血清半衰期延长的PD-L1抑制性多肽的制作方法

血清半衰期延长的pd-l1抑制性多肽
1.相关应用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求以下的权益：2020年7月30日提交的美国专利63/059,026和2020年7月30日提交的美国专利63/059,037，其通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1，pd-l1)的特异性抗体已作为抗癌剂开发(参见，例如，美国专利号9,212,224和8,008,449)。然而，仍然需要可用于治疗癌症、感染性疾病和神经退行性疾病的其他pd-l1抑制活性。


技术实现要素：

4.在一些方面中，本文中提供了治疗性蛋白质，其包含与pd-l1结合的stefin多肽(多肽)序列的(至少一个)重组改造变体和与血清白蛋白(例如人血清白蛋白或“hsa”(human serum albumin))结合的(至少一个)多肽序列。包含在“嵌合”蛋白中的pd-l1和多肽序列可以共价连接(例如通过化学交联或作为融合蛋白)，或者非共价缔合(例如通过多聚化结构域或小分子结合结构域)。即使以二聚体的形式(否则将低于肾过滤阈值大小)，这些多肽也已经在体内药代动力学(pharmacokinetic，pk)研究中显示具有至少7天的血清半衰期，并且可以在例如细菌细胞(例如大肠杆菌(escherichia coli))中制备。
5.本公开内容的一些方面提供了嵌合蛋白，优选融合蛋白，其包含stefin多肽(多肽)的hsa结合性重组改造变体和pd-l1结合性多肽，其中hsa结合性多肽在ph 6.0以1
×
10-6
m或更小的kd与hsa结合，并且任选地在ph 7.4结合hsa的kd比在ph 6.0结合的kd大至少半个对数，并且其中pd-l1结合性多肽以1
×
10-6
m或更小的kd与pd-l1结合。
6.本公开内容的另一些方面提供了嵌合蛋白，优选融合蛋白，其包含与hsa结合的hsa结合性多肽和与pd-l1结合的pd-l1结合性多肽，其中该蛋白在人对象中的循环半衰期为大于10小时、大于24小时、大于48小时、大于72小时、大于96小时、大于120小时、大于144小时、大于168小时、大于192小时，大于216小时、大于240小时、大于264小时、大于288小时、大于312小时、大于336小时或大于360小时。
7.本公开内容的另一些方面提供了嵌合蛋白，优选融合蛋白，其包含与hsa结合的hsa结合性多肽和与pd-l1结合的pd-l1结合性多肽，其中该蛋白在人对象中具有至少7天，更优选至少10、12、14、16、18、20、22或甚至24天的循环半衰期。
8.在一些实施方案中，多肽在人患者中的血清半衰期为hsa血清半衰期的大于50％、大于60％、大于70％或大于80％。
9.在一些实施方案中，多肽(hsa或pd-l1结合性多肽)具有各自独立地由通式(i)表示的氨基酸序列：
10.fr1-(xaa)
n-fr2-(xaa)
m-fr3
ꢀꢀꢀ(i)11.其中
12.●
fr1是与mipgglseak
[0013][0014]
具有至少70％同一性的氨基酸序列；
[0015]
●
fr2是与gtnyyikvra
[0016][0017]
具有至少70％同一性的氨基酸序列；
[0018]
●
fr3是与adrvltgyqv
[0019][0020]
具有至少70％同一性的氨基酸序列；
[0021]
●
xaa在每次出现时单独地是氨基酸，
[0022]
●
n是3至20的整数，并且
[0023]
●
m是3至20的整数。
[0024]
在一些实施方案中，fr1是与seq id no：1和/或2具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr1是与seq id no：1和/或2具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列；在一些实施方案中，fr2是与seq id no：3和/或4具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr2是与seq id no：3和/或4具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列；在一些实施方案中，fr3是与seq id no：5和/或6具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr3是与seq id no：5和/或6具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列。
[0025]
在一些实施方案中，抗pd-l1多肽具有以下通式所示的氨基酸序列：
[0026][0027]
其中
[0028]
xaa在每次出现时单独地是氨基酸残基；n和m各自独立地是3至20的整数；xaa1是gly、ala、val、arg、lys、asp或glu，更优选gly、ala、arg或lys，并且甚至更优选gly或arg；xaa2是gly、ala、val、ser或thr，更优选gly或ser；xaa3是arg、lys、asn、gln、ser、thr，更优选arg、lys、asn或gln，并且甚至更优选lys或asn；xaa4是gly、ala、val、ser或thr，更优选gly或ser；xaa5是ala、val、ile、leu、gly或pro，更优选ile、leu或pro，并且甚至更优选leu或pro；xaa6是gly、ala、val、asp或glu，更优选ala、val、asp或glu，并且甚至更优选ala或
glu；并且xaa7是ala、val、ile、leu、arg或lys，更优选ile、leu或arg，并且甚至更优选leu或arg。
[0029]
例如，抗pd-l1多肽可以具有以下通式所示的氨基酸序列：
[0030][0031]
其中xaa在每次出现时单独地是氨基酸残基；n和m各自独立地是3至20的整数。
[0032]
在一些实施方案中，n是3至15、3至12、3至9、3至7、5至7、5至9、5至12、5至15、7至12或7至9。
[0033]
在一些实施方案中，m是3至15、3至12、3至9、3至7、5至7、5至9、5至12、5至15、7至12或7至9。
[0034]
在一些实施方案中，xaa在每次出现时独立地是可通过在原核或真核细胞中重组表达而添加至多肽的氨基酸，并且甚至更优选地是20种天然存在的氨基酸之一。
[0035]
在上述序列和式的一些实施方案中，(xaa)n是以下通式所示的氨基酸序列：
[0036]-aa1-aa2-aa3-gly-pro-aa4-aa5-trp-aa6-(seq id no：308)
[0037]
其中
[0038]
aa1表示具有碱性侧链的氨基酸残基，更优选lys、arg或his，并且甚至更优选lys或arg；
[0039]
aa2表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链(更优选小的脂族侧链、中性极性侧链或者碱性或酸性侧链)的氨基酸残基，甚至更优选ala、pro、ile、gln、thr、asp、glu、lys、arg或his，并且甚至更优选ala、gln、asp或glu；
[0040]
aa3表示具有芳族或碱性侧链的氨基酸残基，优选phe、tyr、trp、lys、arg或his，更优选phe、tyr、trp，并且甚至更优选his或tyr、trp或his；
[0041]
aa4表示具有中性极性或非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链(优选中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链)的氨基酸残基；更优选ala、pro、ile、gln、thr、asp、glu、lys、arg或his，并且甚至更优选gln、lys、arg、his、asp或glu；
[0042]
aa5表示具有中性极性或带电荷(酸性或碱性)或小的脂族或芳族侧链(优选中性极性侧链或带电荷侧链)的氨基酸残基；更优选ser、thr、asn、gln、asp、glu、arg或his，并且甚至更优选ser、asn、gln、asp、glu或arg；并且
[0043]
aa6表示具有芳族或酸性侧链的氨基酸残基，优选phe、tyr、trp、asp或glu；更优选trp或asp；并且甚至更优选trp。
[0044]
在上述序列和式的一些实施方案中，(xaa)n是以下通式中表示的氨基酸序列：
[0045]-aa1-aa2-aa3-phe-pro-aa4-aa5-phe-trp-(seq id no：310)
[0046]
其中
[0047]
aa1表示具有碱性侧链或芳族侧链的氨基酸残基，优选lys、arg、his、ser、thr、asn或gln，更优选lys、arg、his、asn或gln，并且甚至更优选lys或asn；
[0048]
aa2表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链(更优选小的脂族侧链、中性极性侧链或者碱性或酸性侧链)的氨基酸残基，甚至更优选ala、pro、ile、gln、thr、asp、glu、lys、arg或his，并且甚至更优选ala、gln、asp或glu；
[0049]
aa3表示具有芳族或碱性侧链的氨基酸残基，优选phe、tyr、trp、lys、arg或his，更优选phe、tyr、trp或his，并且甚至更优选tyr、trp或his；
[0050]
aa4表示具有中性极性或非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链(优选中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链)的氨基酸残基；更优选ala、pro、ile、gln、thr、asp、glu、lys、arg或his，并且甚至更优选gln、lys、arg、his、asp或glu；并且
[0051]
aa5表示具有中性极性或带电荷(酸性或碱性)或小的脂族或芳族侧链(优选中性极性侧链或带电荷侧链)的氨基酸残基；更优选ser、thr、asn、gln、asp、glu、arg或his，并且甚至更优选ser、asn、gln、asp、glu或arg。
[0052]
在上述序列和式的一些实施方案中，(xaa)n是选自seq id no：16至50的氨基酸序列，或与选自seq id no：16至50的序列具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的氨基酸序列。
[0053]
在上述序列和式的一些实施方案中，(xaa)m是以下通式所示的氨基酸序列：
[0054]-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-(seq id no：311)
[0055]
其中
[0056]
aa7表示具有中性极性或非极性侧链或酸性侧链的氨基酸残基；优选gly、ala、val、pro、trp、gln、ser、asp或glu，并且甚至更优选gly、ala、trp、gln、ser、asp或glu；
[0057]
aa8表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或芳族侧链(更优选带电荷(酸性或碱性)侧链)的氨基酸残基，更优选asp、glu、lys、arg、his、gln、ser、thr、asn、ala、val、pro、gly、tyr或phe，并且甚至更优选asp、glu、lys、arg、his或gln；
[0058]
aa9表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或芳族侧链(更优选中性极性侧链或酸性侧链)的氨基酸残基，更优选gln、ser、thr、asn、asp、glu、arg、lys、gly、leu、pro或tyr，并且甚至更优选gln、thr或asp；
[0059]
aa10表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或芳族侧链(更优选中性极性侧链或者碱性或酸性侧链)的氨基酸残基，更优选asp、glu、arg、his、lys、ser、gln、asn、ala、leu、tyr、trp、pro或gly，并且甚至更优选asp、glu、his、gln、asn、leu、trp或gly；
[0060]
aa11表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂族侧链或芳族侧链(更优选中性极性侧链或者碱性或酸性侧链)的氨基酸残基，更优选asp、glu、ser、thr、gln、arg、lys、his、val、ile、tyr或gly并且甚至更优选asp、glu、ser、thr、gln、lys或his；
[0061]
aa12表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂族侧链或芳族侧链(更优选酸性侧链)的氨基酸残基，更优选asp、glu、ser、thr、gln、asn、lys、arg、val、leu、ile、trp、tyr、phe或gly，并且甚至更优选asp、glu、ser、tyr、trp、arg或lys；
[0062]
aa13表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂族侧链或芳族侧链(更优选酸性侧链)的氨基酸残基，更优选ser、thr、gln、asn、val、ile、leu、gly、pro、asp、glu、his、arg、trp、tyr或phe，并且甚至更优选ser、thr、gln、asn、val、ile、leu、gly、asp或glu；
[0063]
aa14表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选ala、ile、trp、pro、asp、glu、arg、lys、his、ser、thr、gln或asn，并且甚至更优选ala、pro、asp、glu、arg、lys、ser、gln或asn；并且
[0064]
aa15表示氨基酸残基，优选具有中性极性或中性非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选his、arg、lys、asp、ser、thr、gln、asn、ala、val、leu、gly或phe，甚至更优选his、arg、lys、asp、ser、thr、gln或asn。
[0065]
在上述序列和式的一些实施方案中，(xaa)m是选自seq id no：51至85的氨基酸序列，或与选自seq id no：51至85的序列具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的氨基酸序列。
[0066]
在一些实施方案中，pd-l1结合性氨基酸序列与seq id no：192至200中任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性。在一些实施方案中，pd-l1结合性氨基酸序列包含seq id no：192至200中任一个的氨基酸序列。
[0067]
为了进一步说明，融合蛋白的hsa结合性多肽可具有以下通式所示的氨基酸序列：
[0068][0069]
其中xaa在每次出现时单独地是氨基酸；n是3至20的整数，并且m是3至20的整数；xaa1是gly、ala、val、arg、lys、asp或glu；xaa2是gly、ala、val、ser或thr；xaa3是arg、lys、asn、gln、ser、thr；xaa4是gly、ala、val、ser或thr；xaa5是ala、val、ile、leu、gly或pro；xaa6是gly、ala、val、asp或glu；并且xaa7是ala、val、ile、leu、arg或lys。
[0070]
在一些实施方案中，本文中提供的hsa结合性多肽的氨基酸序列以以下通式表示：
[0071][0072]
其中xaa在每次出现时单独地是氨基酸；n是3至20的整数，并且m是3至20的整数。
[0073]
在一些实施方案中，(xaa)n由下式表示：
[0074]-aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-[0075]
其中aa1是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa2是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa3是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa4是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa5是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa6是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa7是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa8是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；并且aa9是具有中性非极性亲水侧链的氨基酸。
[0076]
在一些实施方案中，(xaa)m由下式表示：
[0077]-aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-[0078]
其中aa1是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa2是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa3是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa4是具有带正电荷的极性亲水侧
链的氨基酸；aa5是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa6是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa7是具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa8是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；并且aa9是具有中性非极性亲水侧链的氨基酸。
