用于控制内体Toll样受体的新型小分子化合物和使用其的自身免疫性疾病治疗剂的制作方法

用于控制内体toll样受体的新型小分子化合物和使用其的自身免疫性疾病治疗剂
技术领域
1.本发明涉及针对内体toll样受体(tlr)具有抑制活性的拮抗性小分子化合物，并且更特别地涉及抑制toll样受体3/7/8/9的信号传导途径的小分子化合物、用于抑制toll样受体的包含所述小分子化合物的组合物、以及用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的包含所述小分子化合物的组合物。


背景技术：

2.先天(或先天性)免疫是哺乳动物免疫系统中针对细菌感染的第一道防线，并且在模式识别受体(如toll样受体(tlr))识别病原体相关分子模式(pamp)或损伤相关分子模式(damp)时被激活。例子包括由tlr1/2识别的三酰基脂蛋白(例如，pam3csk4)(takeuchi,o.等人,j.immunol.169:10-14(2002))、由tlr2/6识别的二酰基脂蛋白(例如，pam2csk4)(takeuchi,o.等人,int.immunol.13:933-940(2001))、由tlr4识别的脂多糖(lps)(poltorak,a.等,science 282:2085-2088(1998))、由tlr5识别的细菌鞭毛蛋白(poltorak,a.等人,science 282:2085-2088(1998))、由tlr3识别的病毒双链rna(dsrna)(poltorak,a.等人,science 282:2085-2088(1998))、由tlr7和tlr8识别的病毒单链rna(ssrna)(diebold,s.s.等人,science 303:1529-1531(2004)；heil,f.等人,science 303:1526-1529(2004))、由tlr9识别的含未甲基化cpg的寡脱氧核苷酸(odn)(hemmi,h.等人,nature 408:740-745(2000))等。
3.tlr在先天免疫应答中起关键作用，并且分类成在质膜上起作用的胞外tlr，包括tlr1、tlr2、tlr4、tlr5、tlr6和tlr11，以及在细胞(如内体)中起作用的胞内tlr，包括tlr3、tlr7、tlr8和tlr9。在结构上，tlr具有被配体或辅助分子识别的在胞外结构域的n末端处的富含亮氨酸的重复序列(lrr)位点，并且具有将信号递送至胞内部分的c末端的toll/白细胞介素1受体(tir)结构域。
4.特别地，tlr3、tlr7、tlr8和tlr9检测从来自胞外入侵病原体的内体暴露的外源单链rna(ssrna)、双链rna(dsrna)和cpg dna，或识别作为配体的从由于异常应答导致的组织中的坏死或凋亡而损伤的组织暴露的内源ssrna或dna片段，从而通过信号传导过程扩增炎性细胞因子。通常，tlr7和tlr8识别来自流感或损伤细胞的ssrna，而tlr9检测从细菌和病毒或损伤组织的基因组产生的cpg dna片段，并且tlr3识别作为病毒增殖的中间产物的dsrna，从而激活先天免疫应答。由于tlr的已知作用，因此世界范围内正在积极地进行使用tlr作为治疗免疫相关疾病的靶标的研究。
5.在tlr7/8/9的myd88(髓样分化初级应答88)依赖性信号传导中，与相应配体形成二聚体，并且tlr的tir结构域结合myd88的tir结构域以形成复合物，从而激活信号传导途径(hemmi,h.等人,nat.immunol.3,196-200,(2002))。激活的tlr信号诱导nf-κb的激活、其迁移至细胞核以及mapk的激活，并且表达干扰素α(ifnα)和ifn诱导型基因。nf-κb和mapk的激活引起炎性细胞因子(如tnfα、il-1β(白细胞介素1β)和il-6)的分泌。tlr3的myd88非依
赖性信号传导过程通过在tlr3的tir结构域与trif(含有tir结构域的诱导衔接子的干扰素β)的tir结构域之间的结合而起始，并且由于干扰素调节因子(irf)的激活而分泌1型干扰素。另外，tlr活性在巨噬细胞中产生氧化应激物，如no和ros。
6.内体膜中的tlr(tlr3、tlr7、tlr8和tlr9)在保护宿主免受各种病毒和细菌感染中发挥重要作用。特别地，tlr7、tlr8和tlr9的表达对于持续防御从损伤或应激的组织/细胞释放的致病组分或自身抗原是必需的(demaria,o.等人,j.clin.invest.120:3651-3662(2010))。这些检测核酸的tlr的功能失常与几种自身免疫病理学(如银屑病和系统性红斑狼疮(sle))相关(vincent,fb等人,nat.rev.rheumatol.10:365-373(2014))。然而，这些疾病的病因仍不清楚(krieg,a.m.和vollmer,j.,immunol.rev.220:251-269(2007)；terhorst,d.等人,j.immunol.195:4953-4961(2015))。因此，对开发抑制内体tlr介导的疾病的进展的新型拮抗剂的需求日益增加。
7.如上所述，tlr可以作为用于治疗各种疾病(如自身免疫性疾病、炎性疾病、病毒性疾病和癌症)的靶标，并且因此已经对用于治疗tlr相关疾病的靶向tlr的物质和医药组合物进行了积极的研究。
8.因此，作为开发用于治疗tlr相关疾病的tlr靶向物质和医药组合物的集中努力的结果，诸位发明人发现包含定义为“sk”的化合物的新型化合物通过抑制由tlr3、tlr7、tlr8或tlr9激活诱导的tlr信号传导途径来抑制细胞因子的分泌，并且基于这一发现完成了本发明。
9.背景技术中描述的信息仅用于提高对本发明的背景的理解，并且它不应被解释为包括形成本发明所属领域的普通技术人员已经知晓的相关技术的信息。


技术实现要素：

10.本发明的一个目的是提供一种具有抑制tlr(toll样受体)功能的小分子化合物，以及一种用于抑制tlr(toll样受体)的包含所述化合物的组合物。
11.本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的组合物，所述组合物包含用于抑制tlr的所述小分子化合物或所述组合物。
12.本发明的仍另一个目的是提供一种用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的方法，所述方法包括施用用于抑制tlr的所述小分子化合物或所述组合物。
13.本发明的又另一个目的是提供用于抑制tlr的所述小分子化合物或所述组合物用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的用途。
14.本发明的另外的另一个目的是提供用于抑制tlr的所述小分子化合物或所述组合物用于制造用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的药物的用途。
15.为了实现上述目的，本发明提供了一种由下式1表示的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐：
16.[式1]
[0017][0018]
其中r1至r6彼此相同或不同，并且各自独立地是氢原子、卤素原子、直链或支链烷基、氨基、烷基胺、杂环胺、腈基、硝基、亚硝基、羟基、环烷基、苄基、卤代烷基、烯丙基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、烷基芳基羰基、烷氧基羰基、环烷氧基、芳基、杂芳基、杂环烷基、芳氧基、烷氧基杂芳基、杂芳氧基烷基、烷基杂芳基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、烷基酯、烷基醚、烷基酰胺或丙烯酰基，或
[0019]
r2和r3彼此连接以形成取代的或未取代的环烃或芳烃，或
[0020]
r5和r6彼此连接以形成取代的或未取代的环烃或芳烃，
[0021]
其中所述烷基、所述烷基胺、所述杂环胺、所述烷氧基、所述烷氧基烷基、所述烷基酯、所述烷基醚或所述烷基酰胺是c
1-30
，所述环烷基是c
3-30
，所述烯丙基是c
2-30
，所述芳基是c
6-30
，并且所述杂芳基和所述杂环烷基含有选自氟、氧、硫和氮的杂原子。
[0022]
另外，本发明提供了一种用于抑制toll样受体(tlr)的组合物，所述组合物包含由式1表示的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐。
[0023]
另外，本发明提供了一种用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的组合物，所述组合物包含用于抑制tlr的所述化合物或所述组合物。
[0024]
另外，本发明提供了一种用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的方法，所述方法包括施用用于抑制tlr的所述化合物或所述组合物。
[0025]
另外，本发明提供了用于抑制tlr的所述化合物或所述组合物用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的用途。
[0026]
另外，本发明提供了用于抑制tlr的所述化合物或所述组合物用于制造用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的药物的用途。
附图说明
[0027]
图1展示了产物sk01的总体计算筛选工作流程和对于tlr7和tlr9的初始活性的评价。
[0028]
图1a展示了根据本发明的配体筛选方法的定量结构-活性关系建模和步骤，其中第一步骤被分成在橙色方框中描述的几个子步骤，图1b展示了由tlr7激动剂咪喹莫特(imq)诱导的对tnf-α的抑制，图1c是示出了由tlr9激动剂odn2395诱导的对tnf-α分泌的抑制的图，其中将细胞用sk01处理1小时，随后用imq(3.61μm)或odn2395(0.5μm)处理4小时，并且通过elisa检测tnf-α的分泌，图1d是示出了sk01在小鼠巨噬细胞系raw 264.7中的细胞毒性的评价的图，其中将细胞用20μm或50μm sk01处理24小时，并且通过mtt测定来测试细胞活力，图1e是示出了sk01的激动活性的评价的图，其中将细胞用配体处理24小时，通过elisa监测tnf-α的分泌，示出由odn2395(0.5μm)引起的细胞因子诱导以用于比较，实验一
式三份地进行，并且以平均值
±
sem示出的差值通过双尾学生t检验评价(*p《0.05，**p《0.01)。
[0029]
图2示出了sk01及其结构衍生物(sk02-sk20)针对tlr9的主要对比抑制活性。
[0030]
图3示出了图2中显示出主要活性的sk01的六种衍生物对于tlr7和tlr9的活性的评价。
[0031]
图3a是示出了sk01衍生物针对tlr7激活的抑制活性的图，其中将raw 264.7细胞用2μm或5μm抑制剂处理1小时，然后用tlr7激动剂imq处理4小时，图3b是示出了sk01衍生物针对tlr9激活的抑制活性的图，其中将raw 264.7细胞用0.5μm或2μm抑制剂处理1小时，然后用tlr9激动剂odn2395处理4小时，并且通过elisa监测所有实验中的tnf-α分泌，图3c示出了在基于细胞的测定中展现出tlr7/9抑制活性的配体的二维结构，其中sk01被鉴定为初始先导物，并且发现其衍生物sk16对于tlr7和tlr9两者都是有效的抑制剂，并且图3d示出了活性配体的smiles字符串、iupac名称和分子量。
[0032]
图4是示出sk01、sk16和hcq的体外功效的图。
[0033]
图4a是示出了由sk01、sk16和hcq诱导的细胞毒性的对比评价的图，其中将raw 264.7细胞暴露于渐增浓度(12.5、25、50、100和200μm)的配体24小时，并且通过mtt测定监测细胞活力，并且所述图示出了从由在这些预定浓度下的配体诱导的毒性％获得的lc
50
，并且通过使用graphpad prism 7(graphpad软件，美国)对每条浓度响应曲线进行非线性回归分析，确定了表明50％细胞活力(在raw 264.7细胞中)的lc
50
，图4b是用于确定由tlr3激动剂多聚i:c诱导的对tnf-α分泌(pg/ml)的抑制的tlr3依赖性tnf-α分泌抑制(％)图，图4c是用于确定由tlr7激动剂imq诱导的对tnf-α分泌(pg/ml)的抑制的tlr7依赖性tnf-α分泌抑制(％)图，图4d是用于确定由tlr9激动剂odn2395诱导的对tnf-α分泌的抑制的tlr9依赖性tnf-α分泌抑制(％)图，在图4b、图4c和图4d中，将raw 264.7细胞用预定浓度的抑制剂处理1小时，然后用imq或odn2395刺激4小时以及用多聚i:c刺激24小时，通过elisa测量tnf-α的分泌，对值取平均并将其显示为基于阴性对照(未处理，设定为0％)和阳性对照(仅激动剂；设定为100％(每种情况下的最高值))的比率，并且通过使用graphpad prism 7(graphpad软件，美国)进行的非线性回归分析获得ic
50
，其是tnf-α分泌被抑制50％的点，并且图4e示出了通过在图4a至图4d中获得的lc
50
和ic
50
得出的针对每种tlr的每种药物的治疗指数。
[0034]
图5是示出了sk01对同源tlr的信号传导途径的影响的图。
[0035]
图5a至图5c示出了sk01对于暴露于细胞表面的tlr(tlr1/2、tlr2/6和tlr4)的抑制活性，并且图5d至图5g示出了sk01针对内体tlr(tlr3、tlr7、tlr8和tlr9)的抑制活性，其中将raw 264.7细胞用阴性对照、阳性对照(仅配体)、另外的阳性对照(配体和0.25％ dmso)或sk01以预定浓度处理1小时，然后用tlr特异性激动剂刺激4或24小时(仅tlr3)，对于tlr8，使用人单核细胞系(thp-1)，并且将thp-1细胞用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯处理48小时以诱导细胞分化，然后用sk01处理1小时，并且用tlr8激动剂tl8-506处理4小时，并且通过elisa测量tnf-α分泌的水平。
[0036]
图6是示出sk16对同源tlr的信号传导途径的影响的图。
[0037]
图6a至图6c示出了sk16对细胞表面tlr(tlr1/2、tlr2/6和tlr4)的抑制活性，并且图6d至图6g示出了sk16对内体tlr(tlr3、tlr7、tlr8和tlr9)的抑制活性，其中将raw 264.7细胞用对照(-)、dmso 0.25％或sk16以预定浓度处理1小时，然后用特异性tlr激动剂刺激4
或24小时(仅对于tlr3)，对于tlr8，使用人单核细胞系(thp-1)，并且将thp-1细胞用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)处理48小时以诱导细胞分化，随后用sk16处理1小时并且用tlr8激动剂tl8-506处理4小时，并且通过elisa测量tnf-α分泌的水平，图6h示出了在tlr9下转导信号的信号传导因子的活性，其中设置了未用任何物质处理的阴性对照组，通过在每个时间点向raw 264.7细胞系施用sk16设置了阳性对照组，将细胞用sk16处理1小时，随后用tlr9激动剂处理15或30分钟，并且在量化所制备的样品之后通过蛋白质电泳确定信号因子的活性。
[0038]
图7是示出了抑制剂候选物sk21至sk82(包括sk16)的细胞毒性的图。
[0039]
图8是示出了抑制剂候选物sk21至sk82(包括sk16)对tlr7的抑制的图。
[0040]
图9是示出了抑制剂候选物sk21至sk82(包括sk16)对tlr9的抑制的图。
[0041]
图10是比较在显示出针对tlr7和tlr9的有效抑制活性的13种sk物质(包括sk16)与羟氯喹(hcq)之间所测量的lc
50
、ic
50
和ti(治疗指数)的表。
[0042]
图11是示出了sk41、sk50、sk58和sk64针对表面tlr(tlr1/2、tlr2/6、tlr4和tlr5)的抑制作用的图。
[0043]
图12是示出了sk41、sk50、sk58和sk64针对作为内体tlr的tlr3和tlr8的抑制作用的图。
[0044]
图13是示出了在小鼠狼疮模型(mrl/fas
lpr
或mrl/lpr)动物实验中在每天口服施用一次，持续3周(发病之后2周口服施用；对于hcq，60mg/kg，对于sk系列，30mg/kg)之后的外观变化的图像。
[0045]
图14是示出了在狼疮动物实验期间小鼠实验组的平均体重的监测结果的图表。
[0046]
图15是示出了在狼疮动物实验结束时(口服施用之后40天)收集的脾和淋巴结的重量的图表。
[0047]
图16是示出了酶联免疫吸附测定结果的图表，所述酶联免疫吸附测定用于分析在狼疮动物实验结束时收集的血浆中抗核抗体(ana)和c3补体的浓度。
[0048]
图17是示出了在小鼠狼疮模型(mrl/fas
lpr
)动物实验中在每天口服施用一次，持续4周(发病之后3周口服施用；对于hcq，15mg/kg；对于sk系列，15mg/kg)之后的外观变化的图像。
具体实施方式
[0049]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所涉及领域的技术人员所理解的含义相同的含义。通常，本文所用的命名法是本领域中熟知的，并且是通常使用的。
[0050]
先天免疫在诱导针对入侵病原体和内源/外源毒性分子的适应性免疫应答中发挥重要作用。同时，通过内体tlr进行的自身核酸识别参与系统性自身免疫性疾病(如ra或sle)的发病机制(marshak-rothstein,a.nat rev immunol 2006,6,823-35)。鉴定了有效下调过度免疫产生的初步先导物sk01，因为tlr通过涉及通用下游衔接子或激酶的多重冗余途径传送信号。通过用具有80％或更高同一性的结构进行的另外实验鉴定了展现出与hcq(一种已知的内体tlr抑制剂)的体外功效等同的体外功效的衍生物(sk16)。最近，已经开发了几种化学或生物试剂用于治疗自身免疫性和炎性疾病，但是因早期安全问题
