)比较的angii/pe相对于mab组，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001；通过单因素anova(单侧)比较的rsv对照相对于剂量配对的化合物a，#p《0.05)。
55.图17a和17b：大鼠dahl s模型中化合物c对纤维化(图17a)和骨骼肌质量(图17b)的影响。图17a：在大鼠dahl s研究中通过masson三色组织病理学染色定量评估测量的左心室纤维化。(通过未配对t检验比较的pbs+0.3％ nacl相对于pbs+8％ nacl，**p《0.01；通过单因素anova比较的pbs+8％ nacl相对于化合物c+8％ nacl，#p《0.05)。图17b：与pbs+8％nacl相比，化合物c处理组表现出9％的骨骼肌质量的增加，并且与抗rsv处理组相比，化合物c处理组表现出10％的增加。(通过单因素anova比较的pbs+8％ nacl相对于mab组，**p《0.01)。
56.图18：老年小鼠后肢固定后2周恢复期中的瘦重量测量。数据显示为绝对瘦重量的时间进程(左)和相对于夹板后测量的百分比变化(右)。(通过单因素anova比较的瘦重量变化百分比。化合物a相对于抗rsv mab：*p《0.05，**p《0.01；抗肌肉生长抑制素mab相对于抗
rsv mab：#p《0.05)。
57.图19：在老年小鼠的后肢固定研究结束时测量的腓肠肌(左)和比目鱼肌(右)湿重。空方块是未经夹板固定的左后肢的重量，而实心方块是夹板固定的右后肢的重量。(通过双因素anova比较的肌肉重量。未经夹板固定肢的化合物a或抗肌肉生长抑制素mab相对于抗rsv mab，*p《0.05，****p《0.0001；夹板固定肢的化合物a或抗肌肉生长抑制素mab相对于抗rsv mab，*p《0.05，***p《0.001，****p《0.0001；夹板固定肢相对于未经夹板固定肢，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)。
58.图20：通过老年小鼠的后肢固定研究纵向确定的体内肌肉收缩性测量。将肌肉收缩性值显示为绝对强直力测量(左图)、相对于夹板固定后的强直力值(中图)和归一化为腓肠肌湿重的强直力(右图)。(通过单因素anova比较的相对强直力：化合物a相对于抗rsv mab，*p《0.05，抗肌肉生长抑制素mab相对于抗rsv mab，#p《0.05。通过单因素anova比较的归一化的力，**p《0.01)。
59.发明详述
60.定义
61.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用，以下术语具有以下赋予它们的含义。
62.如本文所用的术语“bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白”是指能够与bmp1(骨形态发生蛋白1)、tll1(tolloid样1)和/或tll2(tolloid样2)结合的抗体和其他蛋白质构建体，如结构域。术语“bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白”和“抗原结合蛋白”在本文中可互换使用。这不包括天然同源配体或受体。
63.术语“抗体”在本文中以最广义使用，是指具有免疫球蛋白样结构域(例如igg、igm、iga、igd或ige)的分子，包括单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)和异源缀合抗体；单个可变结构域(例如，结构域抗体(dab))、抗原结合抗体片段、fab、f(ab
′
)2、fv、二硫键连接的fv、单链fv、二硫键连接的scfv、双抗体(diabody)、tandabs等以及前述任一项的修饰型式(对于替代“抗体”形式的总结，参见holliger and hudson,nature biotechnology,2005,vol 23,no.9,1126-1136)。
64.在本文中可互换使用的关于抗体的术语“全”、“整个”或“完整”是指具有大约150,000道尔顿的分子量的异四聚体糖蛋白。完整的抗体由通过共价二硫键连接的两条相同的重链(hc)和两条相同的轻链(lc)组成。这种h2l2结构折叠形成三个功能结构域，包含两个抗原结合片段(称为“fab”片段)和一个“fc”可结晶片段。fab片段由氨基末端的可变结构域(可变重链(vh)或可变轻链(vl))和羧基末端的恒定结构域(ch1(重链)和cl(轻链))构成。fc片段由配对的ch2和ch3区二聚化形成的两个结构域构成。fc可以通过与免疫细胞上的受体结合或通过结合经典补体途径的第一个组分c1q来引发效应子功能。五类抗体igm、iga、igg、ige和igd由不同的重链氨基酸序列定义，这些重链分别称为μ、α、γ、ε和δ，每条重链可以与κ或λ轻链配对。血清中的大多数抗体属于igg类，人igg有四种同种型(igg1、igg2、igg3和igg4)，其序列主要在铰链区不同。
65.可以使用多种方法获得全人抗体，例如使用能够产生人抗体库的基于酵母的文库或转基因动物(例如小鼠)。可以使用基于facs(荧光激活细胞分选)的方法或通过使用标记
的抗原在珠子上捕获来选择在其表面上呈递与感兴趣的抗原结合的人抗体的酵母。可以用感兴趣的抗原对已经过修饰以表达人免疫球蛋白基因的转基因动物进行免疫，并使用b细胞分选技术分离抗原特异性人抗体。然后可以表征使用这些技术产生的人抗体的期望的特性，如亲和力、可开发性和选择性。
66.替代抗体形式包括替代支架，其中抗原结合蛋白的一个或多个cdr能够排列到合适的非免疫球蛋白蛋白质支架或骨架上，如亲和体、spa支架、ldl受体a类结构域、avimer(参见，例如，美国专利申请公布号2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)或egf结构域。
67.贯穿本说明书所使用的术语“中和”意指在体外或体内，与不存在抗原结合蛋白的情况下bmp1、tll1和/或tll2的活性相比，在如本文所描述的抗原结合蛋白存在的情况下bmp1、tll1和/或tll2的生物学活性降低。中和可以是由于阻断bmp1、tll1和/或tll2与其靶底物的结合以及阻止bmp1、tll1和/或tll2切割其靶底物中的一种或多种。例如，实施例中所描述的基于荧光共振能量转移(fret)的测定可以用于评估bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白的中和能力。
68.将“cdr”定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。免疫球蛋白的可变部分中有三个重链cdr和三个轻链cdr(或cdr区)。因此，如本文所用的“cdr”是指所有三个重链cdr、所有三个轻链cdr、所有重链cdr和轻链cdr、或至少两个cdr。
69.贯穿本说明书，可变结构域序列中的氨基酸残基和全长抗原结合序列内(例如抗体重链序列或抗体轻链序列内)的可变结构域区根据kabat编号惯例进行编号。类似地，实施例中使用的和序列表中列出的术语“cdr”、“cdrl1”、“cdrl2”、“cdrl3”、“cdrh1”、“cdrh2”、“cdrh3”、“lcdr1”、“lcdr2”、“lcdr3”、“hcdr1”、“hcdr2”、“hcdr3”遵循kabat编号惯例。对于进一步的信息，参见kabat et al.,sequences of proteins of immunological interest,4th ed.,u.s.department of health and human services,national institutes of health(1987)。
70.对于本领域技术人员将显而易见的是，可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基存在替代的编号惯例。对于cdr序列也有替代的编号惯例，例如chothia et al.(1989)nature 342:877-883中提出的那些。抗原结合蛋白的结构和蛋白质折叠可以意味着其他残基被认为是cdr序列的一部分，并且技术人员将会这样理解。
71.技术人员可用的cdr序列的其他编号惯例包括“abm”(巴斯大学)和“contact”(伦敦大学学院)方法。
72.下表1-1代表对每个cdr或结合单元使用每种编号惯例的一个定义。表1中使用kabat编号方案对可变结构域氨基酸序列进行编号。应当注意，一些cdr定义可以根据所使用的各个出版物而改变。
73.表1-1
[0074][0075][0076]
可以通过至少一个氨基酸取代、缺失或添加来修饰cdr，其中变体抗原结合蛋白基本上保留未修饰蛋白的生物学特征。
[0077]
应当理解，可以对cdr h1、h2、h3、l1、l2、l3中的每一个进行单独修饰或以任何排列或组合与任何其他cdr组合修饰。在一个实施方案中，通过取代、缺失或添加多至3个氨基酸(例如1或2个氨基酸，例如1个氨基酸)来修饰cdr。通常，修饰是取代，特别是保守取代，例如如下表1-2所示。
[0078]
表1-2
[0079]
侧链成员疏水met、ala、val、leu、ile中性亲水cys、ser、thr酸性asp、glu碱性asn、gln、his、lys、arg影响链方向的残基gly、pro芳香族trp、tyr、phe
[0080]
例如，在变体cdr中，可以用保守氨基酸残基取代组成cdr的作为替代定义(例如kabat或chothia)的一部分的侧翼残基。
[0081]
此类包含如上文所述的变体cdr的抗原结合蛋白在本文中可以称为“功能性cdr变体”。
[0082]“抗原结合位点”是指抗原结合蛋白上能够与抗原特异性结合的位点，这可以是单个可变结构域，或者它可以是如能够在标准抗体上找到的成对的vh/vl结构域。单链fv(scfv)结构域也可以提供抗原结合位点。
[0083]
在一些实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白是抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段。
[0084]
如本文所用的抗体的片段(也可以称为“抗体片段”、“免疫球蛋白片段”、“抗原结合片段”或“抗原结合多肽”)是指与靶标(即bmp1、tll1和/或tll2)特异性结合的抗体的一部分(或含有所述部分的构建体)。术语抗体片段中涵盖的结合片段的示例包括：
[0085]
(i)fab片段(由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段)；
[0086]
(ii)f(ab
′
)2片段(由铰链区的二硫键连接的两个fab片段组成的二价片段)；
[0087]
(iii)fd片段(由vh和ch1结构域组成)；
[0088]
(iv)fv片段(由抗体单臂的vl和vh结构域组成)；
[0089]
(v)单链可变片段，scfv(由使用重组方法通过合成的接头连接的vl和vh结构域组成，该接头使它们能够制备成其中vl和vh区配对形成单价分子的单个蛋白质链)；
[0090]
(vi)vh(由vh结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域)；
[0091]
(vii)vl(由vl结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域)；
[0092]
(viii)结构域抗体(dab，由vh或vl结构域组成)；
[0093]
(ix)微型抗体(由经由ch3结构域连接的一对scfv片段组成)；和
[0094]
(x)双抗体(由scfv片段的非共价二聚体组成，该scfv片段由通过小肽接头连接的来自一种抗体的vh结构域和来自另一种抗体的vl结构域组成)。
[0095]“人抗体”是指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。所述人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过随机或位点特异性诱变或通过体细胞突变引入的突变)，例如在cdr中，并且特别是在cdr3中。然而，该术语并不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(如小鼠)种系的cdr序列已经被移植到人框架序列上的抗体。通过重组手段制备、表达、创建或分离的抗体，如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合人抗体库中分离的抗体、从用人免疫球蛋白基因进行转基因改造的动物(例如小鼠)分离的抗体或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他dna序列的任何其他手段制备、表达、创建或分离的抗体，也可以成为“重组人抗体”。
[0096]
用来自人可变结构域的相应残基取代非人免疫球蛋白可变结构域的框架区中的至少一个氨基酸残基称为“人源化”。可变结构域的人源化可以降低在人中的免疫原性。
[0097]
在一个实施方案中，本公开的抗原结合蛋白显示在人bmp1、tll1和/或tll2与来自另一物种的bmp1、tll1和/或tll2(如鼠、大鼠和/或食蟹猴bmp1、tll1和/或tll2)之间的交叉反应性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白特异性结合人和鼠bmp1、tll1和/或tll2。这是特别有用的，因为药物开发通常需要在人中测试药物之前先在小鼠系统中测试先导药物候选物。提供可以结合人类和小鼠物种的药物容许人们在这些系统中测试结果，并且使用相同的药物对数据进行并排比较。这避免了需要找到针对小鼠bmp1、tll1和/或tll2工作的药物和针对人bmp1、tll1和/或tll2工作的另一药物的复杂情况，并且还避免了比较使用不同药物的人和小鼠的结果的需要。还设想了疾病模型中使用的其他物种(如狗或猴子，如食蟹猴)之间的交叉反应性。
[0098]“特异性”是指特定抗体或其片段能够结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数量。抗体的特异性是抗体将特定抗原识别为独特的分子实体并将其与另一种抗原区分开的能力。与抗原或表位“特异性结合”的抗体是本领域熟知的术语。如果分子与特定靶抗原或表位的反应比与替代靶标的反应更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更强，则称该分子表现出“特异性结合”。如果与结合其他物质相比，抗体以更强的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合靶抗原或表位，则该抗体与靶抗原或表位“特异性结合”。
[0099]
由抗原与抗原结合多肽的解离平衡常数(kd)表示的“亲和力”是抗原决定簇与抗体(或其片段)上的抗原结合位点之间结合强度的测量：kd值越小，抗原决定簇与抗原结合多肽之间的结合强度越强。可选地，亲和力也可以表示为亲和常数(ka)，即1/kd。亲和力可以根据感兴趣的特定抗原通过已知方法确定，如平衡方法(例如酶联免疫吸附测定(elisa)或放射免疫测定(ria))或动力学(例如biacore分析)。例如，实施例中描述的biacore方法
可以用于测量结合亲和力。
[0100]
亲合力，也称为功能亲和力，是在多个相互作用位点结合的累积强度，例如两个分子(或更多，例如在双特异性或多特异性分子的情况下)在多个位点彼此结合的强度的总和，例如考虑到相互作用的效价。
[0101]
如本文所用的术语“表位”是指与抗原结合蛋白的特定结合结构域接触的抗原的部分，也称为互补位。表位可以是线性的或构象的/不连续的。构象或不连续表位包含由其他序列分开的氨基酸残基，即通过多肽链的三级折叠组装的不在抗原的一级序列的连续序列中。尽管残基可以来自多肽链的不同区域，但它们在抗原的三维结构中非常接近。在多聚体抗原的情况下，构象或不连续表位可以包括来自不同肽链的残基。可以通过计算机建模程序或经由通过本领域已知方法如x射线晶体学获得的三维结构来确定包含在表位内的特定残基。可以使用本领域技术人员已知的各种技术进行表位作图，如在出版物如methods in molecular biology
‘