[0079]
在一些实施方案中，具有中性非极性亲水侧链的氨基酸选自半胱氨酸(c或cys)和甘氨酸(g或gly)；具有中性非极性疏水侧链的氨基酸选自丙氨酸(a或ala)、异亮氨酸(i或ile)、亮氨酸(l或leu)、甲硫氨酸(m或met)、苯丙氨酸(f或phe)、脯氨酸(p或pro)、色氨酸(w或trp)和缬氨酸(v或val)；具有中性极性亲水侧链的氨基酸选自天冬酰胺(n或asn)、谷氨酰胺(q或gln)、丝氨酸(s或ser)、苏氨酸(t或thr)和酪氨酸(y或tyr)；具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸选自精氨酸(r或arg)、组氨酸(h或his)和赖氨酸(k或lys)；并且具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸选自天冬氨酸(d或asp)和谷氨酸(e或glu)。
[0080]
在一些实施方案中，(xaa)n由下式表示：
[0081]-aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-(seq id no：309)
[0082]
其中aa1是选自d、g、n和v的氨基酸；aa2是选自w、y、h和f的氨基酸；aa3是选自w、y、g、w和f的氨基酸；aa4是选自q、a和p的氨基酸；aa5是选自a、q、e、r和s的氨基酸；aa6是选自k、r和y的氨基酸；aa7是选自w和q的氨基酸；aa8是选自p和h的氨基酸；aa9是选自h、g和q的氨基酸。
[0083]
在一些实施方案中，(xaa)n是与seq id no：86至138中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n是seq id no：86至138中任一个的氨基酸序列。
[0084]
在一些实施方案中，(xaa)m由下式表示：
[0085]-aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-(seq id no：312)
[0086]
其中aa1是选自y、f、w和n的氨基酸；aa2是选自k、p、h、a和t的氨基酸；aa3是选自v、n、g、q、a和f的氨基酸；aa4是选自h、t、y、w、k、v和r的氨基酸；aa5是选自q、s、g、p和n的氨基酸；aa6是选自s、y、e、l、k和t的氨基酸；aa7是选自s、d、v和k的氨基酸；aa8是选自g、l、s、p、h、d和r的氨基酸；aa9是选自g、q、e和a的氨基酸
[0087]
在一些实施方案中，(xaa)m是与seq id no：139至191中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m是seq id no：139至191中任一个的氨基酸序列。
[0088]
在一些实施方案中，hsa结合性氨基酸序列与seq id no：201至235中任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性。在一些实施方案中，hsa结合性氨基酸序列包含seq id no：201至235中任一个的氨基酸序列。
[0089]
在一些实施方案中，hsa结合性多肽具有可由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸具有在45℃下的6
×
氯化钠/柠檬酸钠(ssc)、随后在65℃下0.2
×
ssc中洗涤的严格条件与seq id no：201至235中任一个杂交的编码序列，并且其中pd-l1结合性多肽具有可由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸具有在45℃下的6
×
氯化钠/柠檬酸钠(ssc)然后在65℃下0.2
×
ssc中洗涤的严格条件与seq id no：192至200中任一个杂交的编码序列。
[0090]
在一些实施方案中，在1
×
10-7
m的kd、1
×
10-8
m的kd或1
×
10-9
m的kd下，pd-l1结合
性多肽与pd-l1结合和/或hsa结合性多肽与hsa结合。
[0091]
在一些实施方案中，hsa结合性多肽在ph 7.4以这样的kd与hsa结合：所述kd比在ph 6.0与hsa结合的kd大至少1个对数、比在ph 6与hsa结合的kd大至少1.5个对数、比在ph 6与hsa结合的kd大至少2个对数、或者比在ph 6与hsa结合的kd大至少2.5个对数。
[0092]
在一些实施方案中，嵌合蛋白不抑制人血清白蛋白与hsa的结合。
[0093]
在一些实施方案中，该蛋白不抑制igg与hsa的结合。
[0094]
在一些实施方案中，除了至少一个pd-l1结合性序列和至少一个hsa结合性序列之外，本公开内容的治疗性蛋白质还包含一个或更多个另外多肽的序列，所述多肽可赋予所得治疗性蛋白质以另外的治疗活性和/或可赋予所得治疗性蛋白质以另外的pk/adme特性。
[0095]
在一些实施方案中，另外的多肽配体可以是促进抗肿瘤免疫的免疫刺激性细胞因子，例如ifn-α、il-2、il-15、il-21和il-12，或其变体序列。
[0096]
例如，另外的多肽配体可以是il-2细胞因子或其变体多肽序列。il-2细胞因子表现出多种免疫效应，并通过与il-2受体(il-2r)结合而发挥作用。il-2rα(cd25)、il-2rβ(cd122)和il-2rγ(cd132)亚单位的缔合产生三聚体高亲和力il-2rαβγ。cd25赋予与il-2的高亲和力结合，而β和γ亚单位(在自然杀伤(nk)细胞、单核细胞、巨噬细胞和静息cd4
+
和cd8
+
t细胞上表达)介导信号转导。显示cd25的表达对于免疫抑制性调节性t细胞(treg)的扩增是必需的；另一方面，在缺乏cd25的情况下，溶细胞性cd8
+
t和nk细胞可以通过il-2rβγ的接合而增殖并杀伤对il-2有响应的靶细胞。在一些包含il-2序列作为融合蛋白的一部分的实施方案中，il-2多肽序列是包含seq id no：11的氨基酸序列的突变体il-2多肽，其具有一个或更多个氨基酸替换，与野生型il-2多肽相比，所述替换消除或降低了突变体il-2多肽(包括在融合蛋白的情况下)对高亲和力il-2受体(cd25)的亲和力，同时保留了对中等亲和力il-2受体的所有或大部分天然亲和力。
[0097][0098]
已经有多种公开的方法可以获得cd25结合的适当降低，包括通过针对il-2序列的多重突变。例如，两个氨基酸r38和f42的突变被鉴定为显著降低与cd25的结合，即在高亲和力il-2r的情况下。仅仅为了举例说明，可以使用的变体il-2多肽序列包含针对seq id no：11的变体序列，其中一个或更多个下列残基已被改变：t3(例如t3a)、d20(例如d20t)、r38(例如r38a和r38d)、f42(例如f42a、f42g、f42s、f42t、f42q、f42e、f42n、f42d、f42r或f42k)、k43(例如k43e)、e61(例如e61r)、e62(例如e62a)、y45(例如y45a、y45g、y45s、y45t、y45q、y45e、y45n、y45d、y45r或y45k)和/或l72(例如l72g、l72a、l72s、l72t、l72q、l72e、l72n、l72d、l72r或l72k)(作为实例)。在一些实施方案中，il-2变体可以包括变化的组合，包括以下的组：r38d、k43e、e61r，其靶向带电荷残基；或者r38a、f42a、y45a和e62a，其靶向带电荷残基和芳族残基二者。可用作本发明融合蛋白的一部分的示例性il-2变体序列也描述于例如美国专利9,266,938和美国申请20060251617；ghasemi et al.nat commun.(2016)7：12878；tang et al.cytokine：x(2019)1(1)：1-9和heaton et al.cancer res jun(1993)
53(11)：2597-602中，其各自均通过引用并入本文。
[0099]
用于示例性pd-l1/xt/il-2变体融合体的多肽序列包括以下，其中第一个加下划线的序列是分泌信号序列，以及第二个加下划线的序列是(g4s)n连接的il-2变体多肽序列：
[0100][0101][0102]
在一些实施方案中，另外的多肽序列可以是受体配体，例如是共刺激受体的配体，并在结合时激动共刺激受体。例如，多肽配体序列可以选自b7.1、4-1bbl、ox40l、gitrl或light。
[0103]
在一些实施方案中，当另外的多肽序列需要二聚化或更高级多聚化以发挥作用
no：282的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0119]
在一些实施方案中，融合蛋白还包含第二pd-l1结合性多肽，其中第二pd-l1结合性多肽以1
×
10-6
m的kd与pd-l1结合。
[0120]
本公开内容的一些方面提供了内联融合蛋白，其包含stefin的人血清白蛋白(hsa)结合性重组改造变体、第一pd-l1结合性多肽和第二pd-l1结合性多肽，其中所述hsa结合性多肽在ph 6.0以1
×
10-6
m或更小的kd与hsa结合，并且任选地在ph 7.4与hsa结合的kd比在ph 6.0结合的kd大至少半个对数，并且其中所述第一pd-l1结合性多肽和所述第二pd-l1结合性多肽以1
×
10-6
m的kd与pd-l1结合。
[0121]
在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。
[0122]
在一些实施方案中，接头是刚性接头或柔性接头。
[0123]
在一些实施方案中，刚性接头包含seq id no：294的序列，或者柔性接头包含seq id no：293的序列。
[0124]
在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：283的氨基酸序列，或者与seq id no：283的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0125]
在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：284的氨基酸序列，或者与seq id no：284的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0126]
在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：285的氨基酸序列，或者与seq id no：285的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0127]
在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：286的氨基酸序列，或者与seq id no：286的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0128]
在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：287的氨基酸序列，或者与seq id no：287的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0129]
在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：290的氨基酸序列，或者与seq id no：290的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0130]
在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：291的氨基酸序列，或者与seq id no：291的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0131]
在一些实施方案中，接头是柔性接头，任选地，其中柔性接头包含seq id no：293的序列。
附图说明
[0132]
图1a.pd-l1/血清白蛋白结合性内联融合(in-line fusion，ilf)蛋白的示意图。
[0133]
图1b.在纯化后pd-l1/血清白蛋白结合性ilf的sec-hplc色谱图。
[0134]
图2.pd-l1/血清白蛋白结合三聚体ilf蛋白的示意图。
[0135]
图3.经纯化的pd-l1/血清白蛋白结合性三聚体ilf蛋白的产生和sds-page分析。
[0136]
图4.示出了ilf三聚体保留与pd-l1靶抗原和血清白蛋白二者的结合的biacore
tm
动力学分析。
[0137]
图5.示出了半衰期延长的三聚体的图，所述三聚体与人pd-l1
结合(通过elisa表明)并且表现出与亲本分子ava04-251的类似结合。
[0138]
图6.示出了半衰期延长的ilf多肽的效力类似于pd-1/pd-l1阻断生物测定中的亲本分子的图。
[0139]
图7.示出了在ph 7.4下通过elisa表明的半衰期延长的ilf多肽结合与人血清白蛋白结合等同的图。
[0140]
图8.示出了ilf半衰期延长的三聚体(ava04-251 xt14)的混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，mlr)是功能性的并且在格式化时保留效力(与亲本分子相比)。
[0141]
图9.ilf半衰期延长三聚体在小鼠中的药代动力学谱。
[0142]
图10a至10c.ilf ava04-251 xt14在a375异种移植物模型中的体内效力。图10a中示出了随时间变化的单独迹线。图10b示出了按组合并的图10a中的结果。图21c示出了各组中的肿瘤体积。
[0143]
图11.来自大肠杆菌的ava04-251 xt14-cys的表达和纯化。
[0144]
图12a.抗小鼠pd-l1半衰期延长三聚体的产生和表征。
[0145]
图12b.使用biacore
tm
确定ava04-182 xt20针对小鼠pd-l1 fc的kd。
[0146]
图13a和13b.示出了在ph 7.4(图13a)和6.0(图13b)下ava04-182xt20与msa结合的elisa。
[0147]
图13c.ava04-182和ava04-182 xt20二者的mpd-l1竞争性elisa。
[0148]
图14.ava04-182 xt20三聚体、ava04-182fc形式多肽在小鼠中的药代动力学谱。
[0149]
图15a至15c.ava04-251 bh cys ilf二聚体蛋白的示意图(图15a)和表征。图15b示出了纯度分析，以及图15c示出了sds-page分析。
[0150]
图16a和16b.使用针对hupd-l1的结合elisa，与亲本分子相比，对经荧光标记的多肽ava04-251 bh cys800(图16a)和ava04-251 xt14 cys800(图16b)的结合能力的评价。
[0151]
图17.治疗之后4小时在两个a375黑素瘤异种移植物模型中的经荧光标记的抗hupd-l1多肽的生物分布的代表性图像。
[0152]
图18.在hsa-18半衰期延长多肽(两种不同形式：xt60和xt61)的情况下的ava04-251 xt ilf的质量控制分析(纯度)。
[0153]
图19a和19b.在ph 7.4(图19a)和ph 6.0(图19b)下xt60和xt61 ilf与hsa结合的biacore动力学分析。
[0154]
图20.在ph 7.4下xt60和xt61 ilf与hsa和msa的结合elisa。
[0155]
图21.在ph 6.0下针对与msa的结合的xt60和xt61 ilf biacore动力学分析。
[0156]
图22.xt60和xt61 ilf多肽与人pd-l1 fc结合的biacore动力学分析。
具体实施方式
[0157]
本公开内容基于嵌合蛋白的产生，该嵌合蛋白包含与pd-l1结合的多肽和与人血清白蛋白(hsa)结合的多肽。hsa结合性多肽以受控的方式延长了与其缀合的pd-l1结合性多肽的血清半衰期。
[0158]
基于已被改造以稳定地展示产生结合表面的两个环的天然存在的蛋白质(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)，本公开内容的多肽提供了优于抗体、抗体片段和其他非抗体分子结合蛋白质的许多优点。一个是多肽本身的小尺寸。在其单体形式中，其为约14kda，或抗体大小的1/10。这种小尺寸使组织穿透提高的可能性更大，特别是在不良地血管化和/或纤维化的靶组织(例如肿瘤)中。多肽具有简单的蛋白质结构(相对于多结构域抗体)，并且由于多肽不需要二硫键或其他翻译后修饰来发挥功能，因此这些多肽可以在原核和真核系统中制备。
[0159]
使用多肽文库(例如在所附实施例中描述的噬菌体展示技术)以及定向诱变，可以产生具有可调节结合动力学的多肽，其具有用于治疗用途的理想范围。例如，多肽可对hsa或pd-l1具有高亲和力，例如单体多肽的单数字纳摩或更低的kd，以及多价形式中的皮摩kd和亲和力。可生成多肽，其具有针对hsa或pd-l1的紧密结合动力学，例如在10-4
至10-5
(s-1)范围内的慢k
off
速率，这有利于靶组织定位。
[0160]
本公开内容的嵌合蛋白包含具有高度选择性的多肽。
[0161]
不需要二硫键和翻译后修饰也使得包括多肽在内的嵌合蛋白的许多实施方案能够通过引入到患者组织内的基因递送构建体的表达而治疗性地递送，包括其中蛋白质被全身性递送(例如来自肌肉组织的表达)或局部递送(例如通过肿瘤内基因递送)的形式。
[0162]
多肽(也简称为)是小的、高度稳定的多肽(例如蛋白质)，其是stefin多肽的重组改造变体。因此，术语“多肽”在本文中可以与术语“stefin多肽的重组改造变体”互换使用。stefin多肽是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的蛋白质亚组，该家族是涵盖了包含多个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样序列的蛋白质的家族。半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的stefin亚组是相对较小的(约100个氨基酸)单结构域蛋白质。它们未接受任何已知的翻译后修饰，并且缺乏二硫键，这表明它们将能够在广泛范围的胞外和胞内环境中相同地折叠。stefin a是单体、单链、98个氨基酸的单结构域蛋白。stefin a的结构已被解出，有利于stefin a合理突变为多肽。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的唯一已知的生物活性是抑制组织蛋白酶活性，这使得能够对经改造蛋白的剩余生物活性进行全面测试。