(nct00547014)或在晚期临床试验中无效(rice,t.w.等人,crit care med 2010,38,1685-94)导致没有一种试剂被成功地制备成药物。唯一被批准用于治疗sle和ra的tlr拮抗剂是抗疟药hcq、氯喹和奎纳克林(rynes,r.i.br j rheumatol 1997,36,799-805)。这些药物阻断核酸结合tlr所需的内体酸化或在tlr周围累积，从而有效地抑制浆细胞样树突细胞和外周血单个核细胞中促炎细胞因子的产生。然而，基于通过结构-活性关系研究已知的分子间相互作用，其功效可以大大增加。因此，需要开发具有直接受体结合能力的新型拮抗剂。
[0051]
本发明基于这样的发现，即初级先导物质sk01及其强衍生物sk16(它们是使用计算机鉴定的两种小分子)特异性抑制内体tlr3/7/9在raw 264.7细胞中的功能，并且新型化合物(包括基于sk16而定义为sk23、sk24、sk29、sk36、sk39、sk40、sk41、sk50、sk52、sk54、sk55、sk58、sk59、sk60、sk61、sk62、sk63、sk64、sk65、sk69、sk70、sk71、sk72、sk74、sk75、sk81和sk82的化合物)通过抑制由tlr3、tlr7、tlr8和/或tlr9激活诱导的tlr信号传导途径来抑制细胞因子的分泌。这表明这些化合物对由tlr3、tlr7、tlr8和/或tlr9激活引起的自身免疫性、炎性或病毒性疾病(如系统性红斑狼疮和银屑病)具有治疗效果。
[0052]
因此，在一个方面，本发明涉及一种由下式1表示的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐：
[0053]
[式1]
[0054][0055]
其中r1至r6彼此相同或不同，并且各自独立地是氢原子、卤素原子、直链或支链烷基、氨基、烷基胺、杂环胺、腈基、硝基、亚硝基、羟基、环烷基、苄基、卤代烷基、烯丙基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、烷基芳基羰基、烷氧基羰基、环烷氧基、芳基、杂芳基、杂环烷基、芳氧基、烷氧基杂芳基、杂芳氧基烷基、烷基杂芳基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、烷基酯、烷基醚、烷基酰胺或丙烯酰基，或
[0056]
r2和r3彼此连接以形成取代的或未取代的环烃或芳烃，或
[0057]
r5和r6彼此连接以形成取代的或未取代的环烃或芳烃，
[0058]
其中所述烷基、所述烷基胺、所述杂环胺、所述烷氧基、所述烷氧基烷基、所述烷基酯、所述烷基醚或所述烷基酰胺是c
1-30
，所述环烷基是c
3-30
，所述烯丙基是c
2-30
，所述芳基是c
6-30
，并且所述杂芳基和所述杂环烷基含有选自氟、氧、硫和氮的杂原子。
[0059]
在本发明中，所述烷基、所述烷基胺和所述杂环胺优选是c
1-15
、更优选c
1-10
、以及最优选c
1-7
。
[0060]
如本文所用，术语“c
1-30
烷基”是指单价直链或支链饱和烃部分，其具有1至30个碳原子且仅含有碳和氢原子。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。“支链烷基”的例子包括异丙基、异丁基、叔丁基等。
[0061]
如本文所用，术语“c
1-30
烷氧基”是指式-o-c
1-30
烷基，并且包括但不限于甲氧基、乙
氧基、异丙氧基、叔丁氧基等。
[0062]
术语“卤素”(或“卤代”)的具体例子包括氟(f)、氯(cl)、溴(br)和碘(i)。
[0063]
如本文所用，术语“氨基”是指其中从氨去除一个氢原子的官能团，并且包括其中一个或多个氢原子被残基(如烃)取代的胺基。胺基可以包括伯、仲或叔烷基胺，这取决于取代的烷基的数量。术语“杂环胺”是指杂环化合物，其是在环中含有氮的胺。
[0064]
如本文所用，术语“c
6-30
芳基”是指包含至少一个具有共享π电子体系的环的化合物，例如单环或稠环多环基团(即，具有共享相邻碳原子对的环)。也就是说，除非本文另有定义，否则芳基可以包括苯基或联芳基，如萘基。根据本发明的一个实施方案，所述芳基是具有6至30个碳原子的芳香环。
[0065]
如本文所用，术语“c
3-30
环状烷基”是指具有5至6个碳原子且仅含有碳和氢原子的环状饱和烃部分。环状烷基的例子包括但不限于环戊基、环己基等。
[0066]
除非另有定义，否则如本文所用，术语“杂芳基”是指具有5或6个环原子、含有1至4个选自n、o和s的杂原子的芳香环，或具有与苯环或另一杂芳基环稠合的杂芳基环的双环。单环杂芳基的例子包括但不限于噻唑基、噁唑基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、异噁唑基、异噻唑基、吡唑基、三唑基、三嗪基、噻二唑基、四唑基、噁二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基和与其类似的基团。双环杂芳基的例子包括但不限于吲哚基、氮杂吲哚基、二氢吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、喹啉基、异喹啉基、嘌呤基、呋喃并吡啶基和与其类似的基团。
[0067]
如本文所用，术语“杂环烷基”是指具有5至9个环原子的饱和或部分不饱和的碳环，除碳原子外，其还含有1至3个选自n、o和s的杂原子。例如，杂环烷基可以是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉-4-基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、高哌嗪基、氧杂氮杂环庚烷基、二氢吲哚基、二氢呋喃基、二氢咪唑啉基、二氢噁唑基、四氢吡啶基、二氢吡喃基、二氢苯并呋喃基、苯并二氧杂环戊烯基或苯并二噁烷基。
[0068]
如本文所用，r1至r6可以是选自以下取代基的取代基，但不限于此。
[0069]
r1：
[0070]
r2：
[0071]
r3：
[0072]
r2和r3：：
[0073][0074]
r4：
[0075]
r5：
[0076]
r6：
[0077]
r5和r6：
[0078]
在本发明中，由式1表示的化合物可以是由选自由下式1-1至1-34中的任一种表示的化合物：
[0079]
[式1-1]
[0080][0081]
[式1-2]
[0082]
[0083]
[式1-3]
[0084][0085]
[式1-4]
[0086][0087]
[式1-5]
[0088][0089]
[式1-6]
[0090][0091]
[式1-7]
[0092][0093]
[式1-8]
[0094][0095]
[式1-9]
[0096][0097]
[式1-10]
[0098][0099]
[式1-11]
[0100][0101]
[式1-12]
[0102][0103]
[式1-13]
[0104][0105]
[式1-14]
[0106][0107]
[式1-15]
[0108][0109]
[式1-16]
[0110][0111]
[式1-17]
[0112][0113]
[式1-18]
[0114][0115]
[式1-19]
[0116][0117]
[式1-20]
[0118][0119]
[式1-21]
[0120][0121]
[式1-22]
[0122][0123]
[式1-23]
[0124][0125]
[式1-24]
[0126][0127]
[式1-25]
[0128][0129]
[式1-26]
[0130][0131]
[式1-27]
[0132][0133]
[式1-28]
[0134][0135]
[式1-29]
[0136][0137]
[式1-30]
[0138][0139]
[式1-31]
[0140][0141]
[式1-32]
[0142][0143]
[式1-33]
[0144][0145]
[式1-34]
[0146][0147]
在此，式1-1的化合物命名为“sk01”，式1-2的化合物命名为“sk09”，式1-3的化合物命名为“sk11”，式1-4的化合物命名为“sk13”，式1-5的化合物命名为“sk14”，式1-6的化合物命名为“sk16”，并且式1-7的化合物命名为“sk19”(表1)。
[0148]
[表1]
[0149]
[0150]
[0151][0152]
另外，在本说明书中，式1-8的化合物命名为“sk23”，式1-9的化合物命名为“sk24”，式1-10的化合物命名为“sk29”，式1-11的化合物命名为“sk36”，式1-12的化合物命名为“sk39”，式1-13的化合物命名为“sk40”，式1-14的化合物命名为“sk41”，式1-15的化合物命名为“sk50”，式1-16的化合物命名为“sk52”，式1-17的化合物命名为“sk54”，式1-18的化合物命名为“sk55”，式1-19的化合物命名为“sk58”，式1-20的化合物命名为“sk59”，式1-21的化合物为“sk60”，式1-22的化合物命名为“sk61”，式1-23的化合物命名为“sk62”，式1-24的化合物命名为“sk63”，式1-25的化合物命名为“sk64”，式1-26的化合物命名为“sk65”，式1-27的化合物命名为“sk69”，式1-28的化合物命名为“sk70”，式1-29的化合物命名为“sk71”，式1-30的化合物命名为“sk72”，式1-31的化合物命名为“sk74”，式1-32的化合物命名为“sk75”，式1-33的化合物命名为“sk33”，并且式1-34的化合物命名为“sk34”(表2)。
[0153]
[表2]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158]
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167][0168]
根据本发明的化合物可以以药学上可接受的盐的形式使用，并且由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐可用作所述盐。所述游离酸可以是无机酸或有机酸。无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等，并且有机酸包括柠檬酸、乙酸、乳酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、甲磺酸、乙醇酸、琥珀酸、酒石酸、4-甲苯磺酸、半乳糖醛酸、扑酸、谷氨酸、天冬氨酸等。
[0169]
根据本发明的化合物包括可以通过常规方法制备的任何盐、异构体、水合物和溶剂化物，以及药学上可接受的盐。
[0170]
另外，根据本发明的化合物可以以结晶或无定形形式制备。当式1的化合物以结晶形式制备时，其可以任选地被水合或溶剂化。
[0171]
在本发明中，由式1所示的化合物通过抑制tlr3、tlr7、tlr8或tlr9信号传导途径而展现出抑制炎性细胞因子(如tnf-α)分泌的作用。
[0172]
因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于抑制toll样受体(tlr)的组合物，所述组合物包含由式1表示的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐。
[0173]
由式1表示的化合物可以是由选自式1-1至式1-34中任一个表示的化合物，但不限于此。
[0174]
在本发明中，所述化合物可以抑制选自作为内体tlr的tlr3、tlr7、tlr8和tlr9中的至少一种tlr的信号传导途径。
[0175]
如本文所用，术语“抑制”是指由于某一缺陷、不平衡或其他原因导致生物活性或信号传导活性退化的现象，并且可以包括部分或完全阻断、降低或阻止tlr活性、延迟激活、失活或下调。
[0176]
如本文所用，术语“抑制剂”是指通过任何机制部分或完全抑制对其他分子(如受体或胞内介体)的影响的分子。在本文中，用于抑制tlr的组合物具有与tlr抑制剂相同的含义。
[0177]
如本文所用，术语“tlr3、tlr7、tlr8或tlr9抑制剂”是指能够直接或间接或基本上干扰、降低或抑制tlr3、tlr7、tlr8或tlr9的生物活性的物质，并且优选是指这样的物质，其结合tlr3、tlr7、tlr8或tlr9受体并中和其活性以阻断tlr3、tlr7、tlr8或tlr9信号传导途径，并且从而降低nf-κb(激活的b细胞的核因子κ轻链增强子)、mapk(丝裂原激活的蛋白激酶)、炎性细胞因子、no和ros的分泌。
[0178]
根据本发明的一个实施方案，sk23、sk24、sk29、sk36、sk39、sk40、sk41、sk50、sk52、sk54、sk55、sk58、sk59、sk60、sk61、sk62、sk63、sk64、sk65、sk69、sk70、sk71、sk72、sk74、sk75、sk81和sk82通过抑制由tlr3、tlr7、tlr8或tlr9激活诱导的tlr信号传导途径来抑制细胞因子(如tnf-α(肿瘤坏死因子-α))的过度激活。因此，这些物质具有优异的减少炎性细胞因子(改善炎症反应)的作用，并且因此可以用作用于预防或治疗由tlr3、tlr7、tlr8或tlr9激活引起的自身免疫性疾病、炎性疾病和病毒性疾病的组合物。
[0179]
如本文所用，术语“tlr3”是指归类为作为用作病原体感染的监测物的跨膜蛋白家族的toll样受体(tlr)的蛋白质，是由tlr3基因编码的蛋白质，并且也被称为“cd283”或“iiae2”。tlr3识别双链rna或多聚i:c以激活先天免疫系统。
[0180]
如本文所用，术语“tlr7”是指归类为作为用作病原体感染的监测物的跨膜蛋白家族的toll样受体(tlr)的蛋白质，是由tlr7基因编码的蛋白质，并且也被称为“unq248/pro285”。tlr7识别rna病毒的ssrna(单链rna)或合成小分子(如咪唑并喹啉、洛索立宾和溴匹立明)以激活先天免疫系统。
[0181]
如本文所用，术语“tlr8”是指归类为作为用作病原体感染的监测物的跨膜蛋白家族的toll样受体(tlr)的蛋白质，是由tlr8基因编码的蛋白质，并且也被称为“cd288(分化簇288)”或“unq249/pro286”。tlr8由单链病毒rna、通过吞噬作用进入细胞的吞噬细菌rna或由合成小分子tl8-506激活。
[0182]
如本文所用，术语“tlr9”是指归类为作为用作病原体感染的监测物的跨膜蛋白家族的toll样受体(tlr)的蛋白质，是由tlr9基因编码的蛋白质，并且也被称为“cd289”或“unq5798/pro19605”。tlr9识别来自细菌或dna病毒的未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸dna片
段以激活先天免疫系统。
[0183]
如本文所用，术语“tlr信号传导途径”是指通过tlr进行的信号传导途径，其可以是依赖于由tlr和衔接蛋白myd88(对于tlr7/8/9)形成的复合物或由tlr和衔接蛋白trif(对于tlr3)形成的复合物的反应，并且起传送信号的作用。激活的tlr7/8/9通过myd88依赖性信号传导过程激活nf-κb，将其传送到细胞核，并诱导mapk的激活。nf-κb和mapk的激活导致炎性细胞因子(如tnf-α、il-1β和il-6)被分泌，并且在巨噬细胞中产生氧化应激物，如一氧化氮(下文中称为no)和活性氧类(下文中称为ros)。另外，tlr3激活trif、干扰素调节因子(irf)和nf-κb，从而诱导myd88非依赖性信号传导过程和1型干扰素的分泌。
[0184]
根据本发明的一个实施方案，根据本发明的式1的化合物具有优异的抑制tlr3、tlr7、tlr8和tlr9信号传导途径的作用，并且可用作用于预防或治疗由tlr3、tlr7、tlr8或tlr9信号传导途径引起的自身免疫性疾病、炎性疾病和病毒性疾病的组合物。
[0185]
因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的组合物，所述组合物包含用于抑制toll样受体(tlr)的所述化合物(其异构体或其药学上可接受的盐)或所述组合物。
[0186]
在另一个方面，本发明涉及一种用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的方法，所述方法包括施用用于抑制toll样受体(tlr)的所述化合物(其异构体或其药学上可接受的盐)或所述组合物。
[0187]
在另一个方面，本发明涉及用于抑制toll样受体(tlr)的所述化合物(其异构体或其药学上可接受的盐)或所述组合物用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的用途。
[0188]
在另一个方面，本发明涉及用于抑制toll样受体(tlr)的所述化合物(其异构体或其药学可接受的盐)或所述组合物在制造用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的药物中的用途。
[0189]
在本发明中，由式1表示的化合物可以是由选自式1-1至式1-34中任一个表示的化合物，但不限于此。
[0190]
在本发明中，所述自身免疫性疾病或炎性疾病选自银屑病、系统性红斑狼疮(sle)、皮疹、光敏性皮肤病、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、银屑病关节炎、盘状红斑狼疮、疟疾、口腔溃疡、肾炎、血细胞减少症、血管炎、浆膜炎、炎性肠病(ibd)、糖尿病、多发性硬化、皮肤硬化、天疱疮、特应性皮炎、尿道炎、膀胱炎、动脉硬化、过敏性疾病、鼻炎、哮喘、急性疼痛、慢性疼痛、牙周炎、牙龈炎、痛风、心肌梗塞、充血性心力衰竭、高血压、心绞痛、胃溃疡、脑梗塞、唐氏综合征、肥胖症、痴呆、抑郁症、精神分裂症、结核病、睡眠障碍、脓毒症、烧伤、胰腺炎、帕金森病和中风，但不限于此。
[0191]
如本文所用，术语“自身免疫性疾病”是指由这样的过程引起的疾病，其中在诱导或保持自身耐受性方面出现问题，导致对自身抗原的免疫应答并因此攻击生物体自身组织。术语“自身耐受性”是指免疫无应答性，意味着对构成自身的潜在抗原性物质没有有害反应。自身免疫性疾病包括由自身抗性的破坏引起的疾病，其中适应性免疫系统对自身抗原作出应答并介导细胞和组织损伤。在某些实施方案中，所述自身免疫性疾病至少部分由体液免疫应答引起。
[0192]