epitope mapping protocols’,mike schutkowski and ulrich reineke(volume 524,2009)和johan rockberg and johan nilvebrant(volume 1785,2018)中所描述的。示例性方法包括基于肽的方法如pepscan，由此使用如elisa的技术或通过例如在噬菌体上进行肽或蛋白质突变体的大型文库的体外展示来筛选一系列重叠肽的结合。可以通过结构技术包括x射线晶体学、溶液核磁共振(nmr)光谱学和冷冻电子显微镜(cryo-em)来确定详细的表位信息。如丙氨酸扫描的诱变是有效的方法，由此使用结合丧失来分析表位作图。另一种方法是与蛋白水解和液相色谱质谱(lc-ms)分析结合的氢/氘交换(hdx)来表征不连续或构象表位。
[0102]
可通过本领域技术人员已知的一种或多种技术(如elisa、fmat、表面等离子体共振(spr)或fortebio octet生物层干涉法(bli))确定本发明的bmp1/tll1/tll2结合蛋白与参考bmp1/tll1/tll2结合蛋白(例如参考抗体)之间的竞争。此类技术也可以称为表位鉴定(epitope binning)。这种竞争有几个可能的原因：两种蛋白质可以与相同或重叠的表位结合，可以存在结合的空间抑制，或者第一蛋白质的结合可以诱导抗原的构象变化，从而阻止或减少第二蛋白质的结合。
[0103]
生物学活性的降低或抑制可以是部分的或全部的。中和抗原结合蛋白可以将bmp1、tll1和/或tll2的活性中和相对于不存在抗原结合蛋白的情况下bmp1、tll1和/或tll2活性的至少20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0104]
在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白(即多肽)是分离的。“分离的”抗原结合蛋白是从其原始环境中移除的抗原结合蛋白。术语“分离的”可以用于指代基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗原结合蛋白的抗原结合蛋白(例如，特异性结合bmp1、tll1和/或tll2的分离的抗原结合蛋白或其片段基本上不含特异性结合除bmp1、tll1和/或tll2之外的抗原的抗原结合蛋白)。术语“分离的”也可以用于指代制剂，其中分离的抗原结合蛋白足够纯以在配制为药物组合物的活性成分时进行治疗性施用，或至少70-80％(w/w)纯，更优选地，至少80-90％(w/w)纯，甚至更优选地，90-95％(w/w)纯；并且，最优选地，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯。
[0105]
在一些实施方案中，用于本发明的多核苷酸是分离的。“分离的”多核苷酸是从其原始环境中移除的多核苷酸。例如，如果将天然存在的多核苷酸与天然系统中的一些或全
部共存物质分离，则它是分离的。例如，如果多核苷酸被克隆到不是其天然环境的一部分的载体中，或者如果它被包含在cdna内，则认为多核苷酸是分离的。
[0106]
为了比较两个密切相关的多肽序列，可以使用ncbi blast v2.0，使用多肽序列的标准设置(blastp)来计算第一多肽序列和第二多肽序列之间的“序列同一性％”。为了比较两个密切相关的多核苷酸序列，可以使用ncbi blast v2.0，使用核苷酸序列的标准设置(blastn)来计算第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性％”。
[0107]
如果多肽或多核苷酸序列在它们整个长度上共享100％的序列同一性，则称该多肽或多核苷酸序列与其他多肽或多核苷酸序列相同或“相同(identical)”。序列中的残基从左到右编号，即从多肽的n-到c-末端；从多核苷酸的5
′
至3
′
末端。
[0108]
序列之间的“差异”是指与第一序列相比，第二序列的位置中单个氨基酸残基的插入、缺失或取代。两个多肽序列可以含有一个、两个或更多个此类氨基酸差异。另外地与第一序列相同(100％序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代导致序列同一性％降低。例如，如果相同序列的长度为9个氨基酸残基，则第二序列中的一个取代导致序列同一性为88.9％。如果第一和第二多肽序列的长度为9个氨基酸残基并且共享6个相同的残基，则第一和第二多肽序列共享大于66％的同一性(第一和第二多肽序列共享66.7％的同一性)。
[0109]
或者，为了比较第一个参考多肽序列与第二个比较多肽序列，可以确定为产生第二序列而对第一序列进行的添加、取代和/或删除的数量。“添加”是将一个氨基酸残基添加到第一多肽的序列中(包括在第一多肽的任一末端添加)。“取代”是用一个不同的氨基酸残基取代第一多肽序列中的一个氨基酸残基。所述取代可以是保守的或非保守的。“缺失”是从第一多肽的序列中删除一个氨基酸残基(包括在第一多肽的任一末端的缺失)。
[0110]
如本文所用，术语“载体”旨在指代能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，它是指环状双链dna环，额外的dna片段可以连接到其中。载体的另一种类型是病毒载体，其中额外的dna片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物和酵母载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，用于重组dna技术的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，以及噬菌体和噬菌粒系统。如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指代其中已引入重组表达载体的细胞。此类术语旨在不仅指代特定的主题细胞而且指代此类细胞的后代。
[0111]
提及“受试者”、“患者”或“个体”是指待治疗的受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、农场动物(如牛)、运动动物或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，受试者是人。在替代性实施方案中，受试者是非人哺乳动物，如小鼠。
[0112]
术语“足量”意指足以产生期望的效果的量。术语“治疗有效量”是有效改善疾病或病症的症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。
[0113]
如本文所用，术语“约”在本文中使用时包括与指定值相比多最高达并包括10％以及与指定值相比少最高达并包括10％，特别是与指定值相比多最高达并包括5％，并且低最高达并包括5％。术语“之间”包括指定边界的值。
[0114]
技术人员将理解，在宿主细胞中产生抗原结合蛋白如抗体后，可以发生翻译后修饰。例如，这可以包括某些前导序列的切割、以各种糖基化样式添加各种糖部分、非酶促糖化、脱酰胺、氧化、二硫键加扰和其他半胱氨酸变体，如游离巯基、外消旋二硫化物、硫醚和三硫键、异构化、c末端赖氨酸剪切和n末端谷氨酰胺环化。本发明涵盖已经经受或已经经历一种或多种翻译后修饰的抗原结合蛋白的使用。因此，本发明的“抗原结合蛋白”或“抗体”分别包括如前文所定义的已经经历如本文所描述的翻译后修饰的“抗原结合蛋白”或“抗体”。
[0115]
糖化是还原糖(如葡萄糖)与蛋白质中游离胺基团之间的翻译后非酶促化学反应，通常在赖氨酸侧链的ε胺或蛋白质的n末端观察到。只有在还原糖存在的情况下，才能够在生产和储存过程中发生糖化。
[0116]
能够在生产和储存过程中发生的脱酰胺是酶促反应，主要以大约3:1的比率将天冬酰胺(n)转化为异天冬氨酸和天冬氨酸(d)。因此，脱酰胺反应与天冬氨酸(d)异构化为异天冬氨酸有关。天冬酰胺的脱酰胺和天冬氨酸的异构化均涉及中间体琥珀酰亚胺。在更小的程度上，谷氨酰胺残基可以以类似的方式发生脱酰胺。脱酰胺可发生在cdr、fab(非cdr区)或fc区中。
[0117]
氧化可以在生产和储存期间发生(即在氧化条件存在的情况下)并导致蛋白质的共价修饰，直接由活性氧种类诱导或通过与氧化应激的次级副产物反应间接诱导。氧化主要发生在甲硫氨酸残基上，但也可以发生在色氨酸和游离半胱氨酸残基上。氧化可发生在cdr、fab(非cdr)区或fc区中。
[0118]
二硫键加扰可以在生产期间和碱性储存条件下发生。在某些情况下，二硫键可以断裂或错误地形成，导致未配对的半胱氨酸残基(-sh)。这些游离(未配对)的巯基(-sh)可以促进改组。
[0119]
硫醚的形成和二硫键的外消旋化可以在生产或储存中在碱性条件下通过二硫桥接的β消除经由脱氢丙氨酸和过硫化物中间体回到半胱氨酸残基而发生。随后脱氢丙氨酸和半胱氨酸的交联导致硫醚键的形成，或者游离半胱氨酸残基可以与d-和l-半胱氨酸的混合物重新形成二硫键。
[0120]
三硫化物由硫原子插入二硫键(cys-s-s-s-cys)产生，并且由于生产细胞培养物中硫化氢的存在而形成。
[0121]
重链和/或轻链中的n末端谷氨酰胺(q)和谷氨酸(e)可能会经由环化形成焦谷氨酸(pglu)。大多数pglu形成发生在生产生物反应器中，但它可以非酶促形成，取决于加工和储存条件的ph和温度。n末端q或e的环化通常在天然人抗体中观察到。
[0122]
c末端赖氨酸剪切是由羧肽酶催化的酶促反应，通常在重组和天然人抗体中观察到。该过程的变体包括由于来自重组宿主细胞的细胞酶而从一条或两条重链去除赖氨酸。对人受试者/患者施用后，可能会导致任何剩余的c末端赖氨酸的去除。
[0123]
可以应用fc工程化方法修饰抗体的功能或药代动力学特性。可以通过在fc区进行突变来改变效应子功能，这些突变增加或减少与c1q或fcγ受体的结合并且分别修饰cdc或
adcc活性。也可以对抗体的糖基化样式进行修饰以改变效应子功能。可以通过制备影响fc与fcrn(新生儿fc受体)结合的突变来改变抗体的体内半衰期。
[0124]
如本文所用的术语“效应子功能”是指一种或多种抗体介导的效应，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体介导的补体激活，包括补体依赖性细胞毒性(cdc)、补体依赖性细胞介导的吞噬作用(cdcp)、抗体依赖性补体介导的细胞裂解(adcml))和fc介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。
[0125]
认为抗原结合蛋白或抗体的fc区与各种fc受体(fcr)(包括fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)、fcrn、c1q和ii型fc受体)之间的相互作用介导抗原结合蛋白或抗体的效应子功能。显著的生物学效应可以是效应子功能的结果。通常，介导效应子功能的能力需要抗原结合蛋白或抗体与抗原的结合，并且并非所有抗原结合蛋白或抗体都会介导每种效应子功能。
[0126]
可以通过多种方式评估效应子功能，例如，评估由自然杀伤(nk)细胞经由fcγriii或单核细胞/巨噬细胞经由fcγri介导的包被到靶细胞的抗体的adcc效应子功能，或评估经由c1q的补体级联介导的包被到靶细胞的抗体的cdc效应子功能。例如，可以在自然杀伤细胞测定中评估本发明的抗原结合蛋白的adcc效应子功能。在shields et al,2001,the journal of biological chemistry,vol.276,p.6591-6604；chappel et al,1993,the journal of biological chemistry,vol 268,p.25124-25131；lazar et al,2006,pnas,103；4005-4010中可以找到此类测定的示例。确定cdc功能的测定的示例包括j imm meth,1995,184:29-38中描述的那些。
[0127]
可以评估突变对效应子功能(例如，fcrn结合、fcγr和c1q结合、cdc、adcml、adcc、adcp)的影响，例如，如grevys et al.,j immunol.2015jun1；194(11):5497
–
5508,or tam et al.,antibodies 2017,6(3)；monnet et al.,2014mabs,6:2,422-436中所描述的。
[0128]
贯穿本说明书，根据eu索引编号惯例对fc区、抗体序列或全长抗原结合蛋白序列中的氨基酸残基进行编号。
[0129]
人恒定区的一些同种型，特别是igg4和igg2同种型，基本上缺乏以下功能：a)通过经典途径激活补体；b)adcc。可以对抗原结合蛋白的重链恒定区实施各种修饰，以根据期望的效应特性改变效应子功能。已经描述了含有减少与fc受体的结合并降低效应子功能(如adcc和cdc)的特定突变的igg1恒定区(duncan et al.nature 1988,332；563-564；lund et al.j.immunol.1991,147；2657-2662；chappel et al.pnas 1991,88；9036-9040；burton and woof,adv.immunol.1992,51；1-84；morgan et al.,immunology 1995,86；319-324；hezareh et al.,j.virol.2001,75(24)；12161-12168)。
[0130]
在一个实施方案中，提供了包含使抗原结合蛋白具有降低的效应子功能(如降低的adcc和/或cdc)的恒定区的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白。在一个此类实施方案中，重链恒定区可以包含igg2或igg4同种型的天然失能的恒定区或突变的igg1恒定区。ep0307434中描述了合适的修饰的示例。一个示例包含在第235和237位(eu索引编号)用丙氨酸取代，即l235a和g237a(通常称为“laga”突变)。另一个示例包含在第234和235位(eu索引编号)用丙氨酸取代，即l234a和l235a(通常称为“lala”突变)。ep2691417和us8969526中描述的其他示例包含igg1 fc的p329g或p329r与lala突变的组合(eu索引编号)以及igg4 fc的p329g或p329r与s228p和l235e的组合(eu索引编号)。
[0131]
降低效应子功能的额外的改变和突变包括：(除非另有说明，否则参照igg1)：非糖基化的n297a或n297q或n297g；l235e；igg4:f234a/l235a；以及嵌合igg2/igg4。igg2:h268q/v309l/a330s/p331s和igg2:v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s可以减少fcγr和c1q结合(wang et al.2018和us8961967)。
[0132]
降低效应子功能的其他突变包括l234f/l235e/p331s；使用来自人igg2的ch1和铰链区以及来自人igg4的ch2和ch3区创建的嵌合抗体；igg2m4，基于igg2同种型，具有衍生自igg4的四个关键氨基酸残基变化(h268q、v309l、a330s和p331s)；含有v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s取代以消除对fcγ受体和c1q补体蛋白的亲和力的igg2σ；igg2m4(h268q/v309l/a330s/p331s，改变为igg4)；igg4(s228p/l234a/l235a)；huigg1 l234a/l235a(aa)；huigg4s228p/l234a/l235a；igg1σ(l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s)；igg4σ1(s228p/f234a/l235a/g237a/p238s)；和igg4σ2(s228p/f234a/l235a/δg236/g237a/p238s，其中δ表示缺失)(tam et al.,antibodies 2017,6(3))。
[0133]
抗原结合蛋白
[0134]
本文提供了能够与bmp1、tll1和/或tll2特异性结合的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，此类抗原结合蛋白是抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段。
[0135]