[0163]
多肽显示两个肽环和一个n端序列，它们都可以被随机分配以以高亲和力和特异性以与单克隆抗体相似的方式与期望的靶蛋白结合。通过stefin a蛋白支架稳定两种肽会限制肽可能采用的构象，从而与游离肽库相比提高结合亲和力和特异性。这些经改造的非抗体结合蛋白被设计成模拟单克隆抗体在不同应用中的分子识别特性。可以对stefin a多肽序列的其他部分进行改变，这种改变可以改善这些亲和试剂的性质，例如提高稳定性，使它们在例如温度和ph的一定范围内都是稳健的。在一些实施方案中，多肽包含来源于stefin a的序列，所述序列与stefin a野生型序列例如人stefin a具有显著同一性。在一些实施方案中，多肽具有与对应于人stefin a的序列共享至少25％、35％、45％、55％或60％同一性的氨基酸序列。例如，
多肽可以具有共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％同一性的氨基酸序列，例如，其中所述序列变异不会不利地影响所述支架与期望靶标结合的能力，并且例如，其不会恢复或产生例如野生型stefin a所具有的那些生物学功能，但会恢复或产生在本文中所述的突变变化中废除的那些生物学功能。
[0164]
双特异性蛋白
[0165]
本公开内容的一个方面提供了嵌合蛋白，其包含结合程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1，pd-l1)的多肽和结合人血清白蛋白的多肽(hsa)。
[0166]
pd-l1是由活化的t和b细胞表达的关键免疫检查点受体，并介导免疫抑制。pd-1是cd28受体家族的成员，该家族包含cd28、ctla-4、icos、pd-1和btla。已经鉴定了pd-1的两种细胞表面糖蛋白配体，即程序性死亡配体-1(pd-l1)和程序性死亡配体-2(pd-l2)，它们在抗原呈递细胞以及许多人癌症上表达，并且已经显示在与pd-1结合时下调t细胞活化和细胞因子分泌(freeman et al.，j.exp.med.192(7)：1027-34(2000)；latchm an et al.，nat immunol 2：261-8(2001))。
[0167]
pd-1主要在外周组织中发挥功能，其中活化的t细胞可能遇到由肿瘤和/或基质细胞表达的免疫抑制性pd-l1(也称为b7-h1或cd274)和pd-l2(b7-dc)配体(flies et al.，yale j biol med 84：409-21(2011)；topalian et al.，curr opin immuno 24：1-6(2012))。
[0168]
pd-1/pd-l1相互作用的抑制在临床前模型中介导了强效的抗肿瘤活性(美国专利no：8,008,449和7,943,743)。pd-l1的上调显示可允许癌症逃避宿主免疫系统。对来自患有肾细胞癌的患者的196个肿瘤试样的分析发现，pd-l1的高肿瘤表达与肿瘤侵袭性提高以及死亡风险提高4.5倍相关(thompson et al.，proc natl acad sci usa 101(49)：17174-9(2004))。具有更高pd-l1表达的卵巢癌患者预后明显差于更低表达的患者。pd-l1表达与上皮内cd8+ t淋巴细胞计数呈负相关，这表明肿瘤细胞上的pd-l1可抑制抗肿瘤cd8+ t细胞(hamanishi et al.，proc natl acad sci usa 104(9)：3360-3365(2007))。
[0169]
pd-l1还与感染性疾病，特别是慢性感染性有关。细胞毒性cd8 t淋巴细胞(cytotoxic cd8 t lymphocyte，ctl)在控制感染中发挥着关键作用。然而，在慢性感染期间，活化的ctl通常会失去效应物功能。b7/cd28家族的pd-1受体及其配体pd-l1作为t细胞共抑制途径发挥作用，并且正在成为在人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒以及能够引起慢性感染的其他细菌、原生动物和病毒病原体的慢性感染期间将效应子ctl转化为耗竭的ctl的主要调节剂。这样的细菌和原生动物病原体可包括大肠杆菌(e.coli)、葡萄球菌属(staphylococcus sp.)、链球菌属(streptococcus sp.)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、贾第虫(giardia)、疟疾、利什曼原虫(leishmania)和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)。重要的是，pd-1/pd-l1途径的阻断能够恢复耗竭的ctl的功能。因此，pd1/pd-l1是开发针对慢性细菌和病毒感染的有效预防性和治疗性疫苗的靶标(参见，例如h hofmeyer et al.，journal of biomedicine and biotechnology，vol.2011，article id 451694，9 pages，doi：10.1155/2011/451694)。
[0170]
最近的研究还表明，系统性免疫抑制可能会削弱提高神经退行性疾病脑修复所需的保护性细胞介导免疫应答的能力。通过使用阿尔茨海默病(alzheimer
′
s disease)的小
鼠模型，显示出针对程序性死亡1(pd-1)途径的免疫检查点阻断可引起干扰素γ依赖性全身性免疫应答，随后单核细胞来源的巨噬细胞被募集至脑。当在具有确定病理学的小鼠中诱导时，这种免疫应答导致脑淀粉样蛋白-β(aβ)斑块的清除和认知能力的改善。这些发现表明，在神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)中可使用针对pd-l1的抗体来治疗性地靶向免疫检查点(参见，例如，baruch et al.，nature medicine，january 2016，doi：10.1038/nm.4022)。
[0171]
人血清白蛋白(hsa)是由alb基因编码的蛋白质。hsa是血清半衰期为约20天的585个氨基酸的多肽(约67kda)，并且其主要负责维持胶体渗透血压、血液ph以及许多内源和外源配体的运输和分布。hsa具有三个结构上同源的结构域(结构域i、ii和iii)，几乎完全处于α-螺旋构象，并通过17个二硫桥而高度稳定。代表性的hsa序列由uniprotkb主登录号p02768提供，并且可包括其其他人同种型。
[0172]
多肽包含多肽，其中至少一个溶剂可及环来自野生型stefin a蛋白，其具有以使affimer多肽能够选择性地与pd-l1或hsa结合的氨基酸序列，并且在一些实施方案中，以10-6
m或更小的kd进行结合。
[0173]
在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下，多肽以1
×
10-9
m至1
×
10-6
m的kd与pd-l1或hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下，多肽以1
×
10-6
m或更小的kd与pd-l1或hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下，多肽以1
×
10-7
m或更小的kd与pd-l1或hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下，多肽以1
×
10-8
m或更小的kd与pd-l1或hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下，多肽以1
×
10-9
m或更小的kd与pd-l1或hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下，多肽以1
×
10-9
m至1
×
10-6
m的kd与pd-l1或hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下，多肽以1
×
10-6
m或更小的kd与pd-l1或hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下，多肽以1
×
10-7
m或更小的kd与pd-l1或hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下，多肽以1
×
10-8
m或更小的kd与pd-l1或hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下，多肽以1
×
10-9
m或更小的kd与pd-l1或hsa结合。
[0174]
在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽分别以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小半个对数至2.5个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽分别以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小半个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽分别以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小至少1个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽分别以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小至少1.5个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽分别以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小至少2个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽分别以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小至少2.5个对数的kd与hsa结合。
[0175]
在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小半个对数至2.5个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少半个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，
多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少1个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少1.5个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少两个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少2.5个对数的kd与hsa结合。
[0176]
在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于10小时。在一些实施方案中，多肽在人患者中的血清半衰期大于24小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于48小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于72小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于96小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于120小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于144小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于168小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于192小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于216小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于240小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于264小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于288小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于312小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于336小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期大于360小时。在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质在人患者中的血清半衰期为24至360小时、48至360小时、72至360小时、96至360小时或120至360小时。
[0177]
在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期为hsa的血清半衰期的大于50％、大于60％、大于70％或大于80％。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期为hsa的血清半衰期的50％至80％、50％至90％、或50％至100％。
[0178]
在一些实施方案中，多肽(hsa或pd-l1结合性多肽)具有各自独立地由通式(i)表示的氨基酸序列：
[0179]
fr1-(xaa)
n-fr2-(xaa)
m-fr3
ꢀꢀ(i)[0180]
其中
[0181]
●
fr1是与mipgglseak
[0182][0183]
具有至少70％同一性的氨基酸序列；
[0184]
●
fr2是与gtnyyikvra
[0185][0186]
具有至少70％同一性的氨基酸序列；
[0187]
●
fr3是与adrvltgyqv
[0188][0189]
具有至少70％同一性的氨基酸序列；
[0190]
●
xaa在每次出现时单独地是氨基酸，
[0191]
●
n是3至20的整数，并且
[0192]
●
m是3至20的整数。
[0193]
在一些实施方案中，fr1是与seq id no：1和/或2具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr1是与seq id no：1和/或2具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列；在一些实施方案中，fr2是与seq id no：3和/或4具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr2是与seq id no：3和/或4具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列；在一些实施方案中，fr3是与seq id no：5和/或6具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr3是与seq id no：5和/或6具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列。
[0194]
在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽包含选自seq id no：16至50中任一个的环2氨基酸序列(表1)。在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽包含选自seq id no：51至85中任一个的环4氨基酸序列(表1)。
[0195]
在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：16至50中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：16至50中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：16至50中任一个的氨基酸序列。
[0196]
在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：51至85中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：51至85中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含seq id no：51至85中任一个的氨基酸序列。
[0197]
在一些实施方案中，hsa结合性多肽包含选自seq id no：86至138中任一个的环2氨基酸序列(表2)。在一些实施方案中，hsa结合性多肽包含选自seq id no：86至138中任一个的环4氨基酸序列(表2)。
[0198]
在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：86至138中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：86至138中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：86至138中任一个的氨基酸序列。