与本发明有关的自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病、多
发性硬化、自身免疫性脑脊髓炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、银屑病关节炎、盘状红斑狼疮、光敏性皮肤病、自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、实验性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、原发性粘液性水肿、甲状腺中毒症、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、阿狄森病、早期绝经、男性不育、儿童糖尿病、古德帕斯丘综合征、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、交感性眼炎、晶状体葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞增多症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎hbs-ve、潜伏性肝硬化、溃疡性结肠炎、舍格伦综合征、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、多肌炎/皮肌炎和盘状le，但不限于此。
[0193]
另外，自身免疫性疾病的非限制性例子包括急性播散性脑脊髓炎(adem)、急性坏死出血性脑白质脑炎、阿狄森病、无丙种球蛋白血症、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗体介导的移植排斥、抗gbm/抗tbm肾炎、抗磷脂抗体综合征(aps)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经障碍、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷综合征、自身免疫性内耳疾病(aied)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性糖尿病性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(atp)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病变、巴娄病(balo disease)、白塞病、天疱疮、心肌病、卡斯尔曼病(castleman's disease)、乳糜泻、查加斯病、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变(cidp)、慢性复发性多灶性骨髓炎(crmo)、查格-施特劳斯综合征(churg-strauss syndrome)、瘢痕性天疱疮/良性粘膜天疱疮、克罗恩病、柯根综合征(cogan syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、crest病、原发性混合冷球蛋白血症、脱髓鞘神经病变、疱疹样皮炎、皮炎、德维克病(devic'sdisease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征(dressler's syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、伊文综合征(evans syndrome)、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球性肾炎、古德帕斯丘综合征、肉芽肿病伴多血管炎(gpa)、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(henoch-schonlein purpura)、妊娠期疱疹、低丙种球蛋白血症、高丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga肾病、igg4相关硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、包涵体肌炎、炎性肠病、胰岛素依赖型糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征(lambert-eaton syndrome)、白细胞减少性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木质性结膜炎、线性iga病(lad)、狼疮(sle)、莱姆病、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、混合结缔组织病(mctd)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(mgus)、侵蚀性角膜溃疡、穆-哈二氏病(mucha-habermann disease)、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克病)、嗜中性粒细胞减少症、眼部瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、pandas(与链球菌感染相关的儿童自身免疫性神经精神障碍)、抗肿瘤性小脑变性、阵发性夜间血红蛋白尿症(pnh)、面部单侧萎缩、帕森-特纳综合征(parsonnage-turner syndrome)、睫状体平坦部炎(周围葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、poems综合征、结节性多动脉炎、i型、ii型和iii型自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、黄体酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象、反射性交感神经营养不良、雷特综合征、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、
类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(sbe)、苏萨克综合征(susac's syndrome)、交感性眼炎、高安动脉炎(takayasu's arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(ttp)、托洛萨-亨特综合征(tolosa-hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(uctd)、葡萄膜炎、血管炎、水疱性皮肤病、白癜风、华氏巨球蛋白血症(wm)和韦格纳肉芽肿病(肉芽肿病伴多血管炎；gpa)。
[0194]
如本文所用，术语“炎性疾病”是指由于通过有害刺激(如炎症诱导因子或辐射)导致免疫系统的过度兴奋而由免疫细胞(如巨噬细胞)分泌的炎性物质(炎性细胞因子)如tnfα、il-1、il-6、前列腺素、白三烯或no所引起的疾病。“炎性疾病”可以是急性或慢性炎性病症，并且可以由感染性或非感染性原因造成。
[0195]
本发明的炎性疾病包括银屑病、哮喘、湿疹、变态反应、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、接触性皮炎、特应性皮炎、痤疮、特应性鼻炎、过敏性皮炎、慢性鼻窦炎、脂溢性皮炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎、溃疡、慢性支气管炎、肺部炎症、克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、脓毒症、血管炎、滑囊炎、狼疮、类风湿性多肌痛、颞动脉炎、多发性硬化、实体癌、阿尔茨海默病、动脉硬化、肥胖症、疟疾和病毒感染，但不限于此。
[0196]
另外，炎性疾病的非限制性例子包括动脉粥样硬化、动脉硬化、自身免疫性病症、多发性硬化、系统性红斑狼疮、风湿性多肌痛(pmr)、痛风性关节炎、退行性关节炎、肌腱炎、滑囊炎、银屑病、囊性纤维化、关节骨炎、类风湿性关节炎、炎性关节炎、舍格伦综合征、巨细胞性动脉炎、进行性系统性硬化(硬皮病)、强直性脊柱炎、多肌炎、皮炎、天疱疮、类天疱疮、糖尿病(例如，i型)、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、古德帕斯丘病、混合结缔组织病、硬化性胆管炎、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、恶性贫血、炎性皮肤病、常见间质性肺炎(uip)、石棉沉着病、硅肺病、支气管扩张症、铍中毒、滑石肺、尘肺病、结节病、脱屑性间质性肺炎、淋巴间质性肺炎、巨细胞间质性肺炎、细胞间质性肺炎、外源性过敏性肺泡炎、韦格纳肉芽肿病和相关形式的脉管炎(颞动脉炎和结节性多动脉炎)、炎性皮肤病、肝炎、延迟型超敏反应(例如，毒葛皮炎)、肺炎、气道炎症、成人呼吸障碍综合征(ards)、脑炎、速发型超敏反应、哮喘、花粉热、过敏、急性过敏反应、风湿热、肾小球性肾炎、肾盂肾炎、蜂窝组织炎、膀胱炎、慢性胆囊炎、局部缺血(缺血性损伤)、同种异体排斥反应、宿主对移植物的排斥反应、阑尾炎、动脉炎、睑缘炎、细支气管炎、支气管炎、宫颈炎、胆管炎、绒毛膜羊膜炎、结膜炎、银屑病、皮炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、肠道炎症、附睾炎、筋膜炎、结缔组织炎、胃炎、肠胃炎、牙龈炎、回肠炎、虹膜炎、喉炎、心肌炎、肾炎、淋巴炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、中耳炎、胰腺炎、流行性腮腺炎、心包炎、咽炎、肾炎、静脉炎、间质性肺炎、直肠炎和肛门炎、前列腺炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、滑膜炎、睾丸炎、扁桃体炎、尿道炎、膀胱炎、葡萄膜炎、阴道炎、血管炎、外阴炎、外阴阴道炎、脉管炎、慢性支气管炎、骨髓炎、视神经炎、颞动脉炎、横贯性脊髓炎、抑郁症、脑筋膜炎和脑性脑病。在某些实施方案中，所述炎性疾病选自动脉粥样硬化、动脉硬化、自身免疫性疾病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性关节炎和心肌炎。
[0197]
在本发明中，所述病毒性疾病涵盖任何包括由ssrna、dsrna、dsdna和ssdna组成的所有病毒组的病毒性疾病。ssrna病毒包括星状病毒科(正义ssrna；人星状病毒)、杯状病毒科(正义ssrna；诺如病毒)、小核糖核酸病毒科(正义ssrna；柯萨奇病毒、甲型肝炎、脊髓灰
质炎病毒、鼻病毒)、冠状病毒(正义ssrna；严重急性呼吸综合征病毒，sars-cov-2)、黄病毒科(正义ssrna；丙型肝炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒tbe病毒)、披膜病毒科(正义ssrna；风疹病毒)、肝炎病毒科(正义ssrna；戊型肝炎病毒)、逆转录病毒科(ssrna-rt；人免疫缺陷病毒hiv)、正粘病毒科(负义ssrna；正粘病毒)、沙粒病毒科(负义ssrna；拉沙病毒)、布尼亚病毒科(负义ssrna；克里米亚-刚果出血热、汉坦病毒)、丝状病毒科(负义ssrna；伊波拉病毒、马尔堡病毒)、副粘病毒科(负义ssrna；麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒)、狂犬病毒科(负义ssrna；狂犬病毒)、和丁型肝炎(负义ssrna)，dsrna病毒包括呼肠孤病毒科(dsrna；轮状病毒、环状病毒、科罗病毒、版纳病毒)，dsdna病毒包括腺病毒科(dsdna；腺病毒)和单纯疱疹病毒(dsdna；1型单纯疱疹、2型单纯疱疹、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人巨细胞病毒，kshv)、乳头瘤病毒科(dsdna；人乳头瘤病毒)、多瘤病毒科(dsdna；bk病毒、jc病毒)、痘病毒科(dsdna；天花)、和嗜肝dna病毒科(dsdna-rt；乙型肝炎病毒)，并且ssdna病毒包括细小病毒科(ssdna；细小病毒b19)。病毒性疾病可以选自由这个病毒组引起的病毒性疾病，但不限于此。
[0198]
病毒性疾病的例子包括但不限于感冒、流感(流行性感冒)、水痘、带状疱疹、单纯疱疹、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、细小病毒感染、脊髓灰质炎、病毒出血热、黄热病、登革热、狂犬病、aids和covid-19。
[0199]
如本文所用，术语“预防”意指通过施用包含由式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物来抑制或延迟自身免疫性疾病、炎性疾病和/或病毒性疾病的任何作用。如本文所用，术语“治疗”意指通过施用包含式1的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物来缓解或完全治愈自身免疫性疾病、炎性疾病和/或病毒性疾病的症状的任何作用。
[0200]
根据本发明的用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病和/或病毒性疾病的组合物可以仅包含药学有效量的由式1表示的化合物，或者除了所述化合物之外，还可以包含至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。术语“药学有效量”是指足以预防、缓解和治疗自身免疫性疾病、炎性疾病和/或病毒性疾病的症状的量。
[0201]
本文所用的术语“药学上可接受的”意指在施用于人时是生理上可接受的，而不会引起普通的过敏反应，如胃肠障碍或眩晕或与其类似的反应。所述载体、赋形剂和稀释剂的例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。另外，所述组合物还可以包含填充剂、抗聚集剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂和防腐剂。
[0202]
如本文所用，术语“载体”是指有助于将化合物添加到细胞或组织中的物质。
[0203]
如本文所用，术语“稀释剂”定义为使主题化合物的生物活性稳定并在水中稀释以溶解所述化合物的物质。
[0204]
另外，本发明的组合物可以包含一种或多种已知的对自身免疫性疾病、炎性疾病和/或病毒性疾病具有治疗效果的活性成分以及由式1表示的化合物。
[0205]
可以使用本领域已知的方法来配制本发明的组合物，以在施用于非人哺乳动物之后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。所述配制品可以是粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软明胶胶囊或硬明胶胶囊、无菌注射溶液或无菌粉末的形式。
[0206]
本发明的组合物可以通过各种途径施用，所述途径包括口服、经皮、皮下、静脉内
或肌内施用，并且活性成分的剂量取决于各种因素，如施用途径、患者的年龄、性别和体重、以及患者疾病的严重程度。根据本发明的组合物可以与具有预防、改善或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病和/或病毒性疾病的症状的作用的已知化合物组合施用。
[0207]
除非另外定义，否则本说明书中使用的所有术语和缩写都可以被解释为具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。
[0208]
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员而言明显的是，以下实施例仅提供用于说明本发明，并且不应当解释为限制本发明的范围。
[0209]
实施例1：材料和方法
[0210]
实施例1-1：对于内体tlr抑制分子的计算机模拟(虚拟实验中的计算机编程)筛选以及新型化合物的设计
[0211]
首先，使用来自chembridge、chemspace、mcule、moe leadlike、molport、zinc药物样和zinc先导物样化学数据库的分子来制备筛选化合物的多构象文库。使用moe洗涤方案来洗涤配体结构。简言之，去除盐和断裂的碎片，计算在ph 6.5下的质子化状态，并且使能量最小化。去除重复构象，然后对文献中报道的一系列已知的tlr3/7/8/9抑制剂进行bit:maccs指纹相似性搜索(80％相似性截止值)。基于筛选的高活性拮抗剂的药效团模型，筛选所得配体。接着，使用moe软件(molecular operating environment(moe),2013.08；chemical computing group ulc，加拿大魁北克省蒙特利尔邮编h3a 2r7，谢布克大街西1010，套房编号910，2017(2013))，将满足药效团约束的配体对接到tlr7的r848结合位点(pdb id：5gmh(zhang,z.等人immunity 45,737-748(2016))。对接姿势基于在伦敦dg评分函数中实施的s分(结合亲和力)来排序。通过导向拟合方法和“gbvi/wsa dg”力场精修对所得对接姿势重新评分。最后，为了在基于细胞的测定中确定tlr3/7/8/9抑制活性，固定一组顶部配体(sk02-sk20)。基于具有有效性的化合物，设计并合成了一系列新型化合物。
[0212]
实施例1-2：细胞培养和接种
[0213]
raw 264.7细胞购自korean cell line bank，并且在含有10％ fbs(gibco)、1％青霉素和链霉素溶液(hyclone)的杜氏改良的伊格尔培养基中培养。
[0214]
对于细胞毒性检测和tlr1/2、tlr2/6、tlr3、tlr4、tlr7、tlr8和tlr9配体筛选，将细胞以2
×
104个细胞/孔的密度接种到96孔细胞培养板中并孵育过夜(大约18-24小时)。
[0215]