本文所描述的抗原结合蛋白通过与bmp1、tll1和/或tll2的催化结构域结合来中和bmp1、tll1和/或tll2的活性。不受任何理论的束缚，应当相信本发明的抗原结合蛋白通过bmp1、tll1和/或tll2中和来限制纤维化和减缓器官功能障碍。例如，bmp1/tll将可溶性原胶原蛋白i转化为不可溶性胶原蛋白原纤维从而导致纤维化，而本文所描述的抗原结合蛋白可以中和前胶原蛋白i的切割。应当相信，纤维化是跨越许多(如果不是全部)器官系统的组织损伤作出反应而发生的。虽然初始纤维化有利于组织完整性的维持，但过度纤维化导致疤痕形成和正常器官功能的抑制。因此，减少这种病理性纤维化有潜能延缓疾病进展。此外，bmp1抑制还可以促进肌肉生长，并且已经显示可以增加肌肉功能，因此也可以减少虚弱。
[0136]
在一个实施方案中，抗原结合蛋白是抗体或其片段，其中抗体或其片段是scfv、fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fv、可变结构域(例如vh或vl)、双抗体、微型抗体或单克隆抗体。在进一步的实施方案中，抗体或其片段是单克隆抗体。
[0137]
本发明的抗体可以是任何类别的，例如igg、iga、igm、ige、igd或它们的同种型，并且可以包含κ或λ轻链。在一个实施方案中，抗体是igg抗体，例如同种型igg1、igg2、igg3或igg4中的至少一种。在另外的实施方案中，抗体处于经修饰以赋予期望的特性的形式(如igg形式)，如使fc突变以降低效应子功能、延长半衰期、改变adcc或提高铰链稳定性。此类修饰如上文所述。
[0138]
在一个实施方案中，抗体或其片段是人的。因此，抗体或其片段可以衍生自人免疫球蛋白(ig)序列。抗体(或其片段)的cdr、框架和/或恒定区可以衍生自人ig序列，特别是人igg序列。cdr、构架和/或恒定区可以与人ig序列特别是人igg序列基本上相同。使用人抗体的优点是它们在人中的免疫原性低或无免疫原性。
[0139]
抗体或其片段也可以是嵌合的，例如小鼠-人抗体嵌合体。
[0140]
可选地，抗体或其片段衍生自非人物种，如小鼠。此类非人抗体能够经修饰以增加它们与人体内天然产生的抗体变体的相似性，因此抗体或其片段能够被部分或完全人源
化。因此，在一个实施方案中，抗体或其片段是人源化的。
[0141]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白是igg抗体。
[0142]
在一些实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白是igg抗体，其包含至少一个突变以降低fc介导的效应子功能，如降低的adcc。
[0143]
在一些实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白是igg抗体，其包含突变l235a和g237a(本文也称为“laga”突变)以降低fc介导的效应子功能，如降低的adcc。
[0144]
在一些实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白是全人单克隆抗体。在一些实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白是全人单克隆igg1抗体，其包含突变l235a和g237a以降低fc介导的效应子功能，如降低的adcc。
[0145]
抗原结合蛋白序列
[0146]
本发明的bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白(如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或片段)可以参照它们的cdr序列进行描述。
[0147]
根据本发明的第一方面，提供了包含以下的bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段：
[0148]
(a)(i)选自来自seq id no:7、22、40、54、67、82、96、110、124、138、152、166、180、194、207和222的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:8、21、39、53、68、81、95、109、123、137、151、165、179、193、208和221的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0149]
(b)包含与seq id no:7、22、40、54、67、82、96、110、124、138、152、166、180、194、207或222的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:8、21、39、53、68、81、95、109、123、137、151、165、179、193、208或221的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0150]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0151]
(a)(i)选自来自seq id no:7的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:8的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)
[0152]
(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0153]
(b)包含与seq id no:7的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:8的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0154]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0155]
(a)(i)选自来自seq id no:22的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:21的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0156]
(b)包含与seq id no:22的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:21的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0157]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0158]
(a)(i)选自来自seq id no:40的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:39的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3
个氨基酸修饰；或
[0159]
(b)包含与seq id no:40的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:39的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0160]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0161]
(a)(i)选自来自seq id no:54的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:53的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0162]
(b)包含与seq id no:54的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:53的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0163]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0164]
(a)(i)选自来自seq id no:67的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:68的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0165]
(b)包含与seq id no:67的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:68的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0166]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0167]
(a)(i)选自来自seq id no:82的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:81的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0168]
(b)包含与seq id no:82的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:81的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0169]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0170]
(a)(i)选自来自seq id no:96的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:95的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0171]
(b)包含与seq id no:96的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:95的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0172]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0173]
(a)(i)选自来自seq id no:110的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:109的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0174]
(b)包含与seq id no:110的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:109的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0175]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2
抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0176]
(a)(i)选自来自seq id no:124的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:123的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0177]
(b)包含与seq id no:124的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:123的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0178]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0179]
(a)(i)选自来自seq id no:138的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:137的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0180]
(b)包含与seq id no:138的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:137的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0181]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0182]
(a)(i)选自来自seq id no:152的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:151的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0183]
(b)包含与seq id no:152的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:151的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0184]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0185]
(a)(i)选自来自seq id no:166的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:165的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0186]
(b)包含与seq id no:166的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:165的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0187]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0188]
(a)(i)选自来自seq id no:180的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:179的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0189]
(b)包含与seq id no:180的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:179的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0190]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0191]
(a)(i)选自来自seq id no:194的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:193的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0192]
(b)包含与seq id no:194的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:193的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0193]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0194]
(a)(i)选自来自seq id no:207的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:208的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0195]