[0199]
在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：139至191中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：139至191中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方
案中，(xaa)m包含seq id no：139至191中任一个的氨基酸序列。
[0200]
表1.pd-l1结合性环序列的实例
[0201]
名称环2seq id no：环4seq id no：pd-l1-01kawgpkqww16grtiq51pd-l1-02kpygprdwd17epqldtspi52pd-l1-03keygpeeww18gdyeqvlih53pd-l1-04haygprdwd19padhvleea54pd-l1-05kdhgpiaww20edtntdgal55pd-l1-06nkhfhqrfw21gqswdqrrq56pd-l1-07nkhfpihfw22skspidlpf57pd-l1-08hefgpaewd23dpqdvylnq58pd-l1-09nahfpqsfw24gslhsfgst59pd-l1-00kehgpdsww25qeknqwvee60pd-l1-11nqhfphsfw26qknyeedph61pd-l1-12nahfgprfw27wdghkrfad62pd-l1-13ntwfpesfw28ddnqerqeh63pd-l1-14nqhfpqsfw29avtqedqav64pd-l1-15kqygpddww30evdwkyqdh65pd-l1-16kdwgpsnww31vddktlskd66pd-l1-17kqfgpkdww32qgqgkdpsq67pd-l1-18nhhfpkrfw33ghqsevqhs68pd-l1-19yrhfpqwh34tgtsiwnqd69pd-l1-20nihfppnfw35gvhdslqgyda70pd-l1-21ythfpqwt36qkgqkidkf71pd-l1-22ndhfphtfw37ddelhdtrh72pd-l1-23nqhfpsyfw38attgdewdr73pd-l1-24nqyfpphfw39shphsnhts74pd-l1-25kkhfpasfw40wrtdykyee75pd-l1-26kkffpkhfw41ndphdsvph76pd-l1-27klhfprsfw42gqqreneqe77pd-l1-28ykhfppnfw43gerqqddan78pd-l1-29eehfpfqfw44ayregsqwt79
[0202]
名称环2seq id no：环4seq id no：pd-l1-30kphfpdnfw45efydhgiiq80pd-l1-31yqyfpdqfn46eneatrdqh81pd-l1-32vqwfprsfw47gydhednrg82pd-l1-33aahfpehfw48qpadmsaef83pd-l1-34regrqdwvl49wvpfphqql84pd-l1-35wvpfphqql50regrqdwvl85
[0203]
表2.hsa结合性环序列的实例
[0204]
名称环2seq id no：环4seq id no：hsa-00wtqpknehh86rfkyfahyq139hsa-01hlkhtdaqp87fhdfwhrrw140hsa-02hdqdvlhaw88dwyhywwev141hsa-03kfhrqewad89strsihvtt142hsa-04pedfwdpeh90kqhhhyldk143hsa-05vvrttghvv91hsaqdreip144hsa-06ywwfctgqs92wvqsgynsq145hsa-07ihhrqarsl93avfwgkwsd146hsa-08shrrrayiw94qsfdkpwtt147hsa-09wdshhwrap95hyplkysfe148hsa-10dkrvkygq96whhpwhrnr149hsa-11sdwvyalql97dpwwawvvw150hsa-12fwwfwy98fdnqdliqy151hsa-13vrdwpwntf99ekknwykwd152hsa-14qkkrdedyi100drhksrwgi153hsa-15gvheeprkl101lnpftpsvt154hsa-16ewwqkhwps102ykgallnhd155hsa-17nffqrrwpg103wkfrnterg156hsa-18dwwqakwph104ykvhqssgg157hsa-19giwqsrwpg105fhpiagrpw158hsa-20gywaakwpg106fpntsydlq159hsa-21gfyadhwpg107fahynlksg160hsa-22nwyqqrwpg108whnygessg161hsa-23gfyarhwpg109kfyyadhqw162hsa-24dfwkahwpg110ythadphsq163hsa-25dfysvrwpg111fgvpqlgag164hsa-26ywaanhask112ysgfpfagf165hsa-27ikrlehwey113wfswpytpl166hsa-28ewdspwsen114yyhpsiqst167hsa-29khknlrwpf115flgwkdtvv168hsa-30rhfpkqtnw116dwwkwwwak169hsa-31vwgpeyqhq117nagwplvpe170hsa-32twknngqdv118yaldpfggk171hsa-33atwlnyylp119gykfwgvsd172hsa-34dqeslflnn120qgkqyillr173hsa-35gfyaqhwpd121ykrhsahdy174
[0205]
名称环2seq id no：环4seq id no：
hsa-36ghyarywpg122waqkskvhq175hsa-37gfwaskwpg123ftavskkda176hsa-38gfwqrkwpn124wgdkeniwf177hsa-39vwpadndlk125wsghpwvqk178hsa-40hwawtspgy126yadyplspk179hsa-41nffqrrwpg127wkfrntdrg180hsa-42hhshrlkgq128qtvathyhy181hsa-43yqntiflsi129whakhllsh182hsa-44fqdqftwsq130sgikkadsv183hsa-45gephwpwqa131kanlinvks184hsa-46adprhpwve132wkshvevrs185hsa-47fhkrfqsqg133wvtqkyiiq186hsa-48ewwqnrwpn134wehakdwpt187hsa-49ewyqtrwpg135fhskvldka188hsa-50efwqrhwpg136ygaqkqavw189hsa-51kfyerhwpg137esashftsq190共有gwwqrrwpg138x1x2ax3kx4dx5q191
[0206]
在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽包含选自seq id no：192至200中任一个的氨基酸序列(表3)。
[0207]
在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽包含与seq id no：192至200中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽包含与seq id no：192至200中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽包含seq id no：192至200中任一个的氨基酸序列。
[0208]
在一些实施方案中，hsa结合性多肽包含选自seq id no：201至235中任一个的氨基酸序列(表4)。
[0209]
在一些实施方案中，hsa结合性多肽包含与seq id no：201至235中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，hsa结合性多肽包含与seq id no：201至235中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，hsa结合性多肽包含seq id no：201至235中任一个的氨基酸序列。
[0210]
表3.pd-l1结合性多肽序列的实例
[0211]
[0212][0213]
表4.hsa结合性多肽序列的实例
[0214]
[0215]
[0216][0217]
在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽由包含选自seq id no：236至243和297中任一个的核酸序列的多核苷酸编码(表5)。
[0218]
在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与seq id no：236至243和297中任一个的核酸序列具有至少80％或至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与seq id no：236至243和297中任一个的核酸序列具有80％至90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，pd-l1结合性多肽由包含seq id no：236至243和297中任一个的核酸序列的多核苷酸编码。
[0219]
在一些实施方案中，hsa结合性多肽由包含选自seq id no：244至276中任一个的核酸序列的多核苷酸编码(表6)。
[0220]
在一些实施方案中，hsa结合性多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与seq id no：244至276中任一个的核酸序列具有至少80％或至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，hsa结合性多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与seq id no：244至276中任一个的核酸序列具有80％至90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，hsa结合性多肽由包含seq id no：244至276中任一个的核酸序列的多核苷酸编码。
[0221]
表5.pd-l1结合性多核苷酸序列的实例
[0222]
[0223][0224]
表6.hsa结合性多核苷酸序列的实例
[0225]
[0226]
[0227]
[0228][0229]
在此融合蛋白可包含任何一种或更多种的pd-l1结合性多肽和/或者任何一种或更多种的hsa结合性多肽。例如，融合蛋白可以压缩一种、两种、三种或更多种pd-l1结合性多肽分子和一种、两种、三种或更多种pd-l1结合性多肽分子。在一些实施方案中，融合蛋白包含三个(至少三个)pd-l1结合性多肽分子和一个(至少一个)hsa结合性多肽分子。
[0230]
在一些实施方案中，融合蛋白包含两个pd-l1结合性多肽和一个hsa结合性多肽。在一些实施方案中，融合蛋白从n端至c端包含第一pdl-l1结合性多肽、第二pd-l1结合性多肽和hsa结合性多肽。在一些实施方案中，融合蛋白从n端至c端包含第一pdl-l1结合性多肽、hsa结合性多肽和第二pd-l1结合性多肽。在一些实施方案中，融合蛋白从n端至c端包含hsa结合性多肽、第一pdl-l1结合性多肽和第二pd-l1结合性多肽。在一些实施方案中，融合蛋白的多肽直接彼此缀合。如本文中所述，在一些实施方案中，融合蛋白的多肽通过一个或更多个接头彼此缀合。
[0231]
在一些实施方案中，融合蛋白包含与表7中的氨基酸序列中的任一种(例如，seq id no：277至291)具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：277至291的氨基酸序列中的任一种具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：277至291的氨基酸序列中的任一种。
[0232]
在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：277具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：278具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：279具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：280具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：281具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的
氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：282具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：283具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：284具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：285具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：286具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：287具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：288具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：289具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：290具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与seq id no：291具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
[0233]
表7.在pd-l1结合性蛋白的情况下的半衰期延长内联融合体
[0234]
[0235][0236]
本文中提供的融合蛋白包含与pd-l1结合性多肽连接的hsa结合性多肽，并且由于结合性多肽的存在而具有延长的半衰期。术语半衰期是指物质(例如，包含pd-l1结合性多肽的蛋白质)失去其药理或生理活性或浓度的一半所花费的时间量。生物半衰期会受到该物质的消除、排泄、降解(例如酶促降解)或在身体某些器官或组织中的吸收和浓缩的影响。例如，可通过确定物质的血浆浓度达到其稳态水平一半所花费的时间(“血浆半衰期”)来评估生物半衰期。
[0237]
在一些实施方案中，hsa结合性多肽延长了pd-l1结合性
多肽在体内的血清半衰期。例如，相对于未与hsa结合性多肽连接的pd-l1结合性多肽的半衰期，hsa结合性多肽可将pd-l1结合性多肽的半衰期延长至少1.2倍。在一些实施方案中，相对于未与hsa结合性多肽连接的pd-l1结合性多肽的半衰期，hsa结合性多肽将pd-l1结合性多肽的半衰期延长了至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍或至少30倍。在一些实施方案中，相对于未与hsa结合性多肽连接的pd-l1结合性多肽的半衰期，hsa结合性多肽将pd-l1结合性多肽的半衰期延长了1.2倍至5倍、1.2倍至10倍、1.5倍至5倍、1.5倍至10倍、2倍至5倍、2倍至10倍、3倍至5倍、3倍至10倍、15倍至5倍、4倍至10倍或5倍至10倍。在一些实施方案中，相对于未与hsa结合性多肽连接的pd-l1结合性多肽的半衰期，体内施用之后，hsa结合性多肽将pd-l1结合性多肽的半衰期延长至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时，例如至少1周。
[0238]
多肽
[0239]
多肽是任意长度的氨基酸(天然存在或非天然存在的，例如氨基酸类似物)的聚合物。除非另有说明，否则术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。蛋白质是多肽的一个实例。应当理解，多肽可以是线性的或支化的，它可包含天然存在的和/或非天然存在的(例如经修饰的)氨基酸，和/或它可包含非氨基酸(例如散布在整个聚合物中)。如本文中所提供的多肽可以被修饰(例如，天然或非天然地修饰)，例如，通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或与标记组分缀合进行修饰。在一些情况下，多肽可包含至少一种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)和/或其他修饰。
[0240]
氨基酸(也称为氨基酸残基)参与多肽的肽键。通常来说，本文中用于指定氨基酸的缩写是基于iupac-iub生物化学命名委员会的建议(参见biochemistry(1972)11：1726-1732)。例如，met、ile、leu、ala和gly分别代表甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸的“残基”。残基是通过消除羧基的oh部分和α-氨基的h部分而来源于相应的α-氨基酸的基团。如由k.d.kopple，“peptides and amino acids”，w.a.benjamin inc.，new york and amsterdam，1966，pages 2 and 33所定义，氨基酸侧链是不包括-ch(nh2)cooh部分的氨基酸的一部分。
[0241]
在一些实施方案中，本文中所使用的氨基酸是例如在蛋白质中发现的天然存在的氨基酸，或者包含氨基和羧基的这样的氨基酸的天然存在的合成代谢或分解代谢产物。氨基酸侧链的实例包括选自下列氨基酸的侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，以及已被鉴定为肽多糖细菌细胞壁成分的那些氨基酸和氨基酸类似物。