thp-1细胞系(一种来源于急性白血病的人单核细胞系)获自亚洲大学医学院(ajou university college of medicine)(韩国水原市)changhee seo教授。将细胞在含有10％ fbs(gibco)、1％青霉素和链霉素溶液(hyclone)的rpmi1640(hyclone laboratories,inc.,美国德克萨斯州圣安吉洛市)中培养，然后使用80nm佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma；sigma-aldrich co.，美国密苏里州圣路易斯)分化成m0巨噬细胞，持续24小时。
[0216]
对于tlr5配体筛选，将细胞以1
×
105个细胞/孔的密度接种在96孔细胞培养板中，并且培养过夜(约18小时)。
[0217]
在实验期间，将raw 264.7细胞系和thp-1细胞系两者都保持在湿润的培养箱(5％ co2，37℃)中，每天更换raw 264.7的培养基，并且每2天更换thp-1的培养基。
[0218]
实施例1-3：mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)分析
[0219]
将raw 264.7细胞以2
×
104个细胞/孔的密度接种在96孔细胞培养板中，并且在湿
润的培养箱中稳定过夜。将每个孔用测试化合物或阴性对照(二甲亚砜；dmso)处理。使板在培养箱中静置24小时。然后，弃去96孔培养皿的培养基，并且向每个孔中添加500μg/ml mtt溶液(invivogen ltd.)。孵育3小时之后，去除溶液，并且将残余物在dmso(biosesang co.ltd.，韩国)中孵育30分钟，以完全溶解甲臜染料。用微量板比色读数器测量在595nm波长处的吸光度，并且基于未处理的对照进行归一化。所有培养都在与上述细胞培养相同的条件下进行。
[0220]
实施例1-4：酶联免疫吸附测定(elisa)
[0221]
为了确定测试配体的抑制活性，将raw 264.7细胞用每种候选化合物预处理1小时，然后用pam3csk4(合成三酰基脂肽；tlr1/2，invitrogen)、fsl-1(合成二酰基脂蛋白，tlr2/6，100ng/ml)、脂多糖(lps，tlr4，sigma aldrich)、咪喹莫特(imq，tlr7，invitrogen)和odn2395(c型cpg重复基序dna寡聚(5'-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3)，tlr9，bioneer)配体处理4小时，以及用显示出延迟反应性的多聚i:c(i:c重复基序双链rna，tlr3，invitrogen)和tl8-506(tlr8，invitrogen)处理24小时。tlr激活之后，将上清液以适当比率稀释，以便在标准剂量范围内测量，将其转移至预包被的96孔测定板，然后使用小鼠tnf-αelisa试剂盒(invitrogen)根据制造商的说明书用小鼠tnf-α分泌水平处理。
[0222]
为了确定测试配体针对tlr5的抑制活性，将分化的thp-1细胞用每种化合物预处理1小时，然后用fla-st(大肠杆菌来源的鞭毛蛋白，tlr5，invitrogen)处理4小时。tlr激活之后，将上清液稀释并转移到预包被的96孔测定板，并且使用人tnf-αelisa试剂盒(invitrogen)根据制造商的说明书测量人tnf-α分泌的水平。
[0223]
实施例1-5：蛋白质电泳
[0224]
将raw 264.7细胞以2
×
106个细胞/孔的密度接种在60mm细胞培养皿中，并且稳定2天，并且进行实验。将细胞用拮抗剂处理，稳定1小时，并且用tlr9激动剂刺激15分钟和30分钟。通过经处理的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(thermo fisher scientific,inc.)以及哺乳动物蛋白提取试剂盒(m-per；thermo fisher scientific,inc.)获得细胞裂解物。所有样品都通过二喹啉甲酸测定(sigma-aldrich,co.)使用softmax pro 5.3软件(molecular devices,inc.)量化。在实验期间，将膜用特异性一抗处理，所述一抗是磷酸化jnk、磷酸化p38-mapk、jnk、erk 1/2、p38-mapk、iκbα(cell signaling technology,inc.,美国马萨诸塞州丹弗斯)、磷酸化erk 1/2和β-肌动蛋白(santa cruz biotechnology,inc.,美国德克萨斯州达拉斯)。然后用hrp缀合的抗兔或抗小鼠igg(thermo fisher scientific,inc.)抗体处理蛋白质，并且使用化学发光底物(supersignal
tm west pico plus,thermo fisher scientific,inc.)和发光检测系统(fusion solo s,法国维尔伯)检测蛋白质水平。
[0225]
实施例1-6：lc
50
(50％致死浓度)、ic
50
(50％抑制浓度)和ti(治疗指数)分析
[0226]
为了绘制浓度依赖性lc
50
曲线，用sk系列配体以不同浓度且最高为200μm(在0.5％dmso水平内可以处理的最高浓度)的浓度进行处理。然后，如实施例1-3中所述，通过mtt分析用配体处理后的细胞活力和毒性反应。将每个图中的细胞活力从阴性对照(100％；未处理)至阳性对照(最高浓度的测试配体)归一化，并且通过非线性回归(graph pad prism 7.0)确定lc
50
。为了绘制浓度依赖性ic
50
曲线，用sk系列配体以不同浓度且最高为50μm(初始浓度的两倍)的浓度进行预处理。如实施例1-4中所述，通过elisa分析由tlr7和tlr9介导
的细胞应答(tnf-α分泌的水平)。将每个图中的细胞因子水平从阴性对照(未处理)至阳性对照(用配体处理)归一化，并且通过非线性回归(graph pad prism 7.0)确定ic
50
。
[0227]
然后，将lc
50
和ic
50
应用于以下函数以计算ti。
[0228][0229]
实施例1-7：统计分析
[0230]
在microsoft excel软件中使用双尾学生t检验进行统计分析。lc
50
和ic
50
的计算用graphpad prism程序进行。
[0231]
实施例2：新型化合物合成
[0232]
实施例2-1：分析和纯化条件
[0233]
1)hplc分析条件(方法a；(a)在上表2中)
[0234]
装置名称：shimadzu
[0235]
柱：ymc-pack pro c18，150x4.6mm内径，5μm，40℃
[0236]
流动相：5％
→
100％乙腈/h2o+0.1％三氟乙酸
[0237]
分析时间：9分钟，流速：1ml/min
[0238]
uv检测器：254nm
[0239]
2)hplc分析条件(方法b；(b)在上表2中)
[0240]
装置名称：thermo scientific ultimate 3000rslc
[0241]
柱：2.6μm联苯100x2.1mm
[0242]
流动相：5％
→
100％乙腈/h2o+0.1％三氟乙酸
[0243]
分析时间：9分钟，流速：0.7ml/min
[0244]
uv检测器：254nm
[0245]
3)lc-ms分析条件
[0246]
装置名称：shimadzu lcms-2020
[0247]
柱：ace excel2 c18,75x2.1mm
[0248]
流动相：乙腈/h2o+0.1％三氟乙酸
[0249]
流速：0.5ml/min
[0250]
uv检测器：254nm
[0251]
4)mplc纯化条件
[0252]
装置名称：
[0253]
uv检测器：254nm
[0254]
5)制备型hplc纯化条件
[0255]
装置名称：gilson gx-281，321泵，uv/vis-155
[0256]
柱：10μm c18(2)250x21.2mm
[0257]
流动相：乙腈/0.1％三氟乙酸h2o
[0258]
流速：15ml/min
[0259]
uv检测器：254nm
[0260]
6)1h nmr
[0261]
装置名称：bruker avance(400mhz)
[0262]
实施例2-2：合成程序
[0263]
[实验例1]n-(1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-基)乙酰胺
[0264][0265]
步骤1：2-氨基-1-(3-(二甲基氨基)丙基)-4,5-二甲基-1h-吡咯-3-甲腈
[0266][0267]
将n1,n1-二甲基丙烷-1,3-二胺(5.68ml，45.4mmol)和3-羟基丁-2-酮(4g，45.4mmol)溶解于甲苯(60ml)中，并且在室温下向其中添加浓盐酸(0.05ml，2.27mmol)。将反应混合物在回流下搅拌1小时，冷却至室温，然后向其中添加丙二腈(3.0g，45.4mmol)。然后，将反应混合物在回流下搅拌1小时。反应完成之后，将混合物冷却至室温并且在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过胺硅胶色谱法(0％-50％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(8.14g，81％，黄色固体)。
[0268]
步骤2：1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺
[0269][0270]
将环庚酮(1.07ml，9.08mmol)溶解于二氯乙烷(25ml)中，然后向其中添加氯化铝(1.21g，9.08mmol)。将所得混合物在室温下搅拌10分钟，向其中添加步骤1中制备的2-氨基-1-(3-(二甲基氨基)丙基)-4,5-二甲基-1h-吡咯-3-甲腈(1.0g，4.54mmol)，并且将反应混合物在回流下搅拌3小时。将所得混合物冷却至室温，向其中滴加碳酸氢钠水溶液以终止反应，并且将产物用盐水洗涤并使用混合溶液(10％甲醇/二氯甲烷)萃取。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过胺硅胶色谱法(0％-30％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(1.1g，77％，淡黄色固体)。
[0271]
步骤3：n-(1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-基)乙酰胺
[0272][0273]
将步骤2中制备的化合物1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺(30mg，0.095mmol)溶解于二氯甲烷(1ml)中，然后在0℃下向其中添加乙酰氯(0.014ml，0.191mmol)和三乙胺(0.027ml，0.191mmol)。然后，将反应混合物在室温下搅拌2小时。向其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应，然后将混合物用二氯甲烷萃取并用蒸馏水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-30％甲醇/二氯甲烷)纯化以获得目标化合物(10.2mg，30％，淡黄色固体)。
[0274]1h nmr(400mhz,meod)δ4.24(t,j＝7.3hz,2h),3.14-3.05(m,2h),2.84-2.76(m,2h),2.39(dd,j＝9.7,5.5hz,2h),2.36(s,3h),2.25(d,j＝4.1hz,8h),2.21(s,3h),1.97-1.83(m,4h),1.76-1.61(m,4h)；357[m+h]
+
；lcms,m/z 612[m+h]
+
；hplc t
r 4.105min(方法a)。
[0275]
[实验例2]目标化合物(n-(1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-基)-2,2,2-三氟乙酰胺)是以与实验例1类似的方式获得的。
[0276]
[实验例3、4和5]目标化合物(1-(3-(苄基(甲基)氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺；2,3-二甲基-1-(3-(甲基氨基)丙基)-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺；3-(4-氨基-2,3-二甲基-6,7,8,9-四氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-1(5h)-基)-n,n-二甲基丙酰胺)是以与上述实验例1的步骤1至2类似的方式获得的。
[0277]
[实验例6]n-乙酰基-n-(1-(3-(苄基(甲基)氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-基)乙酰胺
[0278][0279]
将以与上述实验例1的步骤1至2类似的方式制备的1-(3-(苄基(甲基)氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺(50mg，0.128mmol)溶解于二氯甲烷(3ml)中，随后在0℃下添加乙酰氯(0.037ml，0.512mmol)和三乙胺(0.036ml，0.256mmol)。然后，将反应混合物在室温下搅拌1小时。向其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应，并且将混合物用二氯甲烷萃取并用蒸馏水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过胺硅胶色谱法
(0％-20％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(7.0mg，11.5％，黄色固体)。
[0280]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.35-7.26(m,5h),4.23(t,j＝7.4hz,2h),3.63(s,2h),3.13-3.07(m,2h),2.70-2.59(m,2h),2.56(t,j＝7.2hz,2h),2.31(s,3h),2.27(s,6h),2.07(s,3h),2.04(s,3h),2.02-1.98(m,2h),1.86-1.80(m,2h),1.75-1.69(m,2h),1.64-1.59(m,2h)；lcms,m/z 475[m+h]
+
；hplc t
r 5.641min(方法a)。
[0281]
[实验例7]目标化合物(3-(4-乙酰氨基-2,3-二甲基-6,7,8,9-四氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-1(5h)-基)-n,n-二甲基丙酰胺)是以与上述实验例1类似的方式获得的。
[0282]
[实验例8]目标化合物(3-(4-(n-乙酰基乙酰氨基)-2,3-二甲基-6,7,8,9-四氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-1(5h)-基)-n,n-二甲基丙酰胺)是以与上述实验例6类似的方式获得的。
[0283]
[实验例9]1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2-甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺
[0284][0285]
步骤1：2-(2-氧代丙基)丙二腈
[0286][0287]
将丙二腈(4.4g，66.60mmol)溶解于四氢呋喃(100ml)中，然后在0℃下向其中添加1m叔丁醇钾(在四氢呋喃中)(66ml，66.60mmol)的溶液。将所得混合物搅拌30秒，向其中添加1-(氯丙)-2-酮(4.7ml，59.03mmol)，随后搅拌30秒。反应完成之后，在0℃下向其中滴加蒸馏水以终止反应，将产物用盐水洗涤并用二氯甲烷萃取。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-20％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(2.7g，33％，白色固体)。
[0288]
步骤2：2-氨基-1-(3-(二甲基氨基)丙基)-5-甲基-1h-吡咯-3-甲腈
[0289][0290]
将步骤1中制备的2-(2-氧代丙基)丙二腈(1.25g，10.23mmol)溶解于乙醇(10ml)中，在室温下向其中添加浓盐酸(3滴)，并且向其中进一步添加n,n-二甲基丙-1,3-二胺(0.7ml，10.23mmol)。将反应混合物在回流下搅拌2小时。反应完成之后，在0℃下向其中滴加蒸馏水以终止反应，并且将产物用盐水洗涤并用二氯甲烷萃取。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-50％乙
酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(400mg，31％，白色固体)。
[0291]
步骤3：1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2-甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺
[0292][0293]
将环庚酮(0.33ml，2.76mmol)溶解于甲苯(3ml)中，然后向其中添加氯化铝(368mg，2.76mmol)。将混合物在室温下搅拌10分钟，向其中添加上述步骤2中制备的2-氨基-1-(3-(二甲基氨基)丙基)-5-甲基-1h-吡咯-3-甲腈(285mg，1.38mmol)，并且将反应混合物在回流下搅拌2小时。将混合物冷却至室温，并且向其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应，并且将产物用盐水洗涤并用二氯甲烷萃取。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-100％乙酸乙酯混合溶液(1％三乙胺))纯化以获得目标化合物(315mg，75％，黄色浆状物)。