(b)包含与seq id no:207的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:208的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0196]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0197]
(a)(i)选自来自seq id no:222的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:221的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0198]
(b)包含与seq id no:222的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:221的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0199]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下的一种或多种：
[0200]
lcdr1，其包含与rasqsvssyla(seq id no:1)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0201]
lcdr2，其包含与dasnrat(seq id no:2)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0202]
lcdr3，其包含与qqsdswppt(seq id no:3)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0203]
hcdr1，其包含与gyyms(seq id no:4)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0204]
hcdr2，其包含与winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0205]
hcdr3，其包含与dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)具有至少80％序列同一性的序列。
[0206]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有cdr1的vh区，该cdr1包含与gyyms(seq id no:4)具有至少80％序列同一性的序列。
[0207]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有cdr2的vh区，该cdr2包含与winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)具有至少80％序列同一性的序列。
[0208]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有cdr3的vh区，该cdr3包含与dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)具有至少80％序列同一性的序列。
[0209]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有cdr1、cdr2和cdr3的vh区，该cdr1包含gyyms(seq id no:4)的序列，
该cdr2包含winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)的序列，该cdr3包含dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)的序列。
[0210]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有cdr1的vl区，该cdr1包含与rasqsvssyla(seq id no:1)具有至少80％序列同一性的序列。
[0211]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有cdr2的vl区，该cdr2包含与dasnrat(seq id no:2)具有至少80％序列同一性的序列。
[0212]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有cdr3的vl区，该cdr3包含与qqsdswppt(seq id no:3)具有至少80％序列同一性的序列。
[0213]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有cdr1、cdr2和cdr3的vl区，该cdr1包含rasqsvssyla (seq id no:1)的序列，该cdr2包含dasnrat(seq id no:2)的序列，该cdr3包含qqsdswppt(seq id no:3)的序列。
[0214]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含以下6个cdr：rasqsvssyla (seq id no:1)的lcdr1；dasnrat(seq id no:2)的lcdr2；qqsdswppt(seq id no:3)的lcdr3；gyyms(seq id no:4)的hcdr1；winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)的hcdr2；和dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)的hcdr3。
[0215]
根据本发明另一方面，提供了bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段，其包含含有如本文所定义的cdr1、cdr2和cdr3序列的vh区和含有如本文所定义的cdr1、cdr2和cdr3序列的vl区。
[0216]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含vl区和vh区，该vl区包含rasqsvssyla (seq id no:1)的lcdr1；dasnrat的lcdr2(seq id no:2)；和qqsdswppt(seq id no:3)的lcdr3；该vh区包含gyyms(seq id no:4)的hcdr1；winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)的hcdr2；和dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)的hcdr3。
[0217]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有与seq id no:7具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的vh区。
[0218]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有与seq id no:8具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的vl区。
[0219]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有与seq id no:7具有100％序列同一性的氨基酸序列的vh区。
[0220]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有与seq id no:8具有100％序列同一性的氨基酸序列的vl区。
[0221]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有seq id no:7的氨基酸序列的vh区和含有seq id no:8的氨基酸序列的vl区。
[0222]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2
抗体或其片段包含含有与seq id no:9具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
[0223]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有与seq id no:10具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的重链。
[0224]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有与seq id no:9具有100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
[0225]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有与seq id no:10具有100％序列同一性的氨基酸序列的重链。
[0226]
在一个实施方案中，bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白如抗bmp1、tll1和/或tll2抗体或其片段包含含有seq id no:9的氨基酸序列的轻链和含有seq id no:10的氨基酸序列的重链。
[0227]
在本发明的一个方面，bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白是结合bmp-1、tll1和/或tll2的全人fc-失能的单克隆抗体，其选自以下项并且根据cdr、vh/vl和/或hc/lc序列定义：
[0228]
13y039-4b06-4334，如seq id no:1至10所示；
[0229]
13y039-3e07-2944，如seq id no:15-24所示；
[0230]
13y039-8f02-2949，如seq id no:33-42所示；
[0231]
13y039-4b06-4376，如seq id no:47-56所示；
[0232]
13y039-4b06-4373，如seq id no:61-70所示；
[0233]
13y039-4b06-4364，如seq id no:75-84所示；
[0234]
13y039-4b06-4351，如seq id no:89-98所示；
[0235]
13y039-4b06-4348，如seq id no:103-112所示；
[0236]
13y039-4b06-4328，如seq id no:117-126所示；
[0237]
13y039-4b06-4327，如seq id no:131-140所示；
[0238]
13y039-4b06-4325，如seq id no:145-154所示；
[0239]
13y039-4b06-4324，如seq id no:159-168所示；
[0240]
13y039-127g03-2890，如seq id no:173-182所示；
[0241]
13y039-152b02-2948，如seq id no:187-196所示；
[0242]
13y039-152b02-2940，如seq id no:201-210所示；和
[0243]
13y039-152b02-2935，如seq id no:215-224。
[0244]
在进一步的实施方案中，抗bmp-1、tll1和/或tll2抗体选自以下项并且根据cdr、vh/vl和/或hc/lc序列定义：
[0245]
13y039-4b06-4334，如seq id no:1至10所示；
[0246]
13y039-3e07-2944，如seq id no:15-24所示；和
[0247]
13y039-8f02-2949，如seq id no:33-42所示。
[0248]
在进一步的实施方案中，抗bmp-1、tll1和/或tll2抗体选自以下项并且根据cdr、vh/vl和/或hc/lc序列定义：
[0249]
13y039-4b06-4334，如seq id no:1至10所示；和
[0250]
13y039-3e07-2944，如seq id no:15-24所示。
[0251]
在又一进一步的实施方案中，抗bmp-1、tll1和/或tll2抗体：
[0252]
13y039-4b06-4334，如seq id no:1至10所示。
[0253]
本文提及“至少80％”或“80％或更大”的实施方案将被理解为包括等于或大于80％如85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的所有值。在一个实施方案中，抗原结合蛋白如本发明的抗体或片段包含与指定序列至少85％，如至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
[0254]
与靶抗原结合
[0255]
本发明的抗原结合蛋白可以以通过spr测量的小于100nm的结合亲和力(kd)与人bmp1的催化结构域结合。在进一步的实施方案中，kd为50nm或更小，如10nm或更小。在又一进一步的实施方案中，kd小于5nm，如小于2nm。例如，根据一个方面，提供了以通过spr测量的小于2nm的结合亲和力(kd)与bmp1的催化结构域结合的人抗-bmp1抗体。
[0256]
本发明的抗原结合蛋白可以以通过spr测量的小于100nm的结合亲和力(kd)与人tll1的催化结构域结合。在进一步的实施方案中，kd为50nm或更小，如10nm或更小。在又一进一步的实施方案中，kd小于5nm，如小于2nm。例如，根据一个方面，提供了以通过spr测量的小于2nm的结合亲和力(kd)与tll1的催化结构域结合的人抗-tll1抗体。
[0257]
本发明的抗原结合蛋白可以以通过spr测量的小于100nm的结合亲和力(kd)与人tll2的催化结构域结合。在进一步的实施方案中，kd为50nm或更小，如10nm或更小。在又一进一步的实施方案中，kd小于5nm，如小于4nm。例如，根据一个方面，提供了以通过spr测量的小于4nm的结合亲和力(kd)与tll2的催化结构域结合的人抗-tll2抗体。
[0258]
例如，根据一个方面，提供了人抗bmp1、抗tll1和抗tll2抗体，其以通过spr测量的小于2nm的结合亲和力(kd)与bmp1的催化结构域结合，其以通过spr测量的小于2nm的结合亲和力(kd)与tll2的催化结构域结合，并且其以通过spr测量的小于4nm的结合亲和力(kd)与tll2的催化结构域结合。
[0259]
本文描述的是可以用于定义抗原结合蛋白功能的其他测定。
[0260]
多核苷酸和表达载体
[0261]
在本发明的一个方面，提供了编码本文所描述的bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白的多核苷酸。
[0262]
在一个实施方案中，编码bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白的多核苷酸序列包含含有与seq id no:11具有至少70％序列同一性的多核苷酸序列的vl。
[0263]
在一个实施方案中，编码bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白的多核苷酸序列包含含有与seq id no:12具有至少70％序列同一性的多核苷酸序列的vh链。
[0264]
在一个实施方案中，编码bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白的多核苷酸序列包含含有与seq id no:13具有至少70％序列同一性的多核苷酸序列的重链。
[0265]
在一个实施方案中，编码bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白的多核苷酸序列包含含有与seq id no:14具有至少70％序列同一性的多核苷酸序列的轻链。
[0266]