[0242]
具有碱性侧链的氨基酸包括arg、lys和his。具有酸性侧链的氨基酸包括glu和asp。具有中性极性侧链的氨基酸包括ser、thr、asn、gln、cys和tyr。具有中性非极性侧链的氨基酸包括gly、ala、val、ile、leu、met、pro、trp和phe。具有非极性脂肪族侧链的氨基酸包括gly、ala、val、ile和leu。具有疏水侧链的氨基酸包括ala、val、ile、leu、met、phe、tyr和
trp。具有小的疏水侧链的氨基酸包括ala和val。具有芳香族侧链的氨基酸包括tyr、trp和phe。
[0243]
术语氨基酸包括本文所指的任何特定氨基酸的类似物、衍生物和同类物；例如，多肽(尤其是如果通过化学合成产生的话)可包含氨基酸类似物，例如氰基丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸(djenkolic acid)、正亮氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、二羟基苯丙氨酸、5-羟基色氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、二氨基庚二酸、鸟氨酸或二氨基丁酸。适用于本文中的其他天然存在的具有侧链的氨基酸代谢物或前体是本领域技术人员所认识的并包括在本公开内容的范围内。
[0244]
当氨基酸的结构允许立体异构形式时，本文中还包括这样的氨基酸的(d)和(l)立体异构体。本文中氨基酸和氨基酸的构型用适当的符号(d)、(l)或(dl)表示；此外，当未指定构型时，氨基酸或残基可以具有构型(d)、(l)或(dl)。应当注意，本公开内容的一些化合物的结构包括不对称碳原子。因此，应当理解，由这样的不对称性引起的异构体包括在本公开内容的范围内。这样的异构体可以通过经典的分离技术和空间控制合成以基本上纯的形式获得。为了本公开内容的目的，除非明确相反地指出，否则命名的氨基酸应被解释为包括(d)或(l)立体异构体二者。
[0245]
在两个或更多个核酸或多肽的情况下，百分比同一性是指当进行比较和比对(必要时引入缺口)以获得最大对应性并且不考虑任何保守氨基酸替换作为序列同一性的一部分的情况下，两个或更多个相同(相同/100％同一性)或具有特定百分比(例如，至少70％同一性)的相同的核苷酸或氨基酸残基的序列或子序列。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或者通过目视检查来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的多种算法和软件是本领域中公知的。这些算法和软件包括但不限于blast、align、megalign、bestfit、gcg wisconsin package及其变化形式。在一些实施方案中，本公开内容的两个核酸或多肽基本上相同，这意味着当使用序列比较算法或通过目视检查进行比较和比对以获得最大对应性时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一些实施方案中具有至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方案中，同一性存在于氨基酸序列的长度为至少约10个残基、至少约20个残基、至少约40至60个残基、至少约60至80个残基或其间任何整数值的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于比60至80个残基更长(例如至少约80至100个残基)的区域上，并且在一些实施方案中，所述序列在被比较的序列(例如靶蛋白或抗体的编码区)的全长上基本相同。在一些实施方案中，同一性存在于核苷酸序列长度为至少约10个碱基、至少约20个碱基、至少约40至60个碱基、至少约60至80个碱基或其间任何整数值的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于比60至80个碱基更长(例如至少约80至1000个碱基或更多)的区域上，并且在一些实施方案中，所述序列在被比较的序列(例如编码目的蛋白质的核苷酸序列)的全长上基本相同。
[0246]
保守氨基酸替换是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替代的替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已被普遍定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链例如(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯
丙氨酸替换酪氨酸是保守替换。通常来说，本公开内容的多肽、可溶性蛋白质和/或抗体的序列中的保守替换不会消除含有氨基酸序列的多肽、可溶性蛋白质或抗体与靶结合位点的结合。鉴定不消除结合的氨基酸保守替换的方法是本领域中公知的。
[0247]
在本文中，应该理解的是，分离的分子(例如，多肽(例如，可溶性蛋白质、抗体等)多核苷酸(例如，载体)、细胞或其他组合物)处于在自然界中未出现的形式。例如，分离的分子已经被纯化到自然界不可能的程度。
[0248]
在一些实施方案中，分离的分子(例如，多肽(例如，可溶性蛋白质、抗体等)、多核苷酸(例如，载体)、细胞或其他组合物))是基本上纯的，这指的是分离的分子为至少50％纯(例如，不含与分子的未纯化形式相关的50％污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯。
[0249]
缀合物，其包含多肽融合物
[0250]
在本文中的动词缀合(与动词连接可互换使用)是指两个或更多个分子(例如，多肽和/或化学部分)连接在一起以形成另一分子。因此，一个分子(例如，pd-l1结合性多肽)与另一分子(例如，pd-l1多肽、药物分子或其他治疗性蛋白质或核酸)缀合形成了缀合物。两个或更多个分子的连接可以是，例如，通过非共价键或共价键。缀合物的非限制性实例包括化学缀合物(例如，通过“点击”化学或另一化学反应连接)和融合物(通过连续肽键连接的两个分子)。在一些实施方案中，缀合物是融合多肽，例如融合蛋白。
[0251]
融合多肽(例如，融合蛋白)是包含至少两个结构域(例如，蛋白质结构域)的多肽，所述结构域由包含至少两个独立分子(例如，两个基因)的核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，融合蛋白包含两个多肽，其通过酰胺键共价连接(至多肽的氨基酸)以形成连续的融合多肽(例如，融合蛋白)。在一些实施方案中，融合蛋白包含三个多肽，其通过酰胺键共价连接(至多肽的氨基酸)以形成连续的融合多肽(例如，融合蛋白)。在一些实施方案中，多肽(例如，2、3、4或更多个多肽)通过多肽(例如，hsa结合性多肽)的c端或n端的连续肽键彼此缀合。
[0252]
接头是插入第一多肽(例如，多肽)和第二多肽(例如，另一多肽、fc结构域、配体结合结构域等)之间的分子。接头可以是任何分子，例如一个或更多个核苷酸、氨基酸、化学官能团。在一些实施方案中，接头是肽接头(例如，两个或更多个氨基酸)。接头不应不利地影响多肽的表达、分泌或生物活性。在一些实施方案中，接头不是抗原性的，并且不会引发免疫应答。免疫应答包括来自先天免疫系统和/或适应性免疫系统的应答。因此，免疫应答可以是细胞介导的应答和/或体液免疫应答。免疫应答可以是例如t细胞应答、b细胞应答、自然杀伤(natural killer，nk)细胞应答、单核细胞应答和/或巨噬细胞应答。本文中考虑了其他细胞应答。
[0253]
在一些实施方案中，接头是非蛋白质编码的。
[0254]
研究人员设计的经验性接头根据其结构通常分为三类：柔性接头、刚性接头和体内可切割接头。除了将功能结构域连接在一起(例如在柔性和刚性接头中)或在体内释放游离功能结构域(例如在体内可切割接头中)的基本作用外，接头还可为融合蛋白的产生提供许多其他优势，例如提高生物活性、提高表达产量和实现期望的药代动力学谱。接头不应不
利地影响融合蛋白的表达、分泌或生物活性。接头不应该是抗原性的，并且也不应该引发免疫应答。
[0255]
合适的接头是本领域技术人员已知的，并且通常包含甘氨酸和丝氨酸残基的混合物，并且通常包括空间上不受阻碍的氨基酸。可并入可用接头中的其他氨基酸包括苏氨酸和丙氨酸残基。接头的长度范围可以改变，例如1至50个氨基酸的长度、1至22个氨基酸的长度、1至10个氨基酸的长度、1至5个氨基酸的长度或1至3个氨基酸的长度。在一些实施方案中，接头可包含切割位点。在一些实施方案中，接头可包含酶切割位点，使得第二多肽可与第一多肽分离。
[0256]
在一些实施方案中，接头可以被表征为柔性的。当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，通常应用柔性接头。它们通常由小的非极性(例如gly)或极性(例如ser或thr)氨基酸构成。参见，例如，argos p.(1990)“an investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion”j mol biol.211：943-958。这些氨基酸的小尺寸提供了柔性，并允许连接功能结构域的移动性。ser或thr的引入可通过与水分子形成氢键来保持接头在水溶液中的稳定性，并因此降低了接头和蛋白质部分之间不利的相互作用。最常用的柔性接头具有主要由gly和ser残基组成的序列(“gs”接头)。最广泛使用的柔性接头的实例是序列(gly-gly-gly-gly-ser)n。通过调节拷贝数目“n”，可以优化这种gs接头的长度，以实现功能结构域的适当分离，或保持必要的域间相互作用。除gs接头外，还为重组融合蛋白设计了许多其他柔性接头。因为这些柔性接头也富含小的或极性的氨基酸(例如gly和ser)，但是可包含另外的氨基酸(例如thr和ala)以保持柔性，以及极性氨基酸(例如lys和glu)以提高溶解性。
[0257]
在一些实施方案中，接头可以被表征为刚性的。尽管柔性接头具有被动连接功能结构域并允许一定程度的移动的优点，但在某些融合蛋白实施方案中，这些接头缺乏刚性可能是限制，例如在表达产量或生物活性方面中。在这些情况下，柔性接头的无效性归因于蛋白质结构域的无效分离或彼此之间相互干扰的降低不足。在这种情况下，已经成功地应用了刚性接头以保持结构域之间的固定距离，并保持其独立功能。
[0258]
许多天然接头表现出α-螺旋结构。α-螺旋结构是刚性和稳定的，具有区段内氢键和紧密堆积的骨架。因此，刚性α-螺旋接头可以作为蛋白质结构域之间的刚性间隔区而发挥作用。george et al.(2002)“an analysis of protein domain linkers：their classification and role in protein folding”protein eng.15(11)：871-9。通常来说，刚性接头通过采用α-螺旋结构或通过包含多个pro残基而表现出相对刚性的结构。在许多情况下，它们比柔性接头更有效地分离功能结构域。通过改变拷贝数可以容易地调节接头的长度，以实现结构域之间的最佳距离。结果是，当结构域的空间分离对于保持融合蛋白的稳定性或生物活性至关重要时，选择刚性接头。在这方面，已将具有(eaaak)n序列的形成α螺旋接头应用于许多重组融合蛋白的构建。另一类刚性接头具有富含pro的序列(xp)n，其中x表示任何氨基酸，优选ala、lys或glu。。
[0259]
仅仅为了举例说明，示例性的接头包括：
[0260][0261][0262]
可用于本发明融合蛋白的其他接头包括但不限于sergly、ggsg(seq id no：313)、gsgs(seq id no：314)、gggs(seq id no：315)、s(ggs)n(seq id no：15)(其中n为1至7)、gra、聚(gly)、聚(ala)、gggsggg(seq id no：316)、esggggvt(seq id no：317)、lesggggvt(seq id no：318)、graqvt(seq id no：319)、wraqvt(seq id no：320)、和argraqvt(seq id no：321)。下面描述的fc融合体的铰链区也可被认为是接头。
[0263]
任何缀合方法都可以用于或容易适用于将分子连接到本公开内容的多肽上，包括例如hunter，et al.，(1962)nature 144：945；david，et al.，(1974)biochemistry 13：1014；pain，et al.，(1981)j.immunol.meth.40：219；and nygren，j.，(1982)histochem.and cytochem.30：407所描述的方法。
[0264]
治疗剂
[0265]
在一些实施方案中，融合蛋白可包含治疗性分子(例如，治疗性蛋白)，并且例如，可用于在对象(例如，人对象或其他动物对象)中预防和/或治疗疾病。
[0266]
在一些实施方案中，融合蛋白用于治疗自身免疫病(对象的免疫系统错误攻击他/她的身体的病症)。自身免疫病的非限制性实例包括重症肌无力、寻常性天疱疮、视神经脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(狼疮)、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，aps)、自身免疫性荨麻疹、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy，cidp)、银屑病、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、炎性肠病、克罗恩病、舍格伦综合征(sjogren
′
s syndrome)、溶血性贫血、中性粒细胞减少症、副肿瘤性小脑变性、副蛋白血症性多发性神经病、原发性胆汁性肝硬化、僵人综合征、白癜风、温热特发性溶血性贫血(warm idiopathic haemolytic anaemia)、多发性硬化(multiple sclerosis)、1型糖尿病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性血管炎、pernicus贫血和乳糜泻。本文中考虑了其他自身免疫病。
[0267]
在一些实施方案中，融合蛋白用于治疗癌症。癌症的非限制性实例包括皮肤癌(例如，黑色素瘤或非黑色素瘤，例如基底细胞或鳞状细胞)、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾(肾)癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、外分泌癌和胰腺癌。本文考虑了其他癌症。
[0268]
本领域已知的术语“治疗”是指减轻至少一种与疾病相关的症状的过程。症状可以是疾病的身体、精神或病理表现。与多种疾病相关的症状是已知的。为了治疗或预防特定病症，本文中提供的缀合物(例如，包含与治疗性分子连接的多肽的融合蛋白)应以有效量施用，该有效量可以是用于治疗或预防该疾病的任何量。因此，在一些实施方案中，有效量是用于减轻与被治疗的特定疾病相关的症状的量。例如，确定多种治疗性分子的有效量的方法是已知的。
[0269]
对象可以是任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、犬科、猫科和啮齿类。“患者”是指人对象。
[0270]
在一些实施方案中，多肽被认为是“可药用的”，并且在一些实施方案中，与可药用赋形剂一起配制。如果分子或其他物质/药剂被联邦政府或州政府的监管机构批准或可被其批准，或被列入在美国药典或其他公认的用于动物(包括人)的药典中，则该分子或其他物质/药剂被认为是“可药用的”。赋形剂可以是与多肽组合施用的任何惰性(无活性)、无毒药剂。赋形剂的非限制性实例包括缓冲剂(例如无菌盐水)、盐、载体、防腐剂、填充剂、着色剂。
[0271]
使用方法
[0272]
本公开内容的融合蛋白可用于多种应用，包括但不限于治疗性处理方法，例如癌症的免疫治疗。在一些实施方案中，本文中所述的融合蛋白可用于激活、促进、提高和/或增强免疫应答，抑制肿瘤生长，减小肿瘤体积，诱导肿瘤消退，提高肿瘤细胞凋亡，和/或降低肿瘤的致瘤性。在一些实施方案中，本公开内容的多肽或药剂也可用于针对病原体(例如病毒)的免疫治疗。在一些实施方案中，本文中所述的融合蛋白可用于抑制病毒感染、减少病毒感染、提高病毒感染的细胞凋亡和/或提高对病毒感染的细胞的杀伤。使用方法可以是体外、离体或体内方法。
[0273]
本公开内容提供了使用融合蛋白在对象中激活免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了使用本文中所述的融合蛋白用于在对象中促进免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了使用融合蛋白在对象中提高免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了使用融合蛋白在对象中增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包括提高细胞介导的免疫力。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高th1型应答。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高t细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高cd4+t细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高cd8+t细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高ctl活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包括提高nk细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高t细胞活性和提高nk细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高cu活性和提高nk细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或