[0294]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.96(s,1h),4.19(t,j＝7.2hz,2h),4.11(s,2h),3.02-2.99(m,2h),2.70-2.66(m,2h),2.40(s,3h),2.30(t,j＝7.2hz,2h),2.22(s,6h),1.97-1.91(m,2h),1.89-1.75(m,2h),1.70-1.60(m,6h)；lcms,m/z 301[m+h]
+
；hplc t
r 4.144min(方法a)。
[0295]
[实验例10]目标化合物(n-(1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-基)-2,2-二氟丙酰胺)是以与实验例1类似的方式获得的。
[0296]
[实验例11]3-溴-1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2-甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺
[0297][0298]
步骤1：3-溴-1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2-甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺
[0299][0300]
将上述实验例9的步骤3中制备的1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2-甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺(65mg，0.21mmol)溶解于乙腈中，并且在0℃下向其中添加n-溴琥珀酰亚胺(46mg，0.25mmol)，随后在0℃下搅拌1小时。反应完成之后，将反应混合物在二氯乙烷中稀释，并且过滤固体。将滤液浓缩，然后将其分离并通过制备型hplc(0.1％三氟乙酸h2o/乙腈)纯化。将获得的三氟乙酸盐化合物用碳酸氢钠的过饱和水溶液中和以获得目标化合物(9mg，11％，黄色固体)。
[0301]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ4.86(s,2h),4.20(t,j＝7.3hz,2h),2.98-2.96(m,2h),2.63-2.60(m,2h),2.35(s,3h),2.28(t,j＝7.3hz,2h),2.21(s,6h),1.92-1.81(m,4h),1.70-1.59(m,4h)；lcms,m/z 380[m+h]
+
；hplc t
r 4.215min(方法a)。
[0302]
[实验例12、13]目标化合物(3-氯-1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2-甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺；1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-碘-2-甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺)是以与实验例9的步骤1至2类似的方式获得的。
[0303]
[实验例14、15、16、17、18]目标化合物(1-(3-甲氧基丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺；1-(2-甲氧基乙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7,8,9-六氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺；1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3-二甲基-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺；1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3-二甲基-1,5,6,7-四氢环戊二烯并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺；1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3-二甲基-6-苯基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-胺)是以与实验例1的步骤1至2类似的方式获得的。
[0304]
[实验例19]1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2-甲基-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺
[0305][0306]
步骤1：1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2-甲基-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺
[0307][0308]
将环己酮(50μl，0.48mmol)溶解于甲苯(1ml)中，然后向其中添加氯化铝(64mg，0.48mmol)。将混合物在室温下搅拌10分钟，向其中添加上述步骤2中制备的2-氨基-1-(3-(二甲基氨基)丙基)-5-甲基-1h-吡咯-3-甲腈(285mg，1.38mmol)，并且将反应混合物在回流下搅拌2小时。将混合物冷却至室温，向其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应，并且将产物用盐水洗涤并用二氯甲烷萃取。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将获得的残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-100％乙酸乙酯混合溶液(1％三乙胺)/己烷)纯化以获得目标化合物(28mg，40％，白色固体)。
[0309]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.97(s,1h),4.18(t,j＝7.3hz,2h),4.10(s,2h),2.93-2.90(m,2h),2.56-2.53(m,2h),2.40(s,3h),2.29(t,j＝7.3hz,2h),2.21(s,6h),1.97-1.86(m,6h)；lcms,m/z 287[m+h]
+
；hplc t
r 4.022min(方法a)。
[0310]
[实验例20、21]目标化合物(1-(3-(二甲基氨基)丙基)-6-乙基-2,5-二甲基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-胺；1-(3-(二甲基氨基)丙基)-2-甲基-5,6,7,8,9,10-六氢-1h-环辛并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺)是以与实验例19的步骤1类似的方式获得的。
[0311]
[实验例22]1-(2-(二甲基氨基)乙基)-2-甲基-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺
[0312][0313]
步骤1：2-氨基-1-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-甲基-1h-吡咯-3-甲腈
[0314][0315]
将在实验例9的步骤2中制备的2-(2-氧代丙基)丙二腈(1g，8.2mmol)溶解于乙醇(5ml)中，在室温下向其中添加浓盐酸(3滴)，并且向其中进一步添加n,n-二甲基乙烷-1,3-二胺(1.07ml，9.84mmol)。将反应混合物在回流下搅拌2小时。反应完成之后，在0℃下滴加蒸馏水以终止反应，并且将产物用盐水洗涤并用二氯甲烷萃取。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-50％乙酸
1-基)乙酰氨基)-n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-n-甲基-3-苯基丙酰胺
[0326][0327]
步骤1：(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯
[0328][0329]
使用与参考文献[专利wo 2012/65062a(2012.05.18；第49页)]类似的方法获得(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1.2g，80％，黄色油)
[0330]
步骤2：2-氨基-n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-n-甲基-3-苯基丙酰胺
[0331][0332]
将上述步骤1中制备的(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1.2g，3.01mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，然后在室温下添加三氟乙酸(5ml，64.9mmol)。将反应混合物搅拌1小时。反应完成之后，将混合物在减压下浓缩，不经另外的纯化以获得以三氟乙酸盐形式的目标化合物(1.24g，100％，棕色油)。
[0333]
步骤3：n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(2-溴乙酰氨基)-n-甲基-3-苯基丙酰胺
[0334][0335]
将在上述步骤2中制备的2-氨基-n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-n-甲基-3-苯基丙酰胺(0.5g，1.676mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，并且在0℃下向其中添加n,n-二异丙基乙胺(0.878ml，5.028mmol)和溴乙酰溴(1.015g，5.03mmol)。在0℃下搅拌混合物30分钟，然后将反应混合物在室温下搅拌1小时。反应完成之后，将混合物用蒸馏水稀释并用乙酸乙酯萃取。将萃取的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。
将获得的残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-60％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(0.27g，38％，淡黄色固体)。
[0336]
步骤4：2-(2-(4-氨基-2,3-二甲基-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-1-基)乙酰氨基)-n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-n-甲基-3-苯基丙酰胺
[0337][0338]
将以与上述实验例1的步骤1至2类似的方式制备的2,3-二甲基-5,6,7,8,9,10-六氢-1h-环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺(30mg，0.123mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1ml)中，并且在0℃下向其中添加氢化钠(5.92mg，0.247mmol)，随后搅拌1小时。然后，向其中添加以与上述步骤3类似的方式制备的n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(2-溴乙酰氨基)-n-甲基-3-苯基丙酰胺(51.7mg，0.123mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，然后在0℃下向其中滴加冰水以终止反应。将反应产物用乙酸乙酯萃取，然后用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过制备型hplc(0.1％三氟乙酸h2o/乙腈)纯化。将获得的三氟乙酸盐化合物用碳酸氢钠的过饱和水溶液中和以获得目标化合物(15.8mg，23％，象牙色固体)。
[0339]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.19-7.10(m,3h),6.83(br s,2h),6.68(d,j＝8.0hz,1h),5.98(s,2h),4.88-4.74(m,2h),4.65(q,j＝7.0hz,1h),3.10(s,3h),3.07-2.94(m,2h),2.92-2.81(m,1h),2.77-2.63(m,3h),2.36(s,3h),2.19(s,3h),1.74-1.58(m,4h),1.49-1.40(m,2h),1.37-1.28(m,2h)；lcms,m/z 582[m+h]
+
；hplc t
r 5.808min(方法a)。
[0340]
[实验例26、27]目标化合物(2-(2-(4-氨基-2,3-二甲基-5,6,7,8,9,10-六氢-1h-环辛并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-1-基)乙酰氨基)-n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-n-甲基-3-苯基丙酰胺；2-(2-(4-氨基-2,3-二甲基-6,7,8,9-四氢环庚并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-1(5h)-基)乙酰氨基)-n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-n-甲基-3-苯基丙酰胺)是以与实验例25类似的方式获得的。
[0341]
[实验例28]n-(3-(11-氨基-1,2,3,4-四氢-6h-吲哚并[2,3-b]喹啉-6-基)丙基)-5-甲基-3-苯基异噁唑-4-甲酰胺
[0342][0343]
步骤1：n-(3-氯丙基)-5-甲基-3-苯基异噁唑-4-甲酰胺
[0344][0345]
将5-甲基-3-苯基异噁唑-4-甲酸(0.5g，2.461mmol)溶解于二甲基甲酰胺(7ml)中，并且向其中添加3-氯丙-1-胺盐酸盐(0.416g，3.20mmol)、edci(0.708g，3.69mmol)和dmap(0.15g，1.23mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。反应完成之后，将混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤，并且将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-10％甲醇/二氯甲烷)纯化以获得目标化合物(0.27g，39％，白色固体)。
[0346]
步骤2：2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0347][0348]
以与参考文献[yang,xiaobo等人,advanced synthesis and catalysis,2010,第352卷,#6,第1035-1038页]类似的方式获得2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(0.25g，33％，黄色固体)。
[0349]
步骤3：n-(3-(11-氨基-1,2,3,4-四氢-6h-吲哚并[2,3-b]喹啉-6-基)丙基)-5-甲基-3-苯基异噁唑-4-甲酰胺
[0350][0351]
将步骤2中制备的2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(30mg，0.126mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1ml)中，然后在0℃下向其中添加氢氧化钠(10.1mg，0.253mmol)。将混合物搅拌1小时，然后向其中添加上述步骤1中制备的n-(3-氯丙基)-5-甲基-3-苯基异噁唑-4-甲酰胺(35.2mg，0.126mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。在0℃下向混合物中滴加冰水以终止反应，随后用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过制备型hplc(0.1％三氟乙酸h2o/乙腈)纯化。将获得的三氟乙酸盐化合物用碳酸氢钠的过饱和水溶液中和以获得目标化合物(6.6mg，11％，白色固体)。
[0352]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.68(t,j＝6.0hz,1h),7.81-7.73(m,3h),7.46-7.37(m,4h),7.33(d,j＝8.0hz,1h),7.25-7.19(m,1h),4.70(br s,2h),4.12-4.03(m,2h),3.14(dd,j＝11.8,6.1hz,2h),2.67(s,3h),2.53(t,j＝6.2hz,2h),2.42(t,j＝6.2hz,2h),2.02-1.94(m,2h),1.89-1.82(m,2h),1.79-1.72(m,2h)；lcms,m/z 480[m+h]