在一个实施方案中，编码bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白的多核苷酸序列由seq id no:13和/或14的序列组成。
[0267]
为了表达抗原结合蛋白(如抗体或其片段)，将编码如本文所描述的部分或全长轻链和重链的多核苷酸插入表达载体中，使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。因此，在本发明的一个方面，提供了包含如本文所定义的多核苷酸序列的表达载体。
[0268]
在一个实施方案中，表达载体包含seq id no:13的重链。
[0269]
在一个实施方案中，表达载体包含seq id no:14的轻链。
[0270]
在一个实施方案中，表达载体包含seq id no:13的重链和seq id no:14的轻链。
[0271]
应当理解，本文所描述的核苷酸序列包含额外的编码氨基酸残基的序列以帮助翻译、纯化和检测，但是可以根据所使用的表达系统使用替代序列。如果采用替代的设计、翻译、纯化或检测策略，则能够去除、修饰或取代这些可选的序列。
[0272]
能够对编码多肽的dna或cdna进行突变，这些突变对于多肽的氨基酸序列是沉默的，但是其提供了在特定宿主中用于翻译的优选密码子。在例如大肠杆菌和酿酒酵母以及哺乳动物中，特别是人中，用于核酸的翻译的优选密码子是已知的。
[0273]
多肽的突变能够例如通过对编码多肽的核酸进行取代、添加或缺失来实现。可以通过许多方法向编码多肽的核酸引入取代、添加或缺失，这些方法包括例如易错pcr、改组、寡核苷酸定向诱变、组装pcr、pcr诱变、体内诱变、盒式诱变、递归集成诱变(recursive ensemble mutagenesis)、指数集成诱变(exponential ensemble mutagenesis)、定点诱变、基因重组装、人工基因合成、基因位点饱和诱变(gssm)、合成连接重组装(slr)或这些方法的组合。还可以通过包括以下项的方法向核酸引入修饰、添加或缺失：重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的dna诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口双链诱变、点错配修复诱变、修复缺陷宿主菌株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、集成诱变、嵌合核酸多聚体产生或它们的组合。
[0274]
特别地，可以使用人工基因合成。能够通过例如固相dna合成法合成产生编码本发明的多肽的基因。整个基因可以从头合成，而不需要前体模板dna。为了获得期望的寡核苷酸，构建块按产物序列所需的顺序依次偶联到生长的寡核苷酸链上。链组装完成后，产物从固相释放到溶液中，去保护并收集。能够通过高效液相色谱(hplc)分离产物以获得高纯度的期望的寡核苷酸。
[0275]
表达载体包括例如质粒、逆转录病毒、粘粒、酵母人工染色体(yac)和epstein-barr病毒(ebv)衍生的附加体。将多核苷酸连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节多核苷酸的转录和翻译的预期功能。表达和/或控制序列可以包括启动子、增强子、转录终止子、编码序列5
′
的起始密码子(即atg)、内含子的剪接信号和终止密码子。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。seq id no:11-12包含编码本发明的单链可变片段的核苷酸序列，其包含vh区和vl区。应当理解，本发明的多核苷酸或表达载体可以编码vh区、vl区或两者；或编码重链、轻链或两者。因此，能够将编码vh和vl区(或重链和轻链)的多核苷酸插入到不同的载体中，替代性地，将编码两个区或链的序列插入到相同的表达载体中。通过标准方法将一种或多种多核苷酸插入表达载体中(例如，多核苷酸和载体上的互补限制性位点的连接，或者如果不存在限制性位点则平端连接)。
[0276]
方便的载体是编码功能上完整的人ch或cl免疫球蛋白序列的载体，其具有工程化的适当的限制性位点，使得能够将如本文所描述的任何vh或vl序列容易地插入和表达。表达载体还可以编码促进抗原结合蛋白如抗体(或其片段)从宿主细胞分泌的信号肽。可以将多核苷酸克隆到载体中，使得信号肽框内连接到抗原结合蛋白的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
[0277]
在本发明的一个方面，提供了包含如本文所定义的多核苷酸或表达载体的细胞
(例如宿主细胞或重组宿主细胞)。应当理解，细胞可以包含编码抗体轻链或其片段的第一载体，以及编码抗体重链或其片段的第二载体。替代性地，可以将在同一表达载体上编码的重链和轻链引入细胞中。
[0278]
在一个实施方案中，多核苷酸或表达载体编码与抗体或其片段融合的膜锚或跨膜结构域，其中抗体或其片段呈现在细胞的细胞外表面上。
[0279]
转化可以通过任何已知的将多核苷酸引入宿主细胞中的方法进行。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法是本领域众所周知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸封装在脂质体中、基因枪注射和直接将dna显微注射到细胞核中。此外，可以通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞中。
[0280]
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的并且包括可以从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得的许多永生化细胞系。这些包括，特别是，中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)细胞、nso、sp2细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞(例如，hep g2)、a549细胞、3t3细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，如sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。可以使用本领域已知的方法在大肠杆菌中分离和表达抗体的抗原结合片段如scfv和fv片段。
[0281]
通过将宿主细胞培养足以容许抗原结合蛋白在宿主细胞中表达或更优选地抗原结合蛋白分泌到宿主细胞所生长的培养基中的时间段，而产生抗原结合蛋白。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗原结合蛋白。
[0282]
可以使用例如green and sambrook,molecular cloning:a laboratory manual(2012)4th edition cold spring harbour laboratory press中公开的技术获得和操作本发明的抗体(或片段)。
[0283]
特别地，可以使用杂交瘤技术，通过将产生特定抗体的b细胞与骨髓瘤(b细胞癌)细胞融合来产生单克隆抗体，其中该骨髓瘤细胞因其在组织培养物中的生长能力和不存在抗体链合成而被选择。
[0284]
针对确定的抗原的单克隆抗体可以例如通过以下方式获得：
[0285]
a)用永生化细胞并且优选用骨髓瘤细胞，使获得自先前用确定的抗原免疫的动物的外周血的淋巴细胞永生化，以形成杂交瘤，
[0286]
b)培养形成的永生化细胞(杂交瘤)并回收产生具有期望的特异性的抗体的细胞。
[0287]
替代性地，不需要使用杂交瘤细胞。可以经由常规实践，例如使用本领域已知的噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或哺乳动物展示技术，从合适的抗体文库中分离能够结合如本文所描述的靶抗原的抗原结合蛋白。相应地，特别地，单克隆抗体能够通过例如包括以下步骤的过程获得：
[0288]
a)将获得自淋巴细胞特别是动物(合适地，先前用确定的抗原免疫)的外周血淋巴细胞的dna或cdna序列克隆到载体中，特别是噬菌体中，更具体地是丝状噬菌体中，
[0289]
b)在容许抗体产生的条件下用上述载体转化原核细胞，
[0290]
c)通过对抗体进行抗原亲和性选择来选择抗体，以及
[0291]
d)回收具有期望的特异性的抗体。
[0292]
药物组合物
[0293]
根据另一方面，提供了包含如本文所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白的组合物。在此类实施方案中，组合物可以包含抗原结合蛋白，任选地与其他赋形剂组合。还包括包含一种或多种额外的活性剂(例如适用于治疗本文提及的疾病的活性剂)的组合物。
[0294]
根据另一方面，提供了药物组合物，其包含如本文所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，连同药学上可接受的稀释剂或载剂。能够将本文所描述的抗原结合蛋白掺入适合向受试者施用的药物组合物中。通常，药物组合物包含如本文所描述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载剂的示例包括水、盐水、盐、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。药物组合物中也包括提高抗体或其片段的保存期限或有效性的药学上可接受的物质，如湿润或少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
[0295]
本文所描述的组合物可以是多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选的形式取决于施用和治疗应用的预期方式。典型的优选组合物是通过注射或连续输注(示例包括但不限于静脉内、腹膜内、真皮内、皮下、肌肉内、眼内和门静脉内)施用的可注射或可输注溶液的形式。
[0296]
优选的施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在优选的实施方案中，抗原结合蛋白通过静脉内输注或注射施用。在另一个优选的实施方案中，抗原结合蛋白通过肌肉内或皮下注射施用。在另一个优选的实施方案中，抗原结合蛋白通过皮下注射施用，通常每月一次。
[0297]
治疗组合物通常必须在制备和储存条件下是无菌的并且稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。
[0298]
将本发明的药物组合物用于治疗如本文所描述的疾病的治疗方法作为通常用于治疗此类疾病的其他既定疗法的辅助或结合在本发明的范围内。
[0299]
在本发明的另一方面，抗原结合蛋白、组合物或药物组合物与至少一种活性剂顺次、同时或分开施用。
[0300]
药物组合物可以包含在试剂盒中，该试剂盒含有抗原结合蛋白连同其他药物和/或使用说明。为方便起见，试剂盒可以包含预定量的试剂和使用说明。试剂盒还可以包括用于施用药物组合物的装置。
[0301]
本文所描述的抗原结合蛋白也可以用于治疗方法。本领域技术人员应当理解，本文中提及的治疗指的是已确定病况的治疗。然而，根据病况，本发明的化合物在某些疾病的预防方面也可以是有用的。本文所描述的抗原结合蛋白以有效量用于治疗性、预防性或防止性治疗。本文所描述的抗原结合蛋白的治疗有效量是有效改善或减轻疾病的一种或多种症状或者预防或治愈疾病的量。
[0302]
治疗方法
[0303]
根据本发明另一方面，提供了作为药物使用的或在治疗中使用的如本文所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所定义的药物组合物。
[0304]
本发明的抗原结合蛋白中和bmp1、tll1和/或tll2的活性，并且可以特别地用于治疗与bmp1、tll1和/或tll2活性相关联的疾病，包括例如治疗抑制bmp1、tll1和/或tll2具有治疗益处的疾病。例如，本发明的抗原结合蛋白可以特别地用于治疗抑制组织ecm(细胞外基质)产生和/或成熟将是有益的，或抑制肌肉生长抑制素活性将是有益的，或抑制纤维化将是有益的的疾病。
[0305]
在一些实施方案中，与bmp1、tll1和/或tll2活性相关联的疾病选自纤维化相关疾病或病症，例如与身体器官或组织中的病理性纤维化病症或疾病(例如纤维化的预防和消退)相关联的疾病，例如，以下的此类病况：
[0306]
心脏(例如，心肌梗塞(“mi”)、mi后心力衰竭的预防、心力衰竭(例如，射血分数降低的心力衰竭(hfref)、射血分数保留的心力衰竭)、心律失常(例如，心房颤动)、心脏纤维化(例如，肥厚型心肌病)、急性失代偿性心力衰竭、心房颤动)；
[0307]
肺(例如慢性阻塞性肺病(“copd”)、肺部/肺纤维化(例如，特发性肺纤维化(“ipf”)、肺动脉高压(pah))；
[0308]
肾(例如糖尿病肾病、肾后性急性肾损伤、慢性肾病(“ckd”)、移植后移植物功能延迟、肾纤维化、腹膜纤维化和腹膜透析患者腹膜纤维化的预防(例如，在终末期肾病患者中延迟过渡到血液透析的时间)，局灶性节段性肾小球硬化(fsgs))；
[0309]
肝(例如肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎(“nash”)、肝纤维化(例如，hcv后肝纤维化)
[0310]
眼睛(例如青光眼、角膜疤痕)；
[0311]
骨骼肌(例如肌营养不良(包括duchenne、becker、肢带型、先天性、面肩肱型、肌强直性、眼咽、远端型和emery-dreifuss、重复性肌肉损伤)；
[0312]
皮肤(例如瘢痕疙瘩、伤口愈合、粘连、增生性瘢痕和其他例如与烧伤、手术或其他创伤相关联的疤痕、dupuytren挛缩、淋巴性水肿、硬皮病)；
[0313]
脉管系统(例如中风和胶原血管病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和硬皮病)；和
[0314]
神经系统(例如脊髓损伤、多发性硬化症)。
[0315]
在一些实施方案中，与bmp1、tll1和/或tll2活性相关联的疾病选自癌症和癌细胞转移。
[0316]
在一些实施方案中，与bmp1、tll1和/或tll2活性相关联的疾病选自：
[0317]
特发性肺纤维化；
[0318]
肥厚型心肌病；和
[0319]
预防腹膜透析患者的腹膜纤维化。
[0320]
在一个特定的实施方案中，与bmp1、tll1和/或tll2活性相关联的疾病是nash(非酒精性脂肪性肝炎)。nash是非酒精性脂肪性肝病的亚型，其特征在于肝脏炎症和进展为肝硬化的巨大风险，该疾病的更晚期阶段的特征在于炎症。
[0321]
在一些实施方案中，与bmp1、tll1和/或tll2活性相关联的疾病选自特征在于肌肉功能和/或质量降低的肌肉疾病，例如肌营养不良症(例如，duchenne、becker、肢带型、先天性、面肩肱型、肌强直性、眼咽、远端型和emery-dreifuss)、肌肉减少症和与例如心力衰竭、ckd、copd、癌症或老年相关联的恶病质。
[0322]
相应地，提供了在治疗如本文所定义的纤维化相关疾病或病症中使用的如本文所
定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所定义的药物组合物。
[0323]
根据另一方面，提供了用于治疗有此需要的受试者的如本文所定义的纤维化相关疾病或病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文所定义的bmp1、tll1和/或tll2抗原结合蛋白或如本文所定义的药物组合物。
[0324]
根据另一方面，提供了如本文所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所定义的药物组合物在制备用于治疗如本文所定义的纤维化相关疾病或病症的药物中的用途。
[0325]
如本文所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白也可以用于促进肌肉生长和/或改善肌肉功能，例如在恶病质患者群体中以减少虚弱(例如，对于肌肉萎缩)。
[0326]
因此，根据另一方面，提供了用于在有此需要的受试者中促进肌肉生长和/或改善肌肉功能的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所定义的药物组合物。