增强包含抑制或降低treg细胞的抑制活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含抑制或降低mdsc的抑制活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高记忆性t细胞的百分比数。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高长期免疫记忆功能。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强包含提高长期记忆。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强不包括实质性副作用和/或基于免疫的毒性的证据。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、提高和/或增强不包括细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，crs)或细胞因子风暴的证据。在一些实施方案中，免疫应答是抗原刺激的结果。在一些实施方案中，抗原刺激是肿瘤。在一些实施方案中，抗原刺激是癌症。在一些实施方案中，抗原刺激是病原体。在一些实施方案中，抗原刺激物是病毒感染的细胞。
[0274]
用于确定融合蛋白是否激活或抑制免疫应答的体内和体外测定是本领域已知的。
[0275]
在一些实施方案中，在对象中提高免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的融合蛋白，其中该融合蛋白与人pd-l1结合。在一些实施方案中，在对象中提高免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的融合蛋白，其中该融合蛋白包含与pd-l1特异性结合的多肽。在一些实施方案中，在对象中提高免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的编码融合蛋白的多核苷酸，其中所述编码融合蛋白的多核苷酸在患者体内表达时产生包含pd-l1结合性多肽的重组融合蛋白。
[0276]
在本文中所述方法的一些实施方案中，激活或增强对肿瘤的持续或长期免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的结合人pd-l1的融合蛋白。在一些实施方案中，激活或增强对肿瘤的持续免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的所述融合蛋白。在一些实施方案中，激活或增强对肿瘤的持续免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的编码融合蛋白的多核苷酸，其中所述编码融合蛋白的多核苷酸在患者体内表达时产生包含pd-l1结合性多肽的重组融合蛋白。
[0277]
在本文中所述方法的一些实施方案中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久或长期免疫的方法包括向对象施用治疗有效量的结合人pd-l1的融合蛋白。在一些实施方案中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持续免疫的方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的融合蛋白。在一些实施方案中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持续免疫的方法包括向对象施用治疗有效量的编码融合蛋白的多核苷酸，其中所述编码融合蛋白的多核苷酸在患者体内表达时产生包含pd-l1结合性多肽的重组融合蛋白。
[0278]
在本文中所述方法的一些实施方案中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包括向对象施用治疗有效量的结合人pd-l1的融合蛋白。在一些实施方案中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的融合蛋白。在一些实施方案中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包括向对象施用治疗有效量的编码融合蛋白的多核苷酸，其中所述编码融合蛋白的多核苷酸在患者体内表达时产生包含pd-l1结合性多肽的重组融合蛋白。
[0279]
在一些实施方案中，肿瘤表达或过表达肿瘤抗原，该肿瘤抗原被融合蛋白中提供的另外的结合实体以及pd-l1结合性多肽所靶向。
[0280]
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的融合蛋白。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象患有肿瘤，或者对象患
有的肿瘤被切除。
[0281]
在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤选自结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝脏肿瘤、乳腺肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤和头颈部肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是结肠直肠肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是肺肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是胰腺肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是黑色素瘤。在一些实施方案中，肿瘤是膀胱肿瘤。
[0282]
为了进一步说明，融合蛋白可用于治疗患有癌症的患者，所述癌症例如骨肉瘤、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、肾母细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如小细胞或非小细胞肺癌)、胃癌、结肠直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚叶肿瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性肌纤维化(idiopathic myelfibrosis)、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌或肝癌、乳腺癌或胃癌。在本公开内容的一些实施方案中，癌症是转移性癌症，例如，上述种类的转移性癌症。
[0283]
在一些实施方案中，癌症是血液学癌症。在一些实施方案中，癌症选自：急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，aml)、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、t细胞急性淋巴细胞白血病(t-cell acute lymphoblastic leukemia，t-all)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，cll)、毛细胞白血病、慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，cml)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤(diffuse large b-cell lymphoma，dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，mcl)和皮肤t细胞淋巴瘤(cutaneous t-cell lymphoma，ctcl)。
[0284]
本公开内容还提供了包含本文中所述融合蛋白和可药用载体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可用于免疫治疗。在一些实施方案中，药物组合物可用于免疫肿瘤学。在一些实施方案中，该组合物可用于抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，药物组合物可用于抑制对象(例如，人患者)中的肿瘤生长。在一些实施方案中，该组合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，药物组合物可用于治疗对象(例如，人患者)的癌症。
[0285]
通过将本公开内容的经纯化融合蛋白与可药用载剂(例如，载体或赋形剂)组合，来制备用于储存和使用的制剂。本领域技术人员通常认为可药用载体、赋形剂和/或稳定剂是制剂或药物组合物的非活性成分。
[0286]
在一些实施方案中，本文中所述的融合蛋白被冻干和/或以冻干形式储存。在一些实施方案中，对包含本文中所述的融合蛋白的制剂进行冻干。
[0287]
合适的可药用载剂包括但不限于无毒缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲铵氯化物、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如，少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合
物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物，例如锌-蛋白质络合物；和非离子表面活性剂例如吐温或聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)。(remington：the science and practice of pharmacy，22nd edition，2012，pharmaceutical press，london.)。
[0288]
本公开内容的药物组合物可以以任何方式施用，用于局部或全身治疗。施用可以通过表皮或透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷剂、液体剂和粉末剂进行表面施用；通过吸入或吹入粉末剂或气雾剂(包括通过雾化器、气管内和鼻内)肺施用；经口施用；或肠胃外施用，包括静脉内、动脉内、瘤内、皮下、腹膜内、肌内(例如注射或输注)或颅内(例如鞘内或室内)施用。
[0289]
治疗制剂可以是以单位剂型。这样的制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、在水或非水性介质中的溶液剂或混悬剂，或者栓剂。在固体组合物例如片剂中，主要活性成分与药用载体混合。常规的压片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及稀释剂(例如，水)。这些可用于形成包含本公开内容化合物或其无毒可药用盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。然后将该固体预制剂组合物细分成上述类型的单位剂型。可将制剂或组合物的片剂、丸剂进行包衣或以其他方式进行复配以提供具有延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含被外部组分覆盖的内部组合物。此外，所述两种组分可由肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗崩解并允许内部组分完整地通过胃或延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这样的材料包括多种聚合物酸和聚合物酸与例如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的这样的材料的混合物。
[0290]
本文中所述的融合蛋白也可以包埋在微胶囊中。这样的微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒和纳米胶囊)或在粗乳剂中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊，如在the science and practice of pharmacy，22.sup.nd edition，2012，pharmaceutical press，london中所述。
[0291]
在一些实施方案中，药物制剂包括与脂质体复合的本公开内容的融合蛋白。产生脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可通过用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-derivatized phosphatidylethanolamine，peg-pe)的脂质组合物进行逆相蒸发来产生。脂质体可以通过规定孔径的过滤器挤出，以产生具有期望直径的脂质体。
[0292]
在一些实施方案中，可以产生包含本文中所述融合蛋白的持续释放制剂。合适的持续释放制剂实例包括包含黏合素剂的固体疏水聚合物的半透性基质，其中所述基质为成形制品的形式(例如，膜剂或微胶囊剂)。缓释基质的一些实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯、l-谷氨酸和7-乙基-l-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如lupron depottm(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。
[0293]
对于疾病的治疗，本公开内容的融合蛋白的合适剂量取决于待治疗疾病的类型、
疾病的严重程度和病程、疾病的响应性、施用融合蛋白是出于治疗还是预防目的、先前治疗、患者的临床病史等，所有这些均由治疗医生判定。可将融合蛋白一次，或在持续数天至数月的一系列治疗中，或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻(例如，肿瘤尺寸减小)为止施用。最佳给药方案可以通过测量患者体内的药物累积来计算，并且将根据单个药剂的相对效力而变化。施用医师可以确定最佳剂量、给药方法和重复率。在一些实施方案中，剂量为0.01μg至100mg/kg体重、0.1μg至100mg/kg体重、1μg至100mg/kg体重、1mg至100mg/kg体重、1mg至80mg/kg体重、10mg至100mg/kg体重、10mg至75mg/kg体重或10mg至50mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约0.1mg至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约0.1mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约0.25mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约0.5mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约1mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约1.5mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约2mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约2.5mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约5mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约7.5mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约10mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约12.5mg/kg体重。在一些实施方案中，融合蛋白的剂量为约15mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量可以每天、每周、每月或每年给予一次或更多次。在一些实施方案中，每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次给予融合蛋白。
[0294]
在一些实施方案中，融合蛋白可以以较高的初始“负荷”剂量施用，随后是一个或更多个较低的剂量。在一些实施方案中，施用频率也可以改变。在一些实施方案中，给药方案可包含施用初始剂量，随后每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次的另外剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可以包括施用初始负荷剂量，随后是例如初始剂量一半的每周维持剂量。或者给药方案可以包括施用初始负荷剂量，随后每隔一周施用例如初始剂量一半的维持剂量。或者给药方案可以包括施用三个初始剂量持续3周，随后施用例如每隔一周相同量的维持剂量。
[0295]
如本领域技术人员所知，任何治疗剂的施用都可能导致副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性非常严重，以至于不能以治疗有效剂量施用特定的药物。在一些情况下，必须停止药物治疗，并尝试其他药剂。然而，相同治疗类别中的许多药剂通常表现出相似的副作用和/或毒性，这意味着患者要么不得不停止治疗，要么如果可能的话，遭受与治疗药剂相关的令人不快的副作用。
[0296]
在一些实施方案中，给药方案可以限于特定的施用次数或“周期”。在一些实施方案中，融合蛋白被施用3、4、5、6、7、8或更多个周期。例如，融合蛋白每2周施用6个周期、融合蛋白每3周施用6个周期、融合蛋白每2周施用4个周期、融合蛋白每3周施用4个周期，等等。本领域技术人员可以决定并随后修改给药方案。