+
；hplc t
r 5.561min(方法a)。
[0353]
[实验例29]2,3-二甲基-1-(2-硝基苄基)-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹
b]喹啉-11-胺
[0363][0364]
步骤1：n-(2-溴-4-甲氧基苯基)-2,2,2-三氟乙酰胺
[0365][0366]
将2-溴-4-甲氧基苯胺(10g，49.49mmol)溶解于二氯甲烷(30ml)中，然后在0℃下向其中缓慢添加三乙胺(13.8ml，98.98mmol)和三氟乙酸酐(7.6ml，54.44mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟。将碳酸氢钠的过饱和水溶液缓慢滴加到混合物中以终止反应，随后用二氯甲烷萃取并用蒸馏水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩以获得目标化合物(15.6g，100％，棕色固体)。
[0367]
步骤2：2-氨基-5-甲氧基-1h-吲哚-3-甲腈
[0368][0369]
将步骤1中制备的n-(2-溴-4-甲氧基苯基)-2,2,2-三氟乙酰胺(1g，3.35mmol)溶解于二甲亚砜在蒸馏水(1/1)中的溶液(10ml)中，并充入n2气体，向其中添加丙二腈(266mg，4.02mmol)，然后添加碳酸钾(924mg，6.7mmol)、n-脯氨酸(77mg，0.67mmol)和碘化铜(63mg，0.033mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌15小时。反应完成之后，将混合物冷却至室温，并通过硅藻土过滤。将滤液在减压下浓缩，用蒸馏水稀释，用乙酸乙酯萃取，并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将获得的残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-50％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(412mg，65％，灰色固体)。
[0370]
步骤3：9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0371][0372]
将环己酮(1.2ml，11.05mmol)溶解于二氯乙烷(7ml)中，然后向其中添加氯化铝(1.47g，11.05mmol)。然后，向其中添加步骤2中制备的2-氨基-5-甲氧基-1h-吲哚-3-甲腈(1.38g，7.37mmol)，并且将反应混合物在回流下搅拌5小时。将混合物冷却至室温，并且向
其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应，随后用10％甲醇/二氯甲烷混合溶液萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-50％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(1.61g，81％，白色固体)。
[0373]
步骤4：6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0374][0375]
将步骤3中制备的9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(1g，3.74mmol)溶解于二甲基甲酰胺(7ml)中，然后在0℃下向其中添加氢氧化钠(500mg，18.7mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后向其中添加3-溴-n,n-二甲基丙-1-胺氢溴酸盐(1.3g，7.48mmol)。允许反应混合物缓慢温热至室温，然后使其反应15小时。在0℃下向混合物中滴加冰水以终止反应，并且将混合物用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(0％-100％乙酸乙酯混合溶液(1％三乙胺)/己烷)纯化以获得目标化合物(695mg，53％，黄色固体)。
[0376]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.36(d,j＝8.8hz,1h),7.33(s,1h),7.04(dd,j＝8.8hz,2.0hz,1h),4.66(s,2h),4.41(t,j＝7.0hz,2h),3.92(s,3h),2.98-2.95(m,2h),2.62-2.59(m,2h),2.45-2.41(m,2h),2.30(s,6h),2.10-1.89(m,6h)；lcms,m/z 353[m+h]
+
；hplc tr4.276min(方法a)。
[0377]
[实验例31]目标化合物(12-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-甲氧基-6,12-二氢-5h-苯并[h]吲哚并[2,3-b]喹啉-7-胺)是以与上述实验例30的步骤3类似的方式获得的。
[0378]
[实验例32]目标化合物(6-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺)是以与上述实验例30类似的方式获得的。
[0379]
[实验例33]目标化合物(6-苄基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺)是以与实验例28的步骤3类似的方式获得的。
[0380]
[实验例34]9-甲氧基-6-(3-(甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0381][0382]
步骤1：(3-(11-氨基-9-甲氧基-1,2,3,4-四氢-6h-吲哚并[2,3-b]喹啉-6-基)丙
基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
[0383][0384]
将上述实验例30的步骤3中制备的9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(50mg，0.18mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1ml)中，然后在0℃下向其中添加氢氧化钠(15mg，0.37mmol)。将反应产物搅拌30分钟，然后向其中添加(3-溴丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯氢溴酸盐(58mg，0.28mmol)。将反应混合物缓慢温热至室温，并且搅拌3小时。在0℃下向混合物中滴加冰水以终止反应，然后将混合物用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(0％-100％乙酸乙酯混合溶液(1％三乙胺)/己烷)纯化以获得目标化合物(47mg，57％，白色固体)。
[0385]
步骤2：9-甲氧基-6-(3-(甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0386][0387]
将上述步骤1中制备的(3-(11-氨基-9-甲氧基-1,2,3,4-四氢-6h-吲哚并[2,3-b]喹啉-6-基)丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(47mg，0.10mmol)溶解于二氯甲烷(1ml)中，并且在室温下向其中添加三氟乙酸(200μl)，随后搅拌2小时。反应完成之后，将反应产物用碳酸氢钠的过饱和水溶液中和，用二氯甲烷萃取，并用水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩以获得目标化合物(39mg，99％，白色固体)。
[0388]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.35(d,j＝2.3hz,1h),7.30(d,j＝8.8hz,1h),7.05(dd,j＝8.8,2.3hz,1h),4.68(s,2h),4.43(t,j＝6.4hz,2h),3.92(s,3h),2.94(t,j＝5.9hz,2h),2.60(t,j＝5.9hz,2h),2.48(t,j＝6.4hz,2h),2.41(s,3h),2.14-2.04(m,2h),1.97-1.84(m,4h)；lcms,m/z 339[m+h]
+
；hplc t
r 4.271min(方法a)。
[0389]
[实验例35]目标化合物(6-(3-(甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺)是以与实验例34类似的方式获得的。
[0390]
[实验例36]9-甲氧基-6-(4-甲基戊-3-烯-1-基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0391][0392]
步骤1：9-甲氧基-6-(4-甲基戊-3-烯-1-基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0393][0394]
将上述实验例30的步骤3中制备的9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(30mg，0.11mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1ml)中，然后在0℃下向其中添加氢氧化钠(20mg，0.44mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后向其中添加5-溴-2-甲基戊-2-醇(22mg，0.13mmol)。将反应混合物缓慢温热至室温，然后搅拌5小时。在0℃下向混合物中滴加冰水以终止反应，然后将混合物用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将获得的残余物通过硅胶色谱法(0％-100％乙酸乙酯混合溶液(1％三乙胺)/己烷)纯化以获得目标化合物(4mg，12％，白色固体)。
[0395]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.35(d,j＝2.3hz,1h),7.30(d,j＝8.7hz,1h),7.03(dd,j＝8.7,2.3hz,1h),5.23(t,j＝7.3hz,1h),4.61(s,2h),4.37-4.27(m,2h),3.92(s,3h),2.99(d,j＝5.8hz,2h),2.61(t,j＝5.8hz,2h),2.63-2.45(m,2h),1.95-1.90(m,4h),1.64(s,3h),1.53(s,3h)；lcms,m/z 350[m+h]
+
；hplc t
r 4.350min(方法a)。
[0396]
[实验例37]4-(11-氨基-9-甲氧基-1,2,3,4-四氢-6h-吲哚并[2,3-b]喹啉-6-基)丁酸乙酯
[0397][0398]
步骤1：4-(11-氨基-9-甲氧基-1,2,3,4-四氢-6h-吲哚并[2,3-b]喹啉-6-基)丁酸乙酯
[0399][0400]
将上述实验例30的步骤3中制备的9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(100mg，0.39mmol)溶解于二甲基甲酰胺(3ml)中，并且在0℃下向其中添加氢氧化钠(30mg，0.74mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后向其中添加4-溴丁酸乙酯(102mg，0.56mmol)。将反应混合物缓慢温热至室温，然后搅拌3小时。在0℃下向混合物中滴加冰水以终止反应，然后将混合物用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。获得的残余物通过硅胶色谱法(0％-100％乙酸乙酯混合溶液(1％三乙胺)/己烷)纯化以获得目标化合物(18mg，12％，白色固体)。
[0401]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.35(s,1h),7.34(d,j＝8.7hz,2h),7.04(d,j＝8.7hz,1h),4.62(s,2h),4.42(t,j＝6.9hz,2h),4.10(q,j＝6.9hz,2h),3.92(s,3h),2.96(t,j＝5.8hz,2h),2.61(t,j＝5.8hz,2h),2.32(q,j＝7.3hz,2h),2.35-2.15(m,2h),2.00-1.90(m,4h),1.23(t,j＝7.3hz,3h)；lcms,m/z 382[m+h]
+
；hplc t
r 5.430min(方法a)。
[0402]
[实验例38]6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-甲基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0403][0404]
步骤1：n-(2-溴-4-甲基苯基)-2,2,2-三氟乙酰胺
[0405][0406]
将2-溴-4-甲基苯胺(1g，5.37mmol)溶解于二氯乙烷中，然后在0℃下向其中添加三乙胺(1.5ml，10.75mmol)和三氟乙酸酐(0.91ml，6.45mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌30分钟，并且在室温下搅拌2小时。将混合物冷却至0℃，并且缓慢滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应。然后，将反应产物用二氯甲烷萃取并用蒸馏水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，并且将获得的残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-5％甲醇/二氯甲烷)纯化以获得目标化合物(1.25g，82％，象牙色固体)。
[0407]
步骤2：2-氨基-5-甲基-1h-吲哚-3-甲腈
[0408][0409]
将步骤1中制备的n-(2-溴-4-甲氧基苯基)-2,2,2-三氟乙酰胺(1.25g，4.43mmol)溶解于二甲亚砜在蒸馏水(1/1)中的溶液中，并充入n2气体，向其中添加丙二腈(266mg，4.02mmol)，然后添加丙二腈(0.35g，5.32mmol)、碳酸钾(1.225g，8.86mmol)、n-脯氨酸(0.102g，0.886mmol)和碘化铜(0.084g，0.443mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌4小时。反应完成之后，将混合物冷却至室温，并通过硅藻土过滤。将滤液在减压下浓缩，用蒸馏水稀释，用乙酸乙酯萃取，并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将获得的残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-10％甲醇/二氯甲烷)纯化以获得目标化合物(0.75g，95％，深黄色固体)。
[0410]
步骤3：9-甲基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0411][0412]
将环己酮(0.665ml，6.43mmol)溶解于二氯乙烷(10ml)中，然后向其中添加氯化铝(1.07g，8.03mmol)。然后，向其中添加步骤2中制备的2-氨基-5-甲氧基-1h-吲哚-3-甲腈(0.55g，3.21mmol)，并且将反应混合物在回流下搅拌5小时。将混合物冷却至室温，并且向其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应，随后用10％甲醇/二氯甲烷混合溶液萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-5％甲醇/二氯甲烷)纯化以获得目标化合物(0.65g，89％，黄色固体)。
[0413]
步骤4：6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-甲基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺
[0414][0415]
将步骤3中制备的9-甲基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(40mg，0.159mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1ml)中，然后在0℃下向其中添加氢氧化钠(9.5mg，0.179mmol)。将反应混合物搅拌1小时，然后向其中添加3-氯-n,n-二甲基丙基-1-胺盐酸盐(0.03g，0.191mmol)。允许反应混合物缓慢温热至室温，随后搅拌1小时。另外，向其中添加氢氧化钠(6.4mg，0.159mmol)，随后搅拌16小时。在0℃下向混合物中滴加冰水以终止反应，并且将混合物用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(0％-80％乙酸乙酯混合溶液(10％氨水)/己烷)纯化以获得目标化合物(33.6mg，63％，黄色固体)。
[0416]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.61(s,1h),7.34(d,j＝8.2hz,1h),7.22(d,j＝8.2hz,1h),4.68(s,2h),4.44(t,j＝6.9hz,2h),2.98(t,j＝5.8hz,2h),2.77(s,2h),2.61(t,j＝5.9hz,2h),2.53(s,3h),2.46(t,j＝7.0hz,2h),2.31(s,6h),2.16-2.05(m,2h),1.99-1.85(m,4h)；lcms,m/z 337[m+h]