[0327]
根据另一方面，提供了在促进肌肉生长和/或改善肌肉功能中使用的如本文所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所定义的药物组合物。
[0328]
根据另一方面，提供了如本文所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如本文所定义的药物组合物在制备用于促进肌肉生长和/或改善肌肉功能的药物中的用途。
[0329]
根据本文所提供的描述，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。然而，应当理解，指示本发明的优选实施方案的描述和具体示例仅以说明的方式给出，因为各种变化和修饰对于本领域技术人员将成为显而易见的。现在将使用以下非限制性实施例来描述本发明：
实施例
[0330]
抗体生成和表征
[0331]
使用体外抗体发现平台对人针对bmp1/tll特异性的全人抗体进行鉴定和亲和力成熟。
[0332]
对来自选择输出的克隆在一系列实验中进行筛选，以了解结合动力学、效力和生物物理特性，随后选择了具有期望的功能特性的16种单克隆抗体的先导组。从hek293-6e细胞表达和纯化16种抗体的先导组，用于进一步的功能化和表征研究。针对重组人和直系同源物种以及人血清和大鼠血浆(内源性表达)进行了功能表征。
[0333]
因为期望的作用机制不需要效应子功能，将重链恒定区的ch2结构域内的残基l235和g237突变为丙氨酸残基(laga突变)。这些突变先前已被证明可以去除igg1抗体经由adcc或cdc裂解靶细胞的能力[bartholomew et al.(1995).immunology 85,41-48；bret et al.(1997)immunology 91,346-353]。
[0334]
选择13y039-4b06-4334和13y039-3e07-2944进行体内表征。将这些抗体克隆为反向嵌合mab，其具有在小鼠igg2a laga fc和小鼠κ上的人可变区(本文将4b06-4334称为化合物a并将3e07-2944称为化合物b)以及具有在大鼠igg2b laga fc和大鼠κ上的人可变区(本文将4b06-4334称为化合物c并将3e07-2944称为化合物d)。在下文所描述的angii/pe功效研究中对这些反向嵌合体进行了测试。
[0335]
哺乳动物表达的抗-bmp1/tll抗体的结合表征
[0336]
通过表面等离子共振(spr)对哺乳动物表达的抗bmp1/tll抗体进行结合表征。
[0337]
通过表面等离子共振(spr)检测的hek表达的全先导组与人bmp1cd+cub1的结合
[0338]
使用biacore t200通过spr评估了hek细胞中表达的16种先导组抗体与含有催化结构域和截短结构域的人bmp的截短型式(人bmp1cd+cub1截短抗原)的结合。使用hbs-ep+缓冲液并且实验在25℃下运行。经由胺偶联将蛋白a固定到cm5传感器芯片上。先导组抗体被捕获到蛋白a表面上。然后使人bmp1 cd+cub1以不同的浓度经过被捕获的抗体。结果如下表1中所示。
[0339]
表1：与人bmp1 cd+cub1截短抗原结合的人抗体。经由spr确定的kd值。
[0340]
[0341][0342]1酶稀释缓冲液＝hepes(25mm)、cacl2(5mm)、zncl2溶液(1μm)和brij35(0.01％)；hbs-ep缓冲液＝hepes(0.2m)、nacl(3m)、edta(60mm)、聚山梨醇酯20(1.0％)，ph 7.6，以20x提供(teknova)；hbs-n缓冲液＝hepes(0.1m)、nacl(1.5m)，以10x提供(cytiva life sciences)
[0343]
表1中的结果表明，所有16种抗体都显示出与人bmp1 cd+cub1的结合，并且证明了在0.3-4.3nm的个位数nm范围内的亲和力。进一步评估了13y039-4b06-4334和13y039-3e07-2944。
[0344]
通过spr测定的hek表达的抗体13y039-4b06-4334和13y039-3e07-2944以及反向嵌合体与人tll2 cd+cub1和小鼠bmp1 cd+cub1的结合
[0345]
在biacore t200上通过spr评估了抗体13y039-4b06-4334和13y039-3e07-2944以及反向嵌合抗体与人tll2 cd+cub1和小鼠bmp1cd+cub1截短抗原的结合。经由胺偶联将蛋白a/g固定到cm5传感器芯片上，抗体被捕获到蛋白a/g表面。使抗原以不同的浓度经过被捕获的抗体。测量的对人tll2 cd+cub1的亲和力如表2所示，测量的对小鼠bmp1cd+cub1的亲和力如表3所示。
[0346]
表2：与人tll2 cd+cub1截短抗原结合的抗体。经由spr确定的kd值。
[0347][0348]
表2中的结果证明，hbs-ep+缓冲液中的13y039-4b06-4334对人tll2cd+cub1的亲和力为3.08nm，而13y039-3e07-2944是人tll2 cd+cub1的非结合物。
[0349]
表3：与小鼠bmp1 cd+cub1截短抗原结合的抗体。经由spr确定的kd值。
[0350][0351]
表3中的结果表明，两种抗体对小鼠bmp1 cd+cub1的亲和力都在个位数nm范围内(1.7
–
6.1nm)。
[0352]
还评估了具有在小鼠igg2a laga fc和小鼠恒定κ区上的人可变区的反向嵌合抗体与所有cd+cub1截短物的结合。这些实验包括具有人可变区和小鼠恒定κ区的抗rsv小鼠igg2a laga fc以及抗mopc21小鼠igg2a的阴性抗体对照。两个阴性对照均是所有抗原的非结合物(参见表4、5和6)。
[0353]
反向嵌合体对人bmp1 cd+cub1的亲和力如表4所示。当在hbs-ep+中运行时，两种抗体的亲和力均为个位数nm(2.33
–
5.31nm)。当在酶稀释缓冲液中运行时亲和力更强，处于两位数pm(40
–
70pm)。这些结果与表1中报告的人抗体亲和力是相当的。
[0354]
反向嵌合体对人tll2 cd+cub1的亲和力如表5所示。测量的13y039-4b06-4334的亲和力为3.54nm。13y039-3e07-2944不与人tll2 cd+cub1结合。这些结果与表2中报告的人抗体的亲和力是相当的。
[0355]
反向嵌合体对小鼠bmp1 cd+cub1的亲和力如表6所示。亲和力在个位数nm范围内(0.82
–
6.2nm)。这些结果与表3中报告的人抗体的亲和力是相当的。
[0356]
抗体13y039-4b06-4334及其反向嵌合体对人bmp1 cd-cub1、小鼠bmp1 cd-cub1和人tll2 cd-cub1具有相似的亲和力，进一步支持了在鼠临床前功效研究中使用反向嵌合体作为13y039-4b06-4334的替代物。
[0357]
表4：与人bmp1 cd+cub1截短抗原结合的具有在小鼠igg2a laga fc和小鼠恒定κ区上的人可变区的反向嵌合抗体。经由spr确定的kd值。
[0358][0359]
表5：与人tll2 cd+cub1截短抗原结合的具有在小鼠igg2a laga fc和小鼠恒定κ区上的人可变区的反向嵌合抗体。经由spr确定的kd值。
[0360][0361][0362]
表6：与小鼠bmp1 cd+cub1截短抗原结合的具有在小鼠igg2a laga fc和小鼠恒定κ区上的人可变区的反向嵌合抗体。经由spr确定的kd值。
[0363][0364]
表7是在hek细胞中表达的抗体13y039-4b06-4334与所有cd+cub1抗原结合的所有动力学和亲和力数据的总结。这表明当在hbs-ep+中运行时该抗体对所有截短的cd+cub1靶标都具有个位数nm亲和力，并且当在酶稀释缓冲液中时对人bmp1 cd+cub1的亲和力更强(40pm)。
[0365]
表7：与人bmp1 cd+cub1、人tll2 cd+cub1和小鼠bmp1 cd+cub1结合的人抗体13y039-4b06-4334的亲和力和动力学。
[0366][0367]
通过表面等离子共振(spr)测定的抗bmp1/tll抗体13y039-4b06-4334与全长人和直系同源物种的bmp1/tll抗原的结合
[0368]
在cho细胞中表达13y039-4b06-4334并测试了其与人和所有直系同源物种(食蟹猴、大鼠和小鼠)间的所有全长bmp1和tll抗原的结合。与上文所描述的选择测定中使用的截短抗原相比，本测定中使用的蛋白质是天然存在的蛋白质的重组型式。结果在两种缓冲液中生成：hbs-ep+和hbs-n+5mm cacl2和1μm zncl2。经由胺偶联将蛋白a固定到cm5传感器芯片上，抗体被捕获到蛋白a表面。将抗原稀释在两种缓冲液中，并使抗原以不同的浓度经过被捕获的抗体。
[0369]
13y039-4b06-4334以23.6pm的亲和力结合重组人bmp1、以880pm的亲和力结合tll1、并且以4270pm的亲和力结合tll2。高亲和力结合取决于zn
2+
和ca
2+
的添加，这与这些阳离子在酶结构和功能中的重要性一致。
[0370]
结果如表8中所示。
[0371]
表8：抗bmp1/tll抗体13y039-4b06-4334与全长人和直系同源物种的bmp1/tll抗原的结合。
[0372][0373][0374]1na＝该酶未生成结合数据
[0375]
体外靶标结合效力
[0376]
使用基于fret的测定，对于针对重组人bmp-1-1、人tll-1、小鼠bmp-1-3(707截短)、小鼠tll-1、大鼠tll-1、大鼠tll-2和食蟹猴tll-1酶的活性，对哺乳动物表达的16种抗
4334。对它们进行测试以研究对hubmp-1、mbmp-1、hutll-1、hutll-2、mtll-1、rattll-1、rattll-2、cynotll-1和cynotll-2活性的抑制。对每种酶绘制了全剂量反应曲线，每种酶的代表性图表如图1-9所示(图1，hubmp-1；图2，mbmp-1；图3，hutll-1；图4，hutll-2；图5，mtll-1；图6，大鼠tll-1；图7，大鼠tll-2；图8，cynotll-1；图9，cynotll-2)。
[0384]
抗体13y039-4b06-4334抑制所有测试酶。所有实验的ic
50
值如表10所示，计算了平均值和标准偏差。每种酶的平均ic
50
值为：hubmp-1，0.04nm；hutll-1，0.05nm；hutll-2，0.05nm；mbmp-1,0.02nm；mtll-1，0.23nm；大鼠tll-1，0.50nm；大鼠tll-2，0.67nm；cynotll-1，0.10nm；cynotll-2，0.31nm。
[0385]
表10：所有实验中抗体13y039-4b06-4334 ic50值的总结数据表
[0386][0387]
在hek和cho细胞中表达13y039-4b06-4334，通过fret通常如上文所述测量了hek和cho表达的蛋白质批次对重组人bmp1、人tll1和人tll2活性的抑制。当针对重组人bmp1、人tll1、人tll2和人血清进行分析时，hek293表达的和多克隆cho表达的蛋白质批次(表11)之间的效力是相当的。
[0388]
表11：13y039-4b06-4334对重组人bmp1、tll1和tll2的抑制和对人血清bmp1/tll活性的抑制
[0389][0390]
为了测试13y039-4b06-4334在临床前啮齿动物物种中的生物学功效，生成了由融合到小鼠或大鼠的fc失能的igg2a的13y039-4b06-4334可变结构域组成的反向嵌合体。如
3e07-2944，migg2alaga)、抗rsv小鼠igg2a laga、抗rsv大鼠igg2b laga、化合物c(13y039-4b06-4334大鼠igg2b laga)和化合物d(13y039-3e07-2944大鼠igg2b)与重组可溶性小鼠fcrn的结合。fix fc+、大鼠igg2b野生型对照和小鼠igg2a对照(抗mopc)包括在内。用higg1测试了人和食蟹猴fcrn，用大鼠igg2b和migg2a测试了小鼠fcrn。
[0400]
13y039-4b06-4334和13y039-3e07-2944显示在ph 6下与人和食蟹猴fcrn结合，但在ph 7.4下不结合，表明laga突变未影响与人或食蟹猴fcrn的结合。cho表达的13y039-4b06-4334对人fcrn的相对结合亲和力与igg1(fix fc+)对照抗体的结合亲和力是相当的。化合物a、化合物b和化合物d显示在ph 6下与小鼠fcrn结合，但在ph 7.4下不结合。化合物c在蛋白a表面上的捕获非常不稳定，因此表面上没有足够的抗体以评估与小鼠fcrn的结合。
[0401]
通过spr将fix fc+和fix fc-用作对照评估了13y039-4b06-4334与人c1q的结合。将抗体稀释并经由胺偶联固定到传感器芯片上。将人c1q稀释在hbs-n+10mm cacl2中并注射到固定化构建体上。fix fc+显示出与c1q如预期结合(kd＝36.3nm)，而fix fc-显示出与c1q不结合，正如对fc失能抗体所预期的那样。13y039-4b06-4334显示出与fix fc+对照抗体相当的结合(kd＝36.3nm)。
[0402]
还在elisa中评估了13y039-4b06-4334与人c1q的结合。将人c1q蛋白添加至抗体，使用抗c1q生物素检测试剂和链霉亲和素-hrp检测结合。使用sureblue tmb检测比色信号并且容许比色反应发生，然后在450nm处测量。阳性对照测试mab(抗rsv igg1)显示出如预期的剂量反应效应，而阴性对照测试mab(抗rsv laga)显示出与clq的最小的，这与预期一致。elisa证实了cho表达的13y039-4b06-4334以与higg1 wt对照相似的亲和力结合c1q。
[0403]
hek和cho细胞中表达的13y039-4b06-4334均以比阳性结合对照抗体(具有野生型fc的抗rsv igg1)更高的水平结合人c1q。图10中的每个数据点代表n＝3个实验，除了在cho细胞中表达的13y039-4b06-4334仅重复了一次，但数据显示该分子的表现与其他cho材料相当，并且抗rsv wt代表了n＝2，因为其已知的结合活性。
[0404]
综上所述，这些结果证明13y039-4b06-4334在与人和食蟹猴fcγ受体的结合方面是fc失能的，尽管其与人c1q的结合仍然可见。fc失能突变不影响与人fcrn的结合。
[0405]
体外细胞活性
[0406]
在基于成纤维细胞的胶原蛋白形成测定(“scar-in-a-jar”，sij)中13y039-4b06-4334还抑制bmp1催化的其天然底物前胶原蛋白i的切割。在此测定中，用ficoll刺激人原代心脏成纤维细胞会诱导前胶原蛋白形成和内源性bmp1的切割，如通过i型前胶原蛋白c末端肽(picp)的释放所测量的。13y039-4b06-4334以剂量依赖方式抑制picp形成，证明了该抗体阻断这种内源性蛋白质底物的切割并减弱疾病相关细胞类型中纤维化机制的关键要素。在多项研究中，13y039-4b06-4334在正常人心脏成纤维细胞(nhcf)中的平均pic50值为9.6(
±
0.2，n＝3)。
[0407]
13y039-4b06-4334(化合物a)的小鼠反向嵌合体在sij测定中显示出活性，pic50为9.8(
±
0.6，n＝2)，这与对13y039-4b06-4334观察到的是相当的。
[0408]
肌肉生长抑制素潜在复合物切割测定
[0409]
分析了抗bmp1/tll抗体对人bmp-1切割肌肉生长抑制素潜在复合物的抑制。在添加到重组人肌肉生长抑制素潜在复合物之前，用一定浓度范围的抗bmp1/tll抗体预先处理重组人bmp-1。单独的bmp-1切割肌肉生长抑制素潜在复合物，释放活性肌肉生长抑制素，测
量该活性肌肉生长抑制素以指示bmp-1的活性。当将bmp-1与抗bmp1/tll抗体预先孵育时，总体来说其体酶活性随着抗体浓度的增加而降低。在中尺度发现(meso scale discovery，msd)测定中测量从复合物释放的肌肉生长抑制素的水平，该测定使用抗肌肉生长抑制素抗体来捕获和检测肌肉生长抑制素同型二聚体。肌肉生长抑制素水平的msd测量值用于计算抗bmp1/tll抗体的抑制百分比。
[0410]