[0297]
因此，本公开内容提供了向对象施用本文中所述的多肽或药剂的方法，其包括使用用于施用一种或更多种药剂的间歇给药策略，这可降低与融合蛋白、化学治疗剂等的施用相关的副作用和/或毒性。在一些实施方案中，用于在人对象中治疗癌症的方法包括向对象施用与治疗有效剂量的化学治疗剂组合的治疗有效剂量的融合蛋白，其中根据间歇给药策略施用一种或两种药剂。在一些实施方案中，所述间歇给药策略包括向对象施用初始剂量的融合蛋白，以及约每2周一次施用后续剂量的融合蛋白。在一些实施方案中，所述间歇
brasiliensis)
[0302]
多核苷酸
[0303]
多核苷酸(也称为核酸)是任意长度的核苷酸的聚合物，并且可包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基、和/或者它们的类似物，或者可以通过dna或rna聚合酶并入聚合物的任何底物。在一些实施方案中，本文中的多核苷酸编码多肽，例如包含hsa结合性多肽和pd-l1结合性多肽的融合蛋白。如在本领域已知的，多核苷酸中脱氧核糖核苷酸的顺序决定了氨基酸沿着编码的多肽(例如，蛋白质)的顺序。
[0304]
多核苷酸序列可以是脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的任何序列，可以是单链、双链或部分双链的。多核苷酸的长度可以变化，并且没有限制。因此，多核苷酸可包含例如2至1,000,000个核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸的长度为100至100,000、100至10,000、100至1,000、100至500、200至100,000、200至10,000、200至1,000或200至500个核苷酸。
[0305]
本文中的载体是指用于将分子递送至细胞的载剂。在一些实施方案中，载体是包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作连接的启动子(例如，诱导型或组成型)的表达载体。载体的非限制性实例包括病毒载体(例如腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体)、裸dna或rna表达载体、质粒、黏粒、噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的dna和/或rna表达载体，以及包封在脂质体中的dna和/或rna表达载体。载体可以例如，使用任何转染方法(包括，例如，磷酸钙-dna共沉淀、deae-右旋糖酐介导的转染、凝聚胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染或基因枪技术(基因枪法(biolistics)))转染到细胞中。
[0306]
实施例
[0307]
实施例1.人血清白蛋白(hsa)和小鼠血清白蛋白(msa)结合物的选择
[0308]
使用从约6
×
10
10
多样性大小的文库中添加的约1
×
10
12
个噬菌体，从多肽文库中进行hsa或msa结合性噬菌体的选择。
[0309]
通过从噬菌体展示文库进行选择来鉴定本公开内容的hsa结合性肽，所述文库包含展示在基于sqt序列的恒定构架主链中长度为9个氨基酸的随机环序列。将噬菌体的混悬液与靶抗原(在链霉亲和素珠上捕获的生物素化抗原或在板上捕获的未生物素化抗原)一起孵育。然后洗去未结合的噬菌体，并随后，通过在低ph下孵育抗原，然后在高ph下孵育来洗掉未结合的噬菌体。然后，用释放的、ph中和的噬菌体感染大肠杆菌，并获得第一轮噬菌体的制备物。重复该循环两到三次。为了富集靶向噬菌体，在后面几轮选择中增加严格条件。增加的严格条件包括增加洗涤步骤的数目、降低抗原浓度和/或用封闭的链霉亲和素珠或包被有封闭试剂的孔进行预选。
[0310]
本文中用于噬菌体选择的抗原是hsa(sigma；a3782)和msa(alpha diagnostics；alb13-n-25)。使用ez link sulfo-nhs-lc生物素试剂盒(pierce)在内部进行抗原生物素化。
[0311]
通过连续几轮噬菌体扩增进行选择后，通过如下所述的噬菌体elisa鉴定hsa和msa结合性克隆。噬菌体选择后，将包含噬菌粒载体的单个细菌克隆从滴定板移至96孔细胞
培养形式中。在辅助噬菌体拯救和过夜生长后，将展示与基因-iii次要外壳蛋白融合的hsa多肽的重组噬菌体颗粒释放到培养物上清液中。随后通过elisa筛选上清液中包含的噬菌体与抗原的结合。用hrp缀合的抗m13单克隆抗体(ge healthcare)检测与固定在板上的抗原结合的噬菌体展示蛋白，并使用一步超tmb-elisa底物(thermo scientific)对elisa进行显影。
[0312]
实施例2.大肠杆菌蛋白产生
[0313]
所有在大肠杆菌中表达的多肽都已克隆有c端六组氨酸标签(hhhhhh；seq id no：292)以简化用固定化金属亲和色谱树脂(imac树脂)的蛋白质纯化。当需要时，可以在蛋白和his标签之间添加另外的肽序列，例如myc(eqkliseedl；seq id no：295)以用于检测，或者tev蛋白酶切割位点(enlyfq(g/s)；seq id no：296)以允许去除标签。蛋白从大肠杆菌中表达，并使用imac、iex和sec纯化。使用制造商的方案，通过将表达质粒pd861(atum)转化到bl21大肠杆菌细胞(millipore)中来进行从大肠杆菌中纯化单体。将全部转化的细胞混合物铺板在包含50μg/ml卡那霉素(applichem)的lb琼脂平板上，并在37℃下孵育过夜。第二天，将转化的大肠杆菌菌苔(lawn)转移到含有1
×
terrific肉汤培养基(melford)和50μg/ml卡那霉素的无菌烧瓶中，并在30℃以250rpm振荡进行培养。一旦细胞达到约0.8至1.0的光密度od
600
，就用10mm鼠李糖(alfa aesar)诱导表达。然后将培养物在37℃下再培养5小时。通过离心和溶解所得细胞沉淀来收获细胞。使用his标记的蛋白质的分批结合亲和纯化来进行蛋白纯化。具体地，使用镍琼脂糖亲和树脂(super-ninta500；generon)。用npi20缓冲液(50mm磷酸钠，0.5m nacl，20mm咪唑)洗涤树脂，并用5倍柱体积(column volume，cv)的npi400缓冲液洗脱结合的蛋白质。然后使用cm ff离子交换柱(exchange column，ge)在运行缓冲液中通过阳离子交换纯化洗脱的蛋白质，对于克隆hsa-31，运行缓冲液为ph 5.2的20mm乙酸钠，以及对于克隆hsa-41，运行缓冲液为ph 6.0的25mm mes。两种蛋白质纯化都还包括0.1％triton 114x(sigma)洗涤步骤，并用1m nacl线性梯度洗脱蛋白质。在使用在pbs1
×
缓冲液中运行的hiload 26/600 superdex 75pg(ge healthcare)进行的制备型sec上进行第三阶段纯化。使用pbs 1
×
的流动相，使用具有acclaim sec-300柱(thermo)的sec-hplc分析克隆hsa-41和hsa-31的表达和纯度。使用nanodrop(thermo)a280读数估计蛋白质产量，并且最终产物在200伏下在novex
tm 20
×
bolt
tm mes sds运行缓冲液(thermo)中的sds-page bolt bis tris plus 4至12％凝胶(thermo)上运行，样品在还原缓冲液中加热。凝胶上的蛋白质条带用quick commassie(generon)染色。将经pageruler预染色蛋白质分子量标志物(thermo)在凝胶上运行，以估计三阶段纯化后融合蛋白的分子量。
[0314]
实施例3.血清白蛋白结合性蛋白的表征
[0315]
在ph 6.0和ph 7.4下，通过生物层干涉测量法(octet)评估了蛋白对人、小鼠和食蟹猴的血清的亲和力。。在ph 6.0或7.4下，经生物素化的抗原以1μg/ml被捕获到sa传感器上在包含pbs-t(0.01％吐温20)+1％酪蛋白的缓冲液中，持续600秒。进行300秒的缔合和600秒的解离，并使用ph 1.5的10mm甘氨酸(ge healthcare)进行再生持续3
×
5秒。所有步骤都在1000rpm和25℃下进行。在约10
×
kd值的起始浓度下分析两倍连续稀释的经纯化蛋白。使用octet数据分析软件进行动力学分析，减去参考传感器(负
载有抗原)，将y轴与基线对齐，并使用步间校正以将缔合与解离对齐。应用savitzky-golay滤波并处理数据。进行数据分析，其采用1∶1模型，全局拟合，r
最大
不与传感器相关联。
[0316]
实施例4.pd-l1结合性蛋白半衰期延长的内联融合(ilf)二聚体
[0317]
三(3)种pd-l1结合性蛋白ava04-236(seq id no：277和278)、ava04-261(seq id no：279和280)和ava04-269(seq id no：281和282)的半衰期通过在n端或c端与ava-41进行遗传融合而延长。使用刚性(a((eaaak)6(seq id no：294))或柔性((g4s)6(seq id no：293)重复遗传接头形成为二聚体遗传融合体的半衰期延长的pd-l1蛋白的示意图在图1a中提供。下表8提供了ilf取向和命名的表。表7示出了在pd-l1结合性蛋白的情况下的半衰期延长内联融合的实例。
[0318]
使用三个阶段纯化从大肠杆菌中产生的ilf二聚体：亲和捕获、iex和制备型sec。使用sec-hplc评估最终的ilf蛋白纯度，并显示为＞95％纯(图1b)。biacore动力学分析显示遗传融合的两种蛋白都能够与靶抗原即人pd-l1-fc(r&d system)和hsa(sigma)接合(表9)。为了分析pd-l1-fc结合动力学，使用运行缓冲液hbs-ep+和系列s传感器cm5(ge healthcare)芯片fc2进行biacore t200动力学分析，所述芯片使用胺偶联剂(ge healthcare)固定有在ph 4.0的10mm乙酸钠中的pd-l1-fc(r&d system)。将ilf蛋白的浓度滴定作为分析物在30μl/分钟的流量下运行。再生的pd-l1-fc以20μl/分钟的流量用3mm naoh(ge healthcare)固定在表面上20秒。减去fc2-1数据空白并将其拟合至1∶1朗缪尔结合模型(biacore评价软件；ge)以计算表观kd值。
[0319]
表8.半衰期延长的pd-l1(ava04)结合性ilf蛋白与hsa结合性蛋白的命名
[0320][0321]
表9.蛋白的biacore
tm
动力学分析
[0322][0323]
实施例5.pd-l1结合性二聚体半衰期延长的内联融合三聚体
[0324]
图2示出了pd-l1结合性二聚体的示意图，所述二聚体用刚性接头(eaaak)6(seq id no：294)与hsa-41遗传融合。使用通过亲和捕获、iex和制备型sec纯化的蛋白质，在大肠杆菌中进行ilf产生。使用sds-page和sec-hplc评估蛋白质纯度。发现蛋白为99.8％至100％纯(图3)。biacore动力学分析显示，经遗传融合的二聚体能够与它们的两种靶蛋白接合(图4a)。发现ava04蛋白与pd-l1和hsa-41结合并与hsa接合。进行biacore分析以分析hsa结合，以及如实施例8所述分析pd-l1-fc结合(表10)。
[0325]
为了评价在affimer内联融合形式的不同位置添加hsa-41是否影响ava04-251与人pd-l1的结合，用三(3)种ilf形式的蛋白进行pd-l1结合elisa(图5)。简言之，人pd-l1-fc(r&d system)嵌合蛋白在碳酸盐缓冲液中以0.5mg/ml包被在96孔板中。用5％酪蛋白/pbs缓冲液进行饱和之后，洗涤板，并将对照或蛋白的稀释物孵育90分钟。然后洗涤板，并添加经生物素化的多克隆抗体抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂a(r&d system)持续1小时。洗涤板，并使用链霉亲和素-hrp检测蛋白。在最后的洗涤步骤后，添加tmb进行实验的显影，并在450nm处读取板。测试的三(3)个构建体表现出相似的ec
50
(范围从0.03至0.1nm)，并且与抗pd-l1亲本ilf二聚体分子(ava04-251 bh)相同。当进行半衰期延长的蛋白与亲本分子相比较的pd-1/pd-l1阻断生物测定(promega)时，证实了这一点(图6)。根据制造商说明书一式两份运行pd-1/pd-l1阻断生物测定(promega)，并显示测试的三(3)个构建体具有相似的ec
50
值(在2倍差异内)，并且与亲本二聚体分子(ava04-251 bh)相同。
[0326]
类似地，在ph 7.4下，使用elisa评估三(3)种半衰期延长的构建体与人血清白蛋白的结合。简言之，在ph 7.5下，以1mg/ml的浓度将hsa包被在96孔板中。在用ph 7.5的5％pbs酪蛋白饱和后，洗涤板，并将对照或蛋白的稀释物孵育90分钟。然后洗涤板，并添加经生物素化的多克隆抗体抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂a(r&d system)1小时。洗涤板，并使用链霉亲和素-hrp检测蛋白。在最后的洗涤步骤后，添加tmb进行实验的显影，并在450nm处读取板。所测试的三(3)个构建体表现出相似的ec
50
(范围为0.03至0.06nm)并且与亲本分子(hsa-41)相同(图7)。
[0327]
表10.蛋白的biacore
tm
动力学分析(pd-l1-fc，hsa)
[0328][0329]
实施例6.半衰期延长的ilf三聚体的混合淋巴细胞反应
[0330]
在混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，mlr)测定中测试了ava04-251 xt内联融合形式的蛋白(图8)。简言之，从培养七(7)天的cd14
+
单核细胞制备衍生自单核细胞的树突细胞(dendritic cell，dc)。在第7天使用未成熟的dc，并将其与同种异体t细胞(负分离(negative isolation))和参考物质或载剂对照(rpmi-10培养基)一起培养。将细胞培养4天，并在培养期结束时通过elisa测量上清液中的ifnγ。数据以平均值+/-标准差pg/ml表示，或归一化为载剂对照(n＝6)。虚线表示平均载剂(rpmi-10)值。发现半衰期形式的ava04-251 xt14提高了ifnγ的水平，类似于其对照(非半衰期延长的)(图8)。
[0331]
实施例7.pd-l1结合性半衰期延长的内联融合蛋白在小鼠体内的药代动力学谱
[0332]
在c57/bl6小鼠的药代动力学研究中测试了半衰期延长的ilf ava04-251三聚体。如图9所述，以10mg/kg的剂量静脉内注射(intravenously，iv)小鼠。使用六只小鼠，并在九个时间点(0、0.25、6、24、72、120、168和336小时)收集血清。合并每个时间点的血清样品，并使用注射的经纯化分子作为参考标准品，通过夹心elisa进行分析。结果以15分钟时初始剂量的百分比表示。没有半衰期延长的(ava04-251 bh)具有快速清除(t
1/2
3.2小时)，而ilf ava04-251 xt形式均显示半衰期延长，估计在β相(23.8至24.2小时)。
[0333]
实施例8.ilf三聚体的小鼠异种移植物模型测试
[0334]
从一名健康供体中分离出pbmc。分离总t细胞，并将其在补充有il-2的完全培养基中针对a375细胞扩增两轮，持续7至10天。在小鼠(n＝10)的右胁腹区域皮下接种a375肿瘤细胞和经活化的t细胞(在pbs中0.2ml)用于肿瘤发展。细胞接种之后一小时开始处理。每周两(2)次，持续三(3)周施用ava04-251 xt14(seq id no：283)纯化蛋白。总的来说，在随机化之后第13天，与对照组相比，两种治疗均显示出肿瘤生长抑制。与被给予非结合性sqt gly xt28(seq id no：288)的对照组相比，用ava04-251 xt14(seq id no：283)处理的小鼠中超过70％的小鼠具有减小的肿瘤尺寸(图10a至10c)。
[0335]
实施例9.ava04半衰期延长的ilf三聚体c端cys蛋白表达
[0336]
通过快速变化诱变(agilent)合成半衰期延长三聚体，以在c端6
×
his标签后进一
步包含c端半胱氨酸，从而产生ava04-251 xt14 cys(seq id no：126)。从大肠杆菌中产生蛋白，并用亲和、iex和制备型尺寸排阻纯化。用2mm tcep在还原条件下表征经纯化的蛋白质，其显示最终蛋白质的纯度＞97％(图11)。因此，可以利用游离半胱氨酸产生ilf蛋白，随后使用马来酰亚胺化学反应进行缀合，以使得能够产生蛋白-药物缀合物。
[0337]
实施例10.抗小鼠pd-l1结合物半衰期延长的内联融合三聚体
[0338]
ava04-182 xt20半衰期延长的ilf三聚体由大肠杆菌产生。sds-page和sec-hplc分析如实施例2中所述运行，并显示出最终蛋白质纯度＞98％(图12a)。经纯化的蛋白在biacore上运行，以评估其与小鼠pd-l1-fc标记的重组抗原(r&d system)的亲和力。使用蛋白a芯片(ge healthcare)捕获抗原，并使用从1nm的最大浓度开始滴定的单循环动力学将形式作为分析物运行，并使用ph 1.5的10mm甘氨酸(ge healthcare)再生。减去fc2-1动力学数据空白，并将其拟合至1：1朗缪尔结合模型(biacore评价软件；ge healthcare)以计算出90.6pm的kd值，证实以这种形式添加半衰期延长的蛋白不影响ava04-182与小鼠pd-l1靶抗原的结合(图12b)。
[0339]
在elisa中评价ava04-182 xt20 ilf在ph 7.4和ph 6.0与hsa结合的能力(如实施例4中所述)。图13a和13b显示出ava04-182 xt20保留了hsa-41与msa结合的能力。另外，为了评价半衰期延长的蛋白是否是功能性的，进行了竞争性elisa(mpd-1/mpd-l1)。简言之，将pd-1在碳酸盐缓冲液中以1μg/ml的浓度在板上包被过夜。然后使用5％酪蛋白/pbs缓冲液使板饱和。同时，mpd-l1与半衰期延长的蛋白的稀释物及其对照一起预孵育。饱和之后，将混合物添加到板，并孵育90分钟。然后洗涤板，并添加检测用多克隆抗体，经生物素化的抗pd-l1。洗涤板之后，添加链霉亲和素-hrp持续30分钟。在最后的洗涤之后，使用tmb(pierce)进行反应的显影，并使用读板仪在450nm下读取板(图13c)。该图显示出半衰期延长的蛋白与其亲本分子具有相似的中和能力。