+
；hplc t
r 4.354min(方法a)。
[0417]
[实验例39、40、41、42、43、44、45]目标化合物(6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-氟-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺；9-氯-6-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺；6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-(三氟甲氧基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺；11-氨基-6-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-9-甲腈；6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-(三氟甲基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺；11-氨基-6-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-9-甲酸甲酯；6-(3-(二甲基氨基)丙基)-8-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺)是以与实验例38类似的方式获得的。
[0418]
[实验例46]1-((6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-基)氨基)丙-2-醇
[0419][0420]
步骤1：1-((6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-基)氨基)丙-2-醇
[0421][0422]
将实验例30中制备的6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(50mg，0.15mmol)溶解于2-甲基环氧乙烷(2ml，过量)中，并且向其中添加高氯酸锂(160mg，1.61mmol)，随后在50℃下搅拌2小时。反应完成之后，将反应产物冷却至室温，然后在减压下浓缩。将残余物分离并通过制备型hplc(0.1％三氟乙酸h2o/乙腈)纯化。将获得的三氟乙酸盐化合物用碳酸氢钠的过饱和水溶液中和以获得目标化合物(35mg，60％，白色固体)。
[0423]1h nmr(400mhz,dmso)δ7.88(d,j＝2.2hz,1h),7.45(d,j＝8.9hz,1h),6.96(dd,j＝8.9,2.2hz,1h),6.13(s,2h),5.58(s,1h),4.35-4.20(m,2h),4.17(s,1h),3.85(s,3h),
3.06(d,j＝6.4hz,6h),2.85-2.75(m,2h),1.90-1.75(m,4h),1.06(d,j＝6.3hz,3h)；lcms,m/z 411[m+h]
+
；hplc t
r 4.255min(方法a)。
[0424]
[实验例47、48]目标化合物(11-氨基-6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-1-酮；11-氨基-6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-甲氧基-3-苯基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-1-酮)是以与实验例38类似的方式获得的。
[0425]
[实验例49、50]目标化合物(9-(苄氧基)-6-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚[2,3-b]喹啉-11-胺；6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-异丙氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺)是以与实验例30类似的方式获得的。
[0426]
[实验例51]11-氨基-6-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-9-醇
[0427][0428]
步骤1：11-氨基-6-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-9-醇
[0429][0430]
将上述实验例50中制备的6-(3-(二甲基氨基)丙基)-9-异丙氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(50mg，0.13mmol)溶解于二氯甲烷(1ml)中，添加氯化铝(87mg，0.65mmol)，并且将混合物在室温下搅拌3小时。反应完成之后，向其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应。将反应混合物用二氯甲烷萃取，然后用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-20％甲醇/二氯甲烷)纯化以获得目标化合物(22mg，50％，白色固体)。
[0431]1h nmr(400mhz,dmso)δ8.80(s,1h),7.62(d,j＝2.2hz,1h),7.24(d,j＝8.6hz,1h),6.82(dd,j＝8.6,2.2hz,1h),5.87(s,2h),4.23(t,j＝7.0hz,2h),3.40-3.10(m,4h),2.80-2.75(m,2h),2.71-2.18(t,j＝7.0hz,2h),2.11(s,6h),1.87-1.71(m,4h)；lcms,m/z339[m+h]
+
；hplc t
r 3.975min(方法a)。
[0432]
[实验例52]n1-(7-(3-(二甲基氨基)丙基)-9,10,11,12-四氢-7h-苯并[4,5]吲哚并[2,3-b]喹啉-13-基)-n3,n3-二甲基丙-1,3-二胺
2-酮
[0439][0440]
将上述实验例30的步骤3中制备的9-甲氧基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺(80mg，0.29mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1ml)中，并且在0℃下向其中添加氢氧化钠(20mg，1.45mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后向其中添加5-溴戊-2-酮(239mg，1.45mmol)。将反应混合物缓慢温热至室温，并且搅拌7小时。在0℃下向混合物中滴加冰水以终止反应，然后将混合物用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-50％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(22mg，黄色固体)。
[0441]
步骤2：5-(11-氨基-9-甲氧基-1,2,3,4-四氢-6h-吲哚并[2,3-b]喹啉-6-基)-2-甲基戊-2-醇
[0442][0443]
将上述步骤1中制备的5-(11-氨基-9-甲氧基-1,2,3,4-四氢-6h-吲哚并[2,3-b]喹啉-6-基)戊-2-酮(9mg，0.02mmol)溶解于乙醚(1ml)中，并且向其中添加3m溴化甲基镁(在乙醚中)溶液(100μl，过量)，随后在室温下搅拌5小时。反应完成之后，向其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应。然后，将反应产物用二氯甲烷萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩，并且将所得残余物分离并通过制备型hplc(0.1％三氟乙酸h2o/乙腈)纯化。将获得的三氟乙酸盐化合物用碳酸氢钠的过饱和水溶液中和以获得目标化合物(1mg，12％，白色固体)。
[0444]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.36(d,j＝2.3hz,1h),7.30(d,j＝8.8hz,1h),7.05(dd,j＝8.8,2.3hz,1h),4.70(s,2h),4.57(t,j＝6.3hz,2h),3.92(s,3h),2.98(t,j＝6.0hz,2h),2.61(t,j＝6.0hz,2h),2.05-1.85(m,6h),1.40-1.34(m,2h),1.19(s,6h)；lcms,m/z368[m+h]
+
；hplc t
r 5.251min(方法a)。
[0445]
[实验例54]目标化合物(7-(3-(二甲基氨基)丙基)-9,10,11,12-四氢-7h-苯并[4,5]吲哚并[2,3-b]喹啉-13-胺)是以与实验例30类似的方式获得的。
[0446]
[实验例55]2,3-二甲基-1-(3-(甲基氨基)丙基)-5,6,7,8,9,10-六氢-1h-环辛并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺
[0447][0448]
步骤1：2,3-二甲基-5,6,7,8,9,10-六氢-1h-环辛并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺
[0449][0450]
将2-氨基-4,5-二甲基-1h-吡咯-3-甲腈(1g，7.39mmol)溶解于二氯乙烷(5ml)中，并且向其中添加环辛酮(1.46ml，11.09mmol)和氯化铝(1.48g，11.09mmol)。将反应混合物在回流下搅拌15小时，然后冷却至室温，并且向其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应。然后，将反应产物用二氯甲烷萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，并且将获得的残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-10％甲醇/二氯甲烷)纯化以获得目标化合物(718mg，39％，棕色固体)。
[0451]
步骤2：(3-(4-氨基-2,3-二甲基-5,6,7,8,9,10-六氢-1h-环辛并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-1-基)丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
[0452][0453]
将步骤1中制备的2,3-二甲基-5,6,7,8,9,10-六氢-1h-环辛并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺(100mg，0.41mmol)溶解于二甲基甲酰胺(2ml)中，然后在0℃下向其中添加氢氧化钠(24mg，0.61mmol)。将所述混合物在0℃下搅拌30分钟，并且向其中添加(3-氯丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(127mg，0.61mmol)。将混合物在室温下搅拌15小时，然后冷却至0℃，并且向其中滴加冰水以终止反应。将反应产物用二氯甲烷萃取并用蒸馏水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，并且将获得的残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-100％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(52mg，30％，棕色油)。
[0454]
步骤3：2,3-二甲基-1-(3-(甲基氨基)丙基)-5,6,7,8,9,10-六氢-1h-环辛并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-4-胺
[0455][0456]
将步骤2中制备的(3-(4-氨基-2,3-二甲基-5,6,7,8,9,10-六氢-1h-环辛并[b]吡咯并[3,2-e]吡啶-1-基)丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(52mg，0.125mmol)溶解于二氯甲烷(1ml)中，在室温下向其中添加三氟乙酸(200μl)，并且将混合物在室温下搅拌2小时。反应完成之后，向其中添加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应，并且将混合物用二氯甲烷萃取并用盐水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩以获得目标化合物(39mg，99％，棕色浆状物)。
[0457]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ4.60(s,2h),4.26-4.15(m,2h),2.88-2.79(m,2h),2.81-2.65(m,4h),2.61(s,3h),2.42(s,3h),2.26(s,3h),2.24-2.15(m,2h),1.80-1.64(m,4h),1.50-1.45(m,2h),1.37-1.28(m,2h)；lcms,m/z 315[m+h]
+
；hplc t
r 4.446min(方法a)。
[0458]
[实验例56]1-异丁基-2,3-二甲基-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺
[0459][0460]
将在实验例29的步骤1制备中的2,3-二甲基-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺(50mg，0.23mmol)溶解于二氯乙烷(1ml)中，并且在0℃下向其中添加氢氧化钠(14mg，0.34mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后向其中添加1-溴-2-甲基丙烷(37μl，0.34mmol)。将混合物温热至室温，然后搅拌15小时。将混合物冷却至0℃，并且滴加冰水以终止反应。然后，将反应产物用二氯甲烷萃取并用蒸馏水洗涤。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，并且将获得的残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-50％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得目标化合物(22mg，35％，白色固体)。
[0461]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ4.31(s,2h),3.91(d,j＝7.6hz,2h),2.88(t,j＝6.0hz,2h),2.50(t,j＝6.0hz,2h),2.42(s,3h),2.26(s,3h),2.25-2.15(m,1h)1.93-1.78(m,4h),0.86(d,j＝6.7hz,6h)；lcms,m/z 272[m+h]
+
；hplc t
r 5.419min(方法a)。
[0462]
[实验例57]目标化合物(2,3-二甲基-1-(吡啶-2-基甲基)-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺)是以与实验例56类似的方式获得的。
[0463]
[实验例58]目标化合物(10-(3-(二甲基氨基)丙基)-8,9-二甲基-6,10-二氢-5h-苯并[h]吡咯并[2,3-b]喹啉-7-胺)是以与实验例29类似的方式获得的。
[0464]
[实验例59]2,3-二甲基-1-苯基-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺
[0465][0466]
步骤1：2-氨基-4,5-二甲基-1-苯基-1h-吡咯-3-甲腈
[0467][0468]
将3-羟基丁-2-酮(2g，22.69mmol)和苯胺(2.03ml，22.69mmol)溶解于甲苯(30ml)中，然后向其中添加对甲苯磺酸(100mg，1.55mmol)。将反应混合物在回流下搅拌2小时并且冷却至室温，然后向其中添加丙二腈(1.5g，22.69mmol)。然后将反应混合物在回流下搅拌15小时。反应完成之后，将混合物冷却至室温并在减压下浓缩，并且将所得残余物分离并通过硅胶色谱法(0％-100％二氯甲烷/己烷)纯化以获得目标化合物(450mg，9％，棕色固体)。
[0469]
步骤2：2,3-二甲基-1-苯基-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺
[0470][0471]
将环己酮(48μl，0.47mmol)溶解于二氯乙烷(1ml)中，然后向其中添加氯化铝(63mg，0.47mmol)。将混合物在室温下搅拌10分钟，向其中进一步添加步骤1中制备的2-氨基-4,5-二甲基-1-苯基-1h-吡咯-3-甲腈(50mg，0.23mmol)，并且将反应混合物在回流下搅拌15小时。将混合物冷却至室温，向其中滴加碳酸氢钠的过饱和水溶液以终止反应，并且将反应产物用盐水洗涤并用二氯甲烷萃取。将萃取的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。将所得残余物分离并通过制备型hplc(0.1％三氟乙酸h2o/乙腈)纯化。将获得的三氟乙酸盐化合物用碳酸氢钠的过饱和水溶液中和以获得目标化合物(7mg，11％，棕色固体)。