图11中的数据显示抗bmp1/tll抗体13y039-4b06-4334以剂量响应方式抑制bmp1切割肌肉生长抑制素潜在复合物。这些结果证实了13y039-4b06-4334抑制bmp1酶活性，因为bmp-1被阻止切割肌肉生长抑制素潜在复合物以释放肌肉生长抑制素。
[0411]
体内靶标结合、药效学标志物、抗纤维化和合成代谢活性
[0412]
在小鼠angii/pe模型中的药效动力学标志物
[0413]
通过皮下渗透泵施用血管紧张素-ii(angii)和去氧肾上腺素(pe)的小鼠在两周的处理期间发展心脏纤维化(以下称为angii/pe模型)。该angii/pe模型用于评估化合物a(将13y039-4b06-4334的可变区与鼠igg2a laga fc结构域组合的反向嵌合构建体)对bmp1抑制和心脏纤维化的药效动力学标志物的影响。从植入渗透泵时开始，对小鼠每周给药一次，持续两周。抗rsv(小鼠igg2a laga/小鼠ck)和mopc-21(小鼠可变区和恒定区小鼠igg2a/小鼠ck)抗体用作对照。13y039-152b02-1(“b02”)是小鼠反向嵌合体(在小鼠igg2a/小鼠ck上的人可变区)工具抗bmp1/tll mab，而化合物b是另一种抗体13y039-3e07-2944的小鼠反向嵌合体(小鼠igg2a laga/小鼠ck)。在本研究中，化合物a/b02和化合物b均以剂量依赖方式抑制来自收获的血浆的离体bmp1活性(图12)。
[0414]
使用蛋白质印迹测定，还检测到用5mg/kg化合物a处理的angii/pe小鼠中循环i型前胶原蛋白c末端肽(picp)水平的显著降低(图13)。
[0415]
化合物a在小鼠angii/pe模型中的额外作用是在高水平的bmp1抑制下的骨骼肌质量显著增加。angii/pe输注导致左侧腓肠肌重量显著降低，归一化为总体重(6.24
±
0.10mg/g相对于5.89
±
0.08mg/g，p《0.01，通过未配对t检验)。用0.5mg/kg和5mg/kg的化合物a处理导致肌肉质量恢复到高于盐水渗透泵对照的水平(图14)。伴随这一观察结果的是这些动物的血浆中总肌肉生长抑制素的积累，如使用检测总(即游离的和结合的)肌肉生长抑制素种类的商业化elisa测定所确定的(图15)。
[0416]
已经显示循环肌肉生长抑制素通过其抑制性前结构域片段主要结合在潜在复合物mstn-lc中(在小鼠中》70％，其余作为其他抑制性复合物；hill，2002)。bmp1/tll对前结构域的切割释放出活性肌肉生长抑制素，其作为负生长因子发出信号。因此，化合物a给药后肌肉质量和总血浆肌肉生长抑制素水平的增加可能是由于bmp1/tll对前结构域的降解减少以及随后的负生长调节的缓解，否则会伴随骨骼肌中局部组织部位的成熟肌肉生长抑制素的释放。
[0417]
在鼠angii/pe模型中小鼠反向嵌合体(化合物a)的抗纤维化作用
[0418]
在小鼠中输注angii/pe两周导致心脏组织中胶原蛋白产生显著增加，如通过左心室羟脯氨酸(hdxp)含量所测量的(比较图16中的前两个条)，如通过液相色谱/质谱(lc/ms)所测量的。
[0419]
在该模型中，当与angii/pe对照或剂量配对的抗-rsv mab对照相比时，用化合物a处理在hdxp含量方面产生了降低(0.5mg/kg为47％，并且5mg/kg为58％)。尽管这种纤维化
生物标志物减少，但通过组织病理学分析未观察到纤维化的显著变化。
[0420]
大鼠反向嵌合体(化合物c)对dahl盐敏感大鼠模型的影响
[0421]
当饲喂高盐食物(8％ nacl)时，dahl盐敏感(dahl s)大鼠品系迅速发展高血压和相关联的合并症，如肾功能障碍、高脂血症和胰岛素抵抗。在先前的研究中，已经显示该品系还会发展心脏和肾脏纤维化。
[0422]
为了评估该模型中bmp1抑制的心脏抗纤维化作用，对dahl s大鼠饲喂0.3％ nacl食物(正常盐含量)直至4-5周龄；在第0天增加到1％ nacl食物，然后在第7天增加到8％ nacl食物。从第0天到第28天每周皮下给药5mg/kg抗rsv mab对照或5mg/kg化合物c(13y039-4b06-4334的大鼠反向嵌合体，每组n＝12)并且在第35天处死大鼠。该研究包括整个过程中接受0.3％饮食和媒介物注射的对照组(n＝12)。对于化合物c和抗rsv对照，峰值和谷值的暴露都在大鼠血浆测定(表12)ic90和ic95值(1,180和11,800ng/ml)之间的预期目标范围内。
[0423]
在研究结束时，用masson三色染色对左心室切片染色以鉴定纤维化区域，通过图像分析对其进行量化。与正常盐对照相比，注射媒介物的8％ nacl食物的大鼠表现出lv纤维化显著增加(～24％)，表明了模型效应。与媒介物处理的对照相比，用化合物c而非抗rsv对照mab处理产生了lv纤维化的显著减少(～88％)(图17a)。
[0424]
为了评估该模型中bmp1抑制的肌肉效应，在研究结束时分离腓肠肌并称重。如在angii/pe模型中所观察到的(图14)，当与媒介物或对照动物相比时，用抗bmp1抗体处理产生了骨骼肌质量的显著增加(例如，9％相对于pbs+8％ nacl)(图17b)。
[0425]
在鼠后肢固定模型中小鼠反向嵌合体(化合物a)的合成代谢作用
[0426]
为了评估bmp1抑制对骨骼肌生长和功能的影响，在鼠后肢固定模型中对反向嵌合化合物a进行了测试。在第一项旨在测试固定后肌肉恢复的研究中，老年小鼠(雄性，22个月龄)接受夹板以固定其右后肢2周。移除夹板后，将小鼠置于三个处理组之一中，并用以下方式给药2周：(i)抗rsv对照mab，5mg/kg/周，皮下；(ii)化合物a，5mg/kg/周，皮下；或(iii)抗肌肉生长抑制素mab(阳性对照)，30mg/kg，2周内3剂，皮下(每组n-10)。在这两周的恢复期后，确定了身体组成(如通过定量核磁共振(qnmr)所测量的)、骨骼肌功能和肌肉湿重。与bmp1抑制相关联的药效动力学标志物在化合物a处理组中均受到显著影响，包括血浆bmp1活性降低92％，血浆picp降低77％，以及总肌肉生长抑制素水平增加7.9倍。用化合物a处理两周导致瘦体重增加约5％，显著大于用对照抗rsv mab观察到的结果(图18)。
[0427]
此外，用化合物a处理导致腓肠肌和比目鱼肌湿重在对照和夹板固定肢中均增加，如在2周恢复期结束时所测量的。这种增加显著大于对照处理的小鼠所观察到的增加(图19)。
[0428]
除了先前在angii/pe模型中注意到的观察到的肌肉质量增加外，用化合物a处理还在肌肉功能方面产生了显著改善。肌肉重量的增加与力的增加不成比例，导致力:肌肉重量比率下降(图20的最右侧小图)，这种现象已在先前生成的肌肉生长抑制素敲除小鼠品系中观察到(amthor,2007)。
[0429]
本研究的结果证明，化合物a对bmp1/tll的抑制不仅促进老年小鼠在废用性萎缩恢复中的骨骼肌生长，而且还产生肌肉功能的改善。这些结果表明，在临床环境中13y039-4b06-4334对bmp1/tll的抑制将对虚弱和骨骼肌损失伴随持续纤维化过程的患者群体有
益。
[0430]
13y039-4b06-4334的药代动力学
[0431]
13y039-4b06-4334的药代动力学是在wistar han大鼠中单次和重复给药后确定的。
[0432]
大鼠中单次剂量药代动力学
[0433]
13y039-4b06-4334的药代动力学是在wistar han大鼠(n＝3)中以1mg/kg的标称剂量(nominal dose)单次静脉内(推注)或单次皮下施用后确定的。
[0434]
表13展示了以1mg/kg单次静脉内或皮下施用后的个体和平均药代动力学参数。13y039-4b06-4334被缓慢清除，平均终末半衰期约为5天，不包括动物1，它具有明显高更快的清除。94ml/kg的平均分布容积接近血容积，这表明抗体主要局限于体循环。
[0435]
表13：以1mg/kg的标称剂量单次静脉内或皮下施用后wistar han大鼠中13y039-4b06-4334的药代动力学参数。
[0436][0437][0438]
*对皮下施用计算cl_f和vz_f。**报告的中位数
[0439]
大鼠中重复剂量药代动力学
[0440]
在以1mg/kg每周皮下给药4周后，三只动物中的两只维持预期的暴露(cmax和auc6-168)。积累水平(auc6-168增加2.9倍)与对半衰期为5天的单克隆抗体的预期一致(表14)。第三只动物的暴露减少可能是由于ada反应，但这无法得到确认。
[0441]
表14：在4个1mg/kg的每周皮下剂量后wistar han大鼠中13y039-4b06-4334的药代动力学参数。
[0442]
[0443]
*排除一只动物
[0444]
实施方案
[0445]
实施方案1为bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含：
[0446]
(a)(i)选自来自seq id no:7、22、40、54、67、82、96、110、124、138、152、166、180、194、207和222的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:8、21、39、53、68、81、95、109、123、137、151、165、179、193、208和221的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或
[0447]
(b)包含与seq id no:7、22、40、54、67、82、96、110、124、138、152、166、180、194、207或222的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:8、21、39、53、68、81、95、109、123、137、151、165、179、193、208或221的序列至少80％相同的序列的vl区。
[0448]
实施方案2为根据实施方案1的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中(a)(i)的cdr为：seq id no:1的cdrl1；seq id no:2的cdrl2；seq id no:3的cdrl3；seq id no:4的cdrh1；seq id no:5的cdrh2；和/或seq id no:6的cdrh3。
[0449]
实施方案3为根据实施方案1或2的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含以下中的一种或多种：
[0450]
a.lcdr1，其包含与rasqsvssyla(seq id no:1)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0451]
a.lcdr2，其包含与dasnrat(seq id no:2)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0452]
a.lcdr3，其包含与qqsdswppt(seq id no:3)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0453]
a.hcdr1，其包含与gyyms(seq id no:4)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0454]
a.hcdr2，其包含与winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0455]
a.hcdr3，其包含与dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)具有至少80％序列同一性的序列。
[0456]
实施方案4为根据实施方案1至3中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含含有cdr1、cdr2和/或cdr3的vh区，该cdr1包含与gyyms(seq id no:4)具有至少80％序列同一性的序列；该cdr2包含与winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)具有至少80％序列同一性的序列；该cdr3包含与dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)具有至少80％序列同一性的序列。
[0457]
实施方案5为根据实施方案1至4中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含含有cdr1、cdr2和/或cdr3的vh区，该cdr1包含gyyms(seq id no:4)的序列，该cdr2包含winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)的序列；该cdr3包含dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)的序列。
[0458]
实施方案6为根据实施方案1至5中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含含有cdr1、cdr2和/或cdr3的vl区，该cdr1包含与rasqsvssyla(seq id no:1)具有至少80％序列同一性的序列；该cdr2包含与dasnrat(seq id no:2)具有至少80％序列同一性的序列；该cdr3包含与qqsdswppt(seq id no:3)具有至少80％序列同一性的序列。
[0459]
实施方案7为根据实施方案1至6中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包
含含有cdr1、cdr2和/或cdr3的vl区，该cdr1包含rasqsvssyla(seq id no:1)的序列；该cdr2包含dasnrat(seq id no:2)的序列；该cdr3包含qqsdswppt(seq id no:3)的序列。
[0460]
实施方案8为根据实施方案1至7中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含含有rasqsvssyla(seq id no:1)的序列的lcdr1；含有dasnrat(seq id no:2)的序列的lcdr2；含有qqsdswppt(seq id no:3)的序列的lcdr3；含有gyyms(seq id no:4)的序列的hcdr1；含有winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)的序列的hcdr2；和/或含有dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)的序列的hcdr3。
[0461]
实施方案9为根据实施方案1至8中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中所有6个cdr都存在于结合蛋白中。
[0462]
实施方案10为bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含以下6个cdr：
[0463]
rasqsvssyla(seq id no:1)的lcdr1；
[0464]
dasnrat(seq id no:2)的lcdr2；
[0465]
qqsdswppt(seq id no:3)的lcdr3；
[0466]
gyyms(seq id no:4)的hcdr1；
[0467]
winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)的hcdr2；和
[0468]
dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)的hcdr3。
[0469]
实施方案11为根据实施方案10的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中该结合蛋白包含与seq id no:7 80％相同的vh区和/或与seq id no:8 80％相同的vl区。
[0470]
实施方案12为根据实施方案10或实施方案11的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中该结合蛋白包含与seq id no:7 100％相同的vh区和/或与seq id no:8 100％相同的vl区。
[0471]