[0340]
作为概念的证明，在小鼠中进行了药代动力学研究。每组12只动物腹膜内(intraperiotneally，ip)注射有25mg/kg的蛋白，并且每个时间点使用三只动物。在八(8)个时间点，抽取血清，直到注射之后336小时。使用elisa分析合并的血清，以量化血清中蛋白的水平。在这项研究中，半衰期延长的蛋白的药代动力学谱显示半衰期为约17小时(图14)。
[0341]
实施例11：ava 04-251 bh-800cw在a375小鼠异种移植物模型中的生物分布
[0342]
在小鼠异种移植物模型中评估了抗pd-l1蛋白是否靶向表达人pd-l1的肿瘤，其中使用荧光成像来检查ir染料缀合的蛋白随时间的生物分布。ava04-251 bh cys和ava04-251xt14 cys与irdye 800cw(li-cor)利用马来酰亚胺化学反应进行缀合，以修饰蛋白质上可接近的氨基。将蛋白在50mm mes ph 6、150mm nacl、1mm tcep中稀释至1mg/ml，并与irdye 800cw(4mg/ml在水中)在室温(约23℃)下在黑暗条件中以染料∶蛋白质9∶1的化学计量比孵育2小时。根据制造商的说明使用5ml zeba spin脱盐柱(mwco 7000；pierce)相对于染料缀合的蛋白而分离出游离染料。基于280和780nm处的吸光度，按照下式计算染料∶蛋白质的比例：
[0343]
染料∶蛋白质比例＝(a780/ε染料/(a280-(0.03
×
a780))/ε蛋白质，
[0344]
其中0.03是irdye 800cw在280nm处吸光度的校正因子，以及ε染料和ε蛋白质分别
是染料和蛋白质的摩尔消光系数，即染料270,000m-1
cm-1
和蛋白质39871m-1
cm-1
(对于ava04-251 bh cys)和37626m-1
cm-1
(对于ava04-251 xt14 cys)。图15a至15c示出了使用sec-hplc和sds-page分析方法的缀合材料的形式示意图和纯度。
[0345]
使用pd-l1结合elisa将染料缀合的ava04-251 bh-800或ava04-251 xt14-800与重组人pd-l1的结合与未缀合的蛋白进行比较。
[0346]
简言之，将人pd-l1 fc(r&d system)嵌合蛋白以0.5μg/ml包被在96孔板中的碳酸盐缓冲液中。用5％酪蛋白/pbs缓冲液饱和之后，洗涤板，并将未缀合对照或缀合蛋白的稀释物孵育90分钟。然后洗涤板，添加经生物素化的多克隆抗体抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂a(r&d system)，并将板孵育1小时。洗涤板，并使用链霉亲和素-hrp检测结合的蛋白。在最后的洗涤步骤之后，添加tmb，并在450nm处读取板。缀合的蛋白表现出与亲本分子相似的ec
50
。因此，基于可比较的结合曲线，数据表明染料缀合不影响两种缀合形式分子对pd-l1靶标的亲和力(图16a至16b)。
[0347]
在将a375细胞(100μl无菌pbs中的5
×
106个细胞[atcc])皮下注射到雌性无胸腺裸鼠(charles river laboratories)的胁部后，在动物中建立a375小鼠异种移植物模型。每周监测肿瘤三(3)次，用卡尺测量发展中的肿瘤。在将ava04-251 bq-800和bh-800(1纳摩)静脉内注射到三(3)只小鼠的尾静脉中之前，允许肿瘤生长到500至1000mm3。紧接在注射之后(时间0)和给药之后1、2、4、8、24和48小时时用xenogen ivis 200生物光子成像仪记录荧光图像。在四(4)小时时间点，检测到针对肿瘤的半衰期延长的抗pd-l1蛋白的靶向性。数据在图17中显示，以及箭头表示肿瘤的大致位置。
[0348]
实施例12：用hsa-18半衰期延长多肽格式化的ava04-251 xt ilf
[0349]
设计了两种三聚体内联融合(ilf)形式。每个均包含两个融合的ava04-251人pd-l1结合性多肽，其还与hsa多肽(hsa-18)融合以延长半衰期。ava04-251 xt60(seq id no：290)包含定位于c端的半衰期延长蛋白，而ava04-251 xt61(seq id no.291)包含位于该形式的中部的半衰期延长多肽，从而将两种抗pd-l1多肽分开(示意图，图18)。用多肽之间的重复刚性遗传接头a(eaaak)6(seq id no：294)设计形式。如实施例2中所述，从大肠杆菌产生三聚体，并将其用亲和ninta树脂随后进行制备型尺寸排阻来纯化。还原型sds-page和sec-hplc分析显示该蛋白质形式的最终纯度＞98％(图18)。
[0350]
实施例13：半衰期延长的ava04-251 xt60和ava04-251 xt61 ilf形式与血清白蛋白的结合
[0351]
使用前述实施例3中的方法，用ph 6.0和ph 7.4的运行缓冲液来进行人血清白蛋白(hsa)biacore动力学分析。数据显示包含半衰期延长的hsa多肽(hsa-18)的ilf形式结合hsa，在ph 7.4下kd具有三位数nm亲和力，以及在ph 6.0下具有两位数nm亲和力，在109至152nm的hsa-18单体亲和力的2至4倍之间(图19a至19b)。对于ph 6.0条件下的小鼠血清白蛋白(mouse serum albumin，msa)，ilf形式的结合亲和力在结合性蛋白的单体血清白蛋白的大约2倍之内(图21)。
[0352]
实施例14：与血清白蛋白结合的半衰期延长的ava04-251 xt60和ava04-251 xt61 ilf形式
[0353]
用elisa评估了两种半衰期延长的ilf形式(ava04-251 xt60，seq id no：290；ava04-251 xt61，seq id no：291)在ph 7.4与人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白的结合。简言之，在ph 7.5下，将hsa或msa以1mg/ml的浓度包被在96孔板中。用ph 7.5的5％pbs酪蛋白饱和之后，洗涤板，并将对照或三聚体的稀释物在板上孵育90分钟。然后洗涤板，并添加经生物素化的多克隆抗体抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂a(r&d system)持续1小时。洗涤板，并使用链霉亲和素-hrp检测affimer ilf。在最后的洗涤步骤之后，添加tmb进行实验的显影，并在450nm处读取板。所测试的两种ilf，即ava04-251 xt60和ava04-251 xt61，对hsa(范围从5.7至8.8)和msa(范围从133.6至60.8)二者表现出相似的ec
50
值(图20)。
[0354]
实施例15：与人pd-l1-fc结合的ava04-251 xt60和ava04-251 xt61ilf形式
[0355]
如实施例3中所述，用单循环动力学进行biacore动力学分析，以评估ava04-251 xt60和ava04-251 xt61(分别为seq id no：290和291)的结合。进行实验以比较三聚体和hsa-41。结合亲和力kd值在三位数nm范围内，观察到相似的开和关速率，不管半衰期延长蛋白是在形式的中部还是c端(图22)。

技术特征：
1.融合蛋白，其包含stefin多肽的人血清白蛋白(hsa)结合性重组改造变体和pd-l1结合性多肽，其中所述hsa结合性多肽在ph 6.0以1
×
10-6
m或更小的k
d
与hsa结合，并且任选地在ph 7.4与hsa结合的k
d
比在ph 6.0结合的k
d
大至少半个对数，并且其中所述pd-l1结合性多肽以1
×
10-6
m的k
d
与pd-l1结合。2.融合蛋白，其包含与hsa结合的stefin多肽的hsa结合性重组改造变体和与pd-l1结合的stefin多肽的pd-l1结合性重组改造变体，其中所述蛋白质在人对象中的循环半衰期为至少7天。3.权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述hsa结合性多肽包含选自seq id no：86至138中任一个的环2序列和/或选自seq id no：139至191中任一个的环4序列。4.权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述pd-l1结合性多肽包含选自seq id no：16至50中任一个的环2序列和/或选自seq id no：51至85中任一个的环4序列。5.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：277的氨基酸序列，或者与seq id no：277的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。6.权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：278的氨基酸序列，或者与seq id no：278的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。7.权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：279的氨基酸序列，或者与seq id no：279的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。8.权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：280的氨基酸序列，或者与seq id no：280的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。9.权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：281的氨基酸序列，或者与seq id no：281的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。10.权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：282的氨基酸序列，或者与seq id no：282的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。11.权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白还包含第二pd-l1结合性多肽，其中所述第二pd-l1结合性多肽以1
×
10-6
m的k
d
与pd-l1结合。12.内联融合蛋白，其包含stefin的人血清白蛋白(hsa)结合性重组改造变体、第一pd-l1结合性多肽和第二pd-l1结合性多肽，其中所述hsa结合性多肽在ph 6.0以1
×
10-6
m或更小的k
d
与hsa结合，并且任选地在ph 7.4与hsa结合的k
d
比在ph 6.0结合的k
d
大至少半个对数，并且其中所述第一pd-l1结合性多肽和所述第二pd-l1结合性多肽以1
×
10-6
m的k
d
与pd-l1结合。13.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其还包含接头。14.权利要求13所述的融合蛋白，其中所述接头是刚性接头或柔性接头。15.权利要求14所述的融合蛋白，其中所述刚性接头包含seq id no：294的序列，或所
述柔性接头包含seq id no：293的序列。16.权利要求13至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：283的氨基酸序列，或者与seq id no：283的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。17.权利要求13至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：284的氨基酸序列，或者与seq id no：284的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。18.权利要求13至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：285的氨基酸序列，或者与seq id no：285的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。19.权利要求13至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：286的氨基酸序列，或者与seq id no：286的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。20.权利要求13至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：287的氨基酸序列，或者与seq id no：287的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。21.权利要求13至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：290的氨基酸序列，或者与seq id no：290的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。22.权利要求13至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no：291的氨基酸序列，或者与seq id no：291的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。23.权利要求16至22中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含柔性接头，任选地其中所述柔性接头包含seq id no：293的序列。24.适合于在人对象中的治疗用途的药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的任何融合蛋白，以及可药用赋形剂。25.多核苷酸，其包含编码权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白的序列。26.权利要求25所述的多核苷酸，其中所述编码所述融合蛋白的序列与转录调节序列可操作地连接。27.病毒载体，其包含权利要求25或26所述的多核苷酸。28.质粒或微环，其包含权利要求25或26中任一项所述的多核苷酸。29.细胞，其包含权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白、权利要求25或26所述的多核苷酸、权利要求27所述的病毒载体或者权利要求28所述的质粒或微环。30.权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白，其用于治疗感染性疾病的方法中。31.权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白，其用于治疗癌症的方法中。32.权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白，其还包含一个或更多个另外的多肽序列，所述另外的多肽序列可赋予所述融合蛋白以另外的治疗活性和/或另外的pk/adme特性。33.权利要求32所述的融合蛋白，其中所述另外的多肽序列是受体配体。
34.权利要求33所述的融合蛋白，其中所述受体配体是免疫刺激性细胞因子，例如ifn-α、il-2、il-15、il-21和il-12，或其变体序列。35.权利要求33所述的融合蛋白，其中所述另外的多肽序列是突变体il-2多肽，所述突变体il-2多肽包含seq id no：1282的氨基酸序列，或与seq id no：1282的氨基酸序列具有至少70％同一性的序列，所述序列具有相对于seq id no：1282的一个或更多个氨基酸替换，与野生型il-2多肽相比，所述替换消除或降低了所述突变体il-2多肽与高亲和力il-2受体的亲和力，并保留了所述突变体il-2多肽与中等亲和力il-2受体的亲和力。36.权利要求35所述的融合蛋白，其中所述另外的多肽序列是突变体il-2多肽，所述突变体il-2多肽包含seq id no：1282的氨基酸序列但具有在选自以下的位置处的一个或更多个氨基酸替换：t3(例如t3a)、d20(例如d20t)、r38(例如r38a和r38d)、f42(例如f42a、f42g、f42s、f42t、f42q、f42e、f42n、f42d、f42r或f42k)、k43(例如k43e)、e61(例如e61r)、e62(例如e62a)、y45(例如y45a、y45g、y45s、y45t、y45q、y45e、y45n、y45d、y45r或y45k)和/或l72(例如l72g、l72a、l72s、l72t、l72q、l72e、l72n、l72d、l72r或l72k)。37.权利要求33所述的融合蛋白，其中所述受体配体针对共刺激受体，并且所述融合蛋白在结合时激动所述共刺激受体。38.权利要求37所述的融合蛋白，其中所述受体配体选自cd40l、cdb7.1、4-1bbl、ox40l、gitrl或light。39.权利要求33所述的融合蛋白，其还包含诱导所述融合蛋白的二聚化或更高级多聚化的多肽序列。40.权利要求33所述的融合蛋白，其中所述另外的多肽序列是cd3结合性多肽序列，所述cd3结合性多肽序列指导所述融合蛋白与t细胞表面上的cd3结合。

技术总结
本文在一些实施方案中提供了融合蛋白，其包含stefin多肽(多肽)的与PD-L1结合的重组改造变体和与人血清白蛋白(HSA)结合的多肽。在一些实施方案中，本文中还提供了包含所述融合蛋白的组合物、使用所述融合蛋白的方法和产生所述融合蛋白的方法。白的方法和产生所述融合蛋白的方法。白的方法和产生所述融合蛋白的方法。


技术研发人员：艾玛
受保护的技术使用者：阿瓦克塔生命科学有限公司
技术研发日：2021.07.30
技术公布日：2023/8/1