[0472]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.47(dd,j＝7.6,7.6hz,2h),7.42-7.30(m,3h),4.40(s,2h),2.79(t,j＝6.2hz,2h),2.57-2.43(m,2h),2.49(s,3h),2.13(s,3h),1.90-1.77(m,6h)；lcms,m/z 292[m+h]
+
；hplc t
r 5.397min(方法a)。
[0473]
[实验例60]目标化合物(2,3-二甲基-1-(吡啶-3-基)-5,6,7,8-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-胺)是以与实验例59类似的方式获得的。
[0474]
[实验例61、62]目标化合物(6-(3-(二甲基氨基)丙基)-8-甲基-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺；8-氯-6-(3-(二甲基氨基)丙基)-2,3,4,6-四氢-1h-吲哚并[2,3-b]喹啉-11-胺)是以与实验例38类似的方式获得的。
[0475]
实施例3：系统性红斑狼疮小鼠模型实验
[0476]
实施例3-1：动物育种和药物施用
[0477]
将14周龄36-40g雌性mrl/lpr(或mrl/fas
lpr
)小鼠(通过orient bio购自美国jackson laboratory)用于狼疮治疗效果实验，并且根据亚洲大学医疗中心的实验室动物研究中心的育种和伦理规范进行育种。在实验前，将4至5只动物随机分配到阴性对照组(媒介物)、阳性对照组(hcq)和实验化合物组(sk41、sk50、sk58和sk64)中的每一个中以进行设盲处理，并且将sk41、sk50、sk58和sk64化合物中的每一种完全溶解于由10％乙醇(乙基醇)、40％聚乙二醇400和50％无菌蒸馏水组成的媒介物中，然后将溶液口服施用于实验动物。
[0478]
关于施用方法，对于阴性对照组仅施用相同量的媒介物，对于阳性对照组每天施用15-60mpk(15-60mg/kg)hcq，并且对于实验化合物组每天施用以15-30mpk(15-30mg/kg)的量的sk41、sk50、sk58和sk64，并且施用是从实验小鼠14周龄之时开始，持续40天。
[0479]
关于样品收集方法，以3天的间隔测量实验小鼠的体重，并且在40天的期满日，对小鼠进行吸入麻醉并使用ifran液体(hana pharmaceutical，韩国；成分名称：异氟烷)实施安乐死，然后从中收集血液、肾、脾和腋窝淋巴结以及腹股沟淋巴结。
[0480]
实施例3-2：系统性红斑狼疮小鼠模型样品的分析
[0481]
从麻醉小鼠的心脏收集血样，使用血清分离管和离心机(4,000rpm，10分钟，4℃)从中提取血清，并且通过酶联免疫吸附测定(elisa)测量作为狼疮严重程度指示分子的ana(抗核抗体，mybiosourse，美国)和作为综合炎症指示分子的c3补体(mybiosourse，美国)的血液浓度。
[0482]
在提取之后立即用rna稳定剂(rna稳定试剂，德国，quiagen)处理器官以保存状况并制备样本，对器官进行成像并将其称重以确定器官是否受损并测量免疫器官肥大的程度，并且将一对腋窝淋巴结和一对腹股沟淋巴结的重量总和记录为淋巴结的重量。
[0483]
实施例4：基于tlr7/9抑制活性对先导物质的鉴定
[0484]
通过分子对接预测sk01与tlr7的推定结合模式和相互作用模式。使用tlr7的r848结合晶体结构(pdb id：5gmh)进行对接测定，因为所述抑制剂没有展现出针对tlr8的活性，并且通过x射线晶体学未测定出tlr3和tlr9上的小分子结合腔。通过去除非必需元素(包括水分子和杂原子，结合的激动剂r848除外)洗涤受体。在amber12:eht力场的存在下实现质子化。进行能量最小化，直到均方根(rms)斜率达到0.1r848周围的残基被定义为配体结合位点，并且使用微量板相似性放置和亲和力dg评分函数进行对接。使用amber12:eht力场和gbvi/wsa dg评分函数再次对对接命中进行评分。从r848中选择具有较低rms偏差的最佳得分姿势以可视化配体的结合模式和分子间相互作用。通过elisa证实对于tlr7/tlr9激活的潜在抑制能力，以鉴定称为“sk01”的小分子化合物(图1)。
[0485]
为了鉴定具有80％或更高结构相似性(即，tanimoto度量，截止值＝0.8)的配体，搜索molport数据库(https://www.molport.com/shop/index)以找到sk01结构。总共下载100种衍生物作为sdf文件并在moe中处理。使用moe的sdwash方案洗涤配体，并且使能量最小化。假定sk01必须结合受体的胞外结构域以发挥其抑制活性，则除了sk01外，所有配体都对接在tlr7结构的小分子结合腔(r848)中。对接姿势根据指定为s得分的计算的结合亲和力排序。选择对tlr7的亲和力比sk01大的配体进行活性的实验验证。检测了5μm的所选sk02至sk20候选物针对tlr9的抑制能力(图2)，并且基于此，选择六种化合物以确定常规sk01在
较低浓度(2μm和5μm)下的抑制活性(图3)。这种方法表明，在sk01的结构类似物之中，sk16展现出最佳抑制活性(图4至图6)，并在此基础上进一步进行修饰。
[0486]
实施例5：内体tlr的潜在抑制剂的鉴定
[0487]
为了选择针对tlr3/tlr7/tlr8/tlr9激活的潜在抑制分子，首先在用一组从sk21至sk82的配体以20μm的浓度处理后进行mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)细胞活力测定(图7)，并且通过elisa测定评价其抑制活性以监测raw 264.7细胞中tnf-α分泌的水平。将从sk21至sk82的实验配体以0.5μm或2μm施用于raw 264.7细胞，并且用咪喹莫特(tlr7，1μg/ml)和ond2395(tlr9，0.5μm)刺激。在所测试的配体之中，sk23、sk24、sk29、sk36、sk39、sk40、sk41、sk50、sk52、sk54、sk55、sk58、sk59、sk60、sk61、sk62、sk63、sk64、sk65、sk69、sk70、sk71、sk72、sk 74、sk75、sk81和sk82展现出针对tlr7和tlr9的呈剂量依赖性方式的显著抑制活性(图8和图9)。
[0488]
为了验证在初始筛选阶段中鉴定的显著候选物之中的13种化合物作为特定新型药物的潜力，将每种化合物和阳性对照hcq的lc
50
以及tlr7和tlr9的ic
50
以及使用这两个值计算的治疗指数示于表中(图10)。与hcq相比，所有最初选择的13种化合物在tlr7和tlr9中都具有较高的抑制浓度，并且从中选择了4种具有较低毒性(lc
50
)和优异ti的候选物(sk41、sk50、sk58和sk64)。
[0489]
为了确定sk41、sk50、sk58和sk64对于各种tlr信号传导途径的抑制活性，将raw 264.7细胞与每种化合物一起培养，然后用不同的tlr激动剂刺激。本文使用的tlr激动剂是对于细胞表面tlr的pam3csk4(tlr1/2)、fsl-1(tlr2/6)、lps(tlr4)和fla-st(tlr5)以及对于内体tlr的多聚i:c(tlr3)和tl8-506(tlr8)。使用elisa进行的tnf-α分泌水平的测量的结果表明sk41、sk50、sk58和sk64没有展现出针对细胞表面tlr：tlr1/2、tlr2/6、tlr4和tlr5的特异性抑制活性(图11)，但展现出针对内体tlr：tlr3和tlr8的强抑制活性(图12)。
[0490]
实施例6：在mrl/lpr狼疮病小鼠模型中展现出治疗效果的sk衍生物的确认
[0491]
选择sk41、sk50、sk58和sk64作为测试物质以通过体内动物实验验证功效，然后在mrl/lpr小鼠模型中进行动物实验，所述模型是天然存在的狼疮动物模型。增加仅施用媒介物(媒介物(vehicle))的组和施用hcq的组作为实验对照组，hcq作为内体tlr抑制剂是已知的。在整个时间段期间以3天的间隔监测所有小鼠的体重变化，其用作由于施用测试物质而引起的长期施用毒性的评价的指标。作为结果，所有施用组都没有展现出体重的变化，这意味着当施用sk41、sk50、sk58和sk64时，视觉治疗效果(sk41、sk58和sk64优于hcq)或其变化与毒性无关(图13和图14)。
[0492]
在施用40天之后，对小鼠实施安乐死，并且从其中收集脾、淋巴结和肾的样品。在脾中没有观察到明确视觉变化。观察到其中淋巴液中的抗原导致免疫反应的淋巴结的出现。作为结果，在sk58实验组中相对良好，而所有sk41实验组都具有小的腹股沟淋巴结尺寸。测量每只小鼠的脾和淋巴结的重量，并且结果表明sk58实验组的脾和淋巴结肿胀相对较小(图15)。
[0493]
追踪对小鼠实施安乐死之后立即从小鼠心脏收集的血浆中的抗核抗体(随着其减少而达到正常)和c3补体(随着其增加而达到正常)(它们是狼疮疾病的分子标记物)，并且作为结果，在sk41和sk58中获得了显著的结果(图16)。与仅用媒介物处理的阴性对照组和用hcq处理的阳性对照组相比，尤其是sk58实验组包含低抗核抗体和高c3补体，这意味着它
具有作为有效候选物的高潜力。
[0494]
图13至图16的结果是通过用sk系列剂量(30mg/kg)的两倍剂量的hcq(60mg/kg)处理获得的，并且图17的结果是通过施用15mg/kg获得的，所述剂量与hcq(竞争性物质)的日剂量相同以用于直接比较治疗效果。sk41和sk58展现出比hcq优异的视觉(表观)治愈效果(图17)。
[0495]
在低浓度下对tlr7和tlr9的抑制活性的测定结果显示出sk23、sk24、sk29、sk36、sk39、sk40、sk41、sk50、sk52、sk54、sk55、sk58、sk59、sk60、sk61、sk62、sk63、sk64、sk65、sk69、sk70、sk71、sk72、sk74、sk75、sk81和sk82被鉴定为有效的新型化合物，并且所有这些物质都显著降低tlr7/tlr9介导的tnf-α分泌的水平，从而表明它们是tlr7/9信号传导的有效抑制剂。另外，sk41、sk50、sk58和sk64没有展现出针对细胞表面tlr信号传导途径中的tlr1/2、tlr2/6、tlr4或tlr5的抑制活性，但展现出针对tlr3和tlr8的特异性抑制活性。这表明sk24、sk29、sk36、sk39、sk40、sk41、sk50、sk52、sk54、sk55、sk58、sk59、sk60、sk61、sk62、sk63、sk64、sk65、sk69、sk70、sk71、sk72、sk74、sk75、sk81和sk82全部都具有控制内体tlr的效果。
[0496]
工业实用性
[0497]
根据本发明的新型化合物可以阻断由多聚i:c(tlr3激动剂)、咪喹莫特(tlr7激动剂)、tl8-506(tlr8激动剂)或odn2395(tlr9激动剂)诱导的tnf-α的分泌，并且抑制炎性细胞因子的产生，因此特别可用于预防或治疗tlr3、tlr7、tlr8或tlr9相关的自身免疫性疾病、炎性疾病和病毒性疾病，包括系统性红斑狼疮和银屑病。
[0498]
尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，出于说明目的提供本说明书以阐述优选的实施方案，并且不应当解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种由下式1表示的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐：[式1]其中r1至r6彼此相同或不同，并且各自独立地是氢原子、卤素原子、直链或支链烷基、氨基、烷基胺、杂环胺、腈基、硝基、亚硝基、羟基、环烷基、苄基、卤代烷基、烯丙基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、烷基芳基羰基、烷氧基羰基、环烷氧基、芳基、杂芳基、杂环烷基、芳氧基、烷氧基杂芳基、杂芳氧基烷基、烷基杂芳基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、烷基酯、烷基醚、烷基酰胺或丙烯酰基，或r2和r3彼此连接以形成取代的或未取代的环烃或芳烃，或r5和r6彼此连接以形成取代的或未取代的环烃或芳烃，其中所述烷基、所述烷基胺、所述杂环胺、所述烷氧基、所述烷氧基烷基、所述烷基酯、所述烷基醚或所述烷基酰胺是c
1-30
，所述环烷基是c
3-30
，所述烯丙基是c
2-30
，所述芳基是c
6-30
，并且所述杂芳基和所述杂环烷基含有选自氟、氧、硫和氮的杂原子。2.根据权利要求1所述的化合物，其中r1至r6是选自以下取代基的取代基：r1：：r2：
r3：r2和r3：：r4：r5：
r6：r5和r6：3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述由式1表示的化合物是由选自下式1-1至1-34中的任一种表示的化合物：[式1-1][式1-2][式1-3][式1-4]
[式1-5][式1-6][式1-7][式1-8]
[式1-9][式1-10][式1-11][式1-12][式1-13]
[式1-14][式1-15][式1-16][式1-17][式1-18]
[式1-19][式1-20][式1-21][式1-22]
[式1-23][式1-24][式1-25][式1-26]
[式1-27][式1-28][式1-29][式1-30]
[式1-31][式1-32][式1-33][式1-34]
4.一种用于抑制toll样受体(tlr)的组合物，所述组合物包含由下式1表示的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐：[式1]其中r1至r6彼此相同或不同，并且各自独立地是氢原子、卤素原子、直链或支链烷基、氨基、烷基胺、杂环胺、腈基、硝基、亚硝基、羟基、环烷基、苄基、卤代烷基、烯丙基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、烷基芳基羰基、烷氧基羰基、环烷氧基、芳基、杂芳基、杂环烷基、芳氧基、烷氧基杂芳基、杂芳氧基烷基、烷基杂芳基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、烷基酯、烷基醚、烷基酰胺或丙烯酰基，或r2和r3彼此连接以形成取代的或未取代的环烃或芳烃，或r5和r6彼此连接以形成取代的或未取代的环烃或芳烃，其中所述烷基、所述烷基胺、所述杂环胺、所述烷氧基、所述烷氧基烷基、所述烷基酯、所述烷基醚或所述烷基酰胺是c
1-30
，所述环烷基是c
3-30
，所述烯丙基是c
2-30
，所述芳基是c
6-30
，并且所述杂芳基和所述杂环烷基含有选自氟、氧、硫和氮的杂原子。5.根据权利要求4所述的组合物，其中r1至r6是选自以下取代基的取代基：r1：
r2：r3：r2和r3：：
r4：r5：r6：r5和r6：6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述由式1表示的化合物是由选自下式1-1至1-34中的任一种表示的化合物：[式1-1][式1-2]
[式1-3][式1-4][式1-5][式1-6][式1-7]
[式1-8][式1-9][式1-10][式1-11][式1-12]
[式1-13][式1-14][式1-15][式1-16][式1-17]
[式1-18][式1-19][式1-20][式1-21]
[式1-22][式1-23][式1-24][式1-25]
[式1-26][式1-27][式1-28][式1-29]
[式1-30][式1-31][式1-32][式1-33]
[式1-34]7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述化合物抑制选自tlr3、tlr7、tlr8和tlr9的至少一种tlr的信号传导途径。8.一种用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病选自银屑病、系统性红斑狼疮(sle)、皮疹、光敏性皮肤病、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、银屑病关节炎、盘状红斑狼疮、疟疾、口腔溃疡、肾炎、血细胞减少症、血管炎、浆膜炎、炎性肠病(ibd)、糖尿病、多发性硬化、皮肤硬化、天疱疮、特应性皮炎、尿道炎、膀胱炎、动脉硬化、过敏性疾病、鼻炎、哮喘、急性疼痛、慢性疼痛、牙周炎、牙龈炎、痛风、心肌梗塞、充血性心力衰竭、高血压、心绞痛、胃溃疡、脑梗塞、唐氏综合征、肥胖症、痴呆、抑郁症、精神分裂症、结核病、睡眠障碍、脓毒症、烧伤、胰腺炎、帕金森病和中风，并且所述病毒性疾病选自感冒、流感(流行性感冒)、水痘、带状疱疹、单纯疱疹、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、细小病毒感染、脊髓灰质炎、病毒出血热、黄热病、登革热、狂犬病、aids和covid-19。

技术总结
本发明涉及一种具有抑制内体toll样受体(TLR)的功能的拮抗性小分子化合物，并且更具体地涉及：一种用于抑制TLR3/7/8/9信号传导途径的小分子化合物；一种包含所述小分子化合物的用于抑制toll样受体的组合物；以及一种用于预防或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病毒性疾病的组合物。根据本发明的新型化合物在系统性红斑狼疮动物模型中显示出非常显著的结果，其不仅防止由多聚I:C(TLR3激动剂)、咪喹莫特(TLR7激动剂)、TL8-506(TLR8激动剂)或ODN2395(TLR9激动剂)诱导的TNF-α分泌，而且抑制炎性细胞因子的产生。这表明所述化合物也可用于预防或治疗TLR3、TLR7、TLR8或TLR9相关的自身免疫性疾病、炎性疾病和病毒性疾病。炎性疾病和病毒性疾病。炎性疾病和病毒性疾病。


技术研发人员：崔相敦 徐昌熙 郑义锡 崔洋宣 白郁英 崔宰释 林春英 李斗炫 金楠喜 李承娟 金晓池 金相均 吴侑珍 金昭暎 Y
受保护的技术使用者：S和K疗法公司
技术研发日：2021.11.25
技术公布日：2023/8/1