实施方案13为根据实施方案10至12中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中该结合蛋白包含与seq id no:10至少80％相同的重链(hc)序列；和/或与seq id no:9至少80％相同的轻链(lc)序列。
[0472]
实施方案14为根据实施方案10至13中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中该结合蛋白包含与seq id no:10 100％相同的重链(hc)序列；和/或与seq id no:9 100％相同的轻链(lc)序列。
[0473]
实施方案15为bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含与seq id no:7 100％相同的vh区和与seq id no:8 100％相同的vl区。
[0474]
实施方案16为根据实施方案15的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含与seq id no:9 100％相同的轻链和与seq id no:10 100％相同的重链。
[0475]
实施方案17为多核苷酸序列，其编码根据实施方案1至16中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白。
[0476]
实施方案18为根据实施方案17的多核苷酸序列，其包含编码重链的seq id no:13；和/或编码轻链的seq id no:14。
[0477]
实施方案19为表达载体，其包含如实施方案17或实施方案18所限定的多核苷酸序列。
[0478]
实施方案20为重组宿主细胞，其包含如实施方案17或实施方案18所限定的多核苷酸序列，或如实施方案19所限定的表达载体。
[0479]
实施方案21为产生bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白的方法，该方法包括在适合于多核苷酸序列或表达载体的表达的条件下培养实施方案20的重组宿主细胞，由此产生包含bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白的多肽。
[0480]
实施方案22为通过实施方案21的方法产生的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白。
[0481]
实施方案23为药物组合物，其包含如实施方案1至16或实施方案22中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，以及药学上可接受的稀释剂或载剂。
[0482]
实施方案24为根据实施方案23的药物组合物，其包含如实施方案15或实施方案16所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白。
[0483]
实施方案25为治疗有此需要的受试者的纤维化相关疾病或病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如实施方案1至16或实施方案22中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，或向受试者施用如实施方案23或实施方案24所限定的药物组合物。
[0484]
实施方案26为根据实施方案25的方法，其中受试者是人。
[0485]
实施方案27为如实施方案1至16或实施方案22中任一项所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，或如实施方案23或实施方案24所定义的药物组合物，其用于疗法。
[0486]
实施方案28为如实施方案1至16或实施方案22中任一项所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，或如实施方案23或实施方案24所定义的药物组合物，其用于纤维化相关疾病或病症的治疗。
[0487]
实施方案29为如实施方案1至16或权利要求22中任一项所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，或如实施方案23或24所定义的药物组合物在制备用于治疗纤维化相关疾病或病症的药物中的用途。
[0488]
实施方案30为如前述权利要求中任一项所定义的方法或用途，其中纤维化相关疾病或病症是心脏纤维化、肺部或肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、腹膜纤维化或非酒精性脂肪性肝炎(nash)。
[0489]
实施方案31为如实施方案30所定义的方法或用途，其中心脏纤维化是肥厚型心肌病，并且肺部或肺纤维化是特发性肺纤维化。
[0490]
实施方案32为在有此需要的受试者中促进肌肉生长和/或改善肌肉功能的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如实施方案1至16或实施方案22中任一项所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，或向受试者施用如实施方案23或实施方案24所定义的药物组合物。
[0491]
实施方案33为根据实施方案32的方法，其中受试者是人。
[0492]
实施方案34为如实施方案1至16或实施方案22中任一项所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，或如实施方案23或实施方案24所定义的药物组合物，其用于促进肌肉生长和/或改善肌肉功能。
[0493]
实施方案35为如实施方案1至16或实施方案22中任一项所定义的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，或如实施方案23或24所定义的药物组合物在制备用于促进肌肉生长和/或改善肌肉功能的药物中的用途。
[0494]
序列表
[0495]
[0496]
[0497]
[0498]
[0499]
[0500]
[0501]
[0502]
[0503]
[0504]
[0505]
[0506]
[0507]
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[0509]
[0510]
[0511]
[0512]
[0513]
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[0515]
[0516]
[0517]
[0518]
[0519]
[0520]
[0521]
[0522]
[0523]
[0524]
[0525]
[0526]
[0527]
[0528]
[0529]
[0530]
[0531]
[0532]
[0533]
[0534]
[0535]
[0536]
[0537]
[0538]
[0539]
[0540]
[0541]
[0542]
[0543]
[0544][0545]
表16：反向嵌合序列lc和hc的序列人可变区与小鼠(igg2a laga ck)或大鼠(igg2b laga ck)恒定区
[0546]
[0547]
[0548]
[0549]
[0550]
[0551]
[0552]
[0553]
[0554]
[0555]
[0556]

技术特征：
1.bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含：(a)(i)选自来自seq id no:7、22、40、54、67、82、96、110、124、138、152、166、180、194、207和222的cdrh1、cdrh2、cdrh3和/或来自seq id no:8、21、39、53、68、81、95、109、123、137、151、165、179、193、208和221的cdrl1、cdrl2、cdrl3的任一种或cdr的组合；或(ii)(i)的cdr变体，其中所述变体具有1、2或3个氨基酸修饰；或(b)包含与seq id no:7、22、40、54、67、82、96、110、124、138、152、166、180、194、207或222的序列至少80％相同的序列的vh区和/或包含与seq id no:8、21、39、53、68、81、95、109、123、137、151、165、179、193、208或221的序列至少80％相同的序列的vl区。2.根据权利要求1的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中(a)(i)的所述cdr为：seq id no:1的cdrl1；seq id no:2的cdrl2；seq id no:3的cdrl3；seq id no:4的cdrh1；seq id no:5的cdrh2；和/或seq id no:6的cdrh3。3.根据权利要求1或权利要求2的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含含有cdr1、cdr2和/或cdr3的vh区，所述cdr1包含gyyms(seq id no:4)的序列，所述cdr2包含winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)的序列；所述cdr3包含dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)的序列。4.根据权利要求1至3中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含含有cdr1、cdr2和/或cdr3的vl区，所述cdr1包含rasqsvssyla(seq id no:1)的序列；所述cdr2包含dasnrat(seq id no:2)的序列；所述cdr3包含qqsdswppt(seq id no:3)的序列。5.根据权利要求1至4中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中所有6个cdr都存在于所述结合蛋白中。6.bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含以下6个cdr：rasqsvssyla(seq id no:1)的lcdr1；dasnrat(seq id no:2)的lcdr2；qqsdswppt(seq id no:3)的lcdr3；gyyms(seq id no:4)的hcdr1；winplsgetnyaqkfqg(seq id no:5)的hcdr2；和dtgeldgmnwyfdl(seq id no:6)的hcdr3。7.根据权利要求6的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中所述结合蛋白包含与seq id no:7 80％相同的vh区和/或与seq id no:8 80％相同的vl区。8.根据权利要求6或权利要求7的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中所述结合蛋白包含与seq id no:7 100％相同的vh区和/或与seq id no:8 100％相同的vl区。9.根据权利要求6至8中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中所述结合蛋白包含与seq id no:10至少80％相同的重链(hc)序列；和/或与seq id no:9至少80％相同的轻链(lc)序列。10.根据权利要求6至9中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其中所述结合蛋白包含与seq id no:10 100％相同的重链(hc)序列；和/或与seq id no:9 100％相同的轻链(lc)序列。11.bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含与seq id no:7 100％相同的vh区以及与seq id no:8 100％相同的vl区。
12.根据权利要求11的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，其包含与seq id no:9 100％相同的轻链以及与seq id no:10 100％相同的重链。13.多核苷酸序列，其编码根据权利要求1至12中任一项的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白。14.根据权利要求13的多核苷酸序列，其包含编码所述重链的seq id no:13；和/或编码所述轻链的seq id no:14。15.表达载体，其包含如权利要求13或权利要求14所限定的多核苷酸序列。16.重组宿主细胞，其包含如权利要求13或权利要求14所限定的多核苷酸序列，或如权利要求15所限定的表达载体。17.产生bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白的方法，该方法包括在适于所述多核苷酸序列或表达载体表达的条件下培养权利要求16所述的重组宿主细胞，由此产生包含所述bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白的多肽。18.药物组合物，其包含如权利要求1至12中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，以及药学上可接受的稀释剂或载剂。19.治疗有此需要的受试者的纤维化相关疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至12中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，或向所述受试者施用如权利要求18所限定的药物组合物。20.根据权利要求19的方法，其中所述受试者是人。21.如权利要求1至12中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如权利要求18所限定的药物组合物，其用于疗法。22.如权利要求1至12中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如权利要求18所限定的药物组合物，其用于纤维化相关疾病或病症的治疗。23.如权利要求1至12中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如权利要求18所限定的药物组合物在制备用于治疗纤维化相关疾病或病症的药物中的用途。24.如前述权利要求中任一项所定义的方法或用途，其中所述纤维化相关疾病或病症是心脏纤维化、肺部或肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、腹膜纤维化或非酒精性脂肪性肝炎(nash)。25.如权利要求24所限定的方法或用途，其中所述心脏纤维化是肥厚型心肌病；和所述肺部或肺纤维化是特发性肺纤维化。26.在有此需要的受试者中促进肌肉生长和/或改善肌肉功能的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至12中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白，或向所述受试者施用如权利要求18所限定的药物组合物。27.根据权利要求26的方法，其中所述受试者是人。28.如权利要求1至12中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如权利要求18所限定的药物组合物，其用于促进肌肉生长和/或改善肌肉功能。29.如权利要求1至12中任一项所限定的bmp1、tll1和/或tll2结合蛋白或如权利要求18所限定的药物组合物在制备用于促进肌肉生长和/或改善肌肉功能的药物中的用途。

技术总结
本文提供了与BMP1、TLL1和/或TLL2特异性结合的抗原结合蛋白。还提供了含有抗原结合蛋白的药物组合物。本文所描述的抗原结合蛋白和药物组合物能够用于治疗与纤维化病况或病症相关联的疾病以及促进肌肉生长和改善肌肉功能。能。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司
技术研发日：2021.07.29
技术公布日：2023/8/1