一种乳腺上皮细胞的培养基、培养方法及其应用与流程

1.本发明涉及用于体外培养上皮细胞、尤其是乳腺上皮细胞的培养基、以及用于培养所述细胞或包含所述细胞的类器官的培养方法。本发明还涉及本发明的培养基和培养方法所培养的细胞后代或类器官在药物的疗效评估和筛选、毒性测定和再生医学中的用途。


背景技术：

2.人乳腺上皮细胞的体外培养对于研究人体正常乳腺发育以及乳腺肿瘤发生发展的机制至关重要。然而，如何实现人乳腺上皮细胞的可持续培养目前仍面临诸多挑战。目前，有两种可再生技术被报道可用于人乳腺上皮细胞的体外培养：一种是由美国乔治城大学开发的条件重编程技术，另一种是由荷兰皇家艺术与科学研究院开发的类器官技术。然而这两种技术在实际应用的过程中存在着一定的问题：条件重编程技术需要将患者自体的肿瘤细胞与鼠源性饲养细胞共培养，因此会干扰对肿瘤细胞的分析结果；类器官技术所使用的培养基以干细胞龛因子为核心成分，但该培养技术所需的龛因子用量很大，成本较高，且所需的培养周期较长，操作难度大。因此，这两项技术目前均未真正大规模地推广到基础研究和新药研发领域中。
3.本发明人曾在专利(wo 2021/088119)中记载了一种无需饲养细胞、成本可控、操作便捷的体外培养乳腺上皮细胞的培养基和培养方法。这是首个无需饲养细胞，培养成分中不含wnt蛋白、r-spondin家族蛋白等wnt激动剂的二维体外培养乳腺上皮干细胞的培养系统。这个培养系统可维持乳腺上皮细胞至少1个月的体外持续增殖。本发明人在原有发明的基础上，意外地发现将肿瘤坏死因子等添加剂应用于培养乳腺上皮细胞可实现更加快速地促进乳腺上皮细胞持续增殖的效果。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种用于培养乳腺上皮细胞的培养基及培养方法。所述培养基包括β-雌二醇、胰岛素生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子-α、以及任选的成纤维细胞生长因子10。
5.在本发明的实施方式中，本发明的培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：
6.β-雌二醇的浓度为5nm～50nm，更优选为5nm～10nm；
7.胰岛素生长因子1的浓度为10ng/ml～200ng/ml，更优选为20ng/ml～100ng/ml；
8.碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml～200ng/ml，更优选为20ng/ml～100ng/ml；
9.肿瘤坏死因子-α的浓度为2ng/ml～100ng/ml，更优选为5ng/ml～50ng/ml；
10.任选添加的成纤维细胞生长因子10的浓度为0ng/ml～50ng/ml。
11.在本发明的实施方式中，本发明的培养基还含有双向调节素、表皮生长因子、胰岛素、b27、rock激酶抑制剂y27632、神经调节素1、成纤维细胞生长因子7、tgfβi型受体抑制剂
a8301、和glutamax-i。
12.其中，在优选的方面，双向调节素的含量为10ng/ml～100ng/ml，表皮生长因子的含量为2.5ng/ml～20ng/ml，胰岛素的含量为1μg/ml～10μg/ml，b27以1:25～1:100的体积比加入，y27632含量为5μm～15μm，神经调节素1的含量为5nm～20nm，成纤维细胞生长因子7的含量为2.5ng/ml～20ng/ml，a8301的含量为100nm～500nm，glutamax-i以1:50～1:200体积比加入。
13.在本发明的实施方式中，所述培养基还含有选自dmem/f12、dmem、f12或rpmi-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素b和primocin中的一种或多种的抗生素。
14.在优选的实施方式中，当抗生素选自链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400μg/ml，青霉素浓度范围为25～400u/ml，当抗生素选自两性霉素b时，浓度范围为0.25～4μg/ml，当抗生素选自primocin时，浓度范围为25～400μg/ml。
15.本发明的第二方面在于提供一种乳腺上皮细胞的培养方法，其中，该培养方法包括以下步骤：(1)配制本发明的乳腺上皮细胞的培养基；(2)用细胞外基质胶包被培养器皿；(3)在包被好的培养器皿内接种原代乳腺上皮细胞，使用本发明的乳腺上皮细胞的培养基进行培养。
16.其中，所述培养方法中的细胞外基质胶使用低生长因子型细胞外基质胶，例如，可采用市售的matrigel(corning：354230)或bme(trevigen：3533-010-02)。更具体而言，用无血清的培养基稀释细胞外基质胶，培养基可以是本发明的初始培养基，例如dmem/f12(corning：r10-092-cv)。细胞外基质胶的稀释比例为1:20-400，优选为1:50-200。包被方法为将稀释后的细胞外基质胶加入培养器皿内，使其完全覆盖培养器皿底部，静置包被30分钟以上，优选在37℃条件下静置包被，优选包被30～60分钟。包被结束后吸弃多余的细胞外基质胶稀释液，培养器皿备用。
17.所述人乳腺上皮细胞可以为乳腺癌肿瘤细胞、正常乳腺上皮细胞、或乳腺上皮干细胞。例如，在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm3以上，将其置于预冷的含抗生素的dmem/f12培养基中，冰上运输至实验室；例如，使用dmem/f12培养基中含有50～200u/ml(例如100u/ml)青霉素和50～200μg/ml(例如100μg/ml)链霉素进行冰上运输。
18.在生物安全柜内，将组织样本转移至细胞培养皿内，用运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉，并剔除组织样本表面的皮肤、筋膜等不需要的组织。
19.将润洗后的组织样本转移至另一个新的培养皿内，加入5～25ml运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为直径小于1mm3的组织碎块。
20.将组织样本碎块转移至离心管内，用台式离心机以至少1000转/分钟离心3～10分钟；然后用移液器小心移除离心管内上清，再用5～25ml含胶原酶ii(0.5～5mg/ml，例如1mg/ml)和胶原酶iv(0.5～5mg/ml，例如1mg/ml)的无血清dmem/f12培养基重悬，置37℃恒温摇床上进行振荡消化，时间为至少30分钟(消化时间取决于样本大小；如果样本大于1g，则消化时间增至1.5～2小时)；之后用台式离心机以至少300g/分钟离心3～10分钟，弃去上清液，消化后的组织细胞用5～25ml含例如10％胎牛血清的dmem/f12培养基重悬，研磨过筛，细胞筛孔径为例如100μm，将过筛的细胞悬液收集于离心管中；用血细胞计数板计数。
21.然后将细胞悬液在离心机中以至少300g/分钟离心3～10分钟，弃去上清，再用本
发明的培养基重悬，按照1
×
104～1
×
106细胞/孔的密度在包被好的培养器皿内接种并进行培养。
22.本发明的第三方面提供一种用于评估或筛选治疗乳腺疾病的药物的方法，包括使用本发明的培养基和培养方法获得扩增的乳腺上皮细胞后代，应用于药物的疗效评估和筛选中，特别是应用于抗肿瘤药物的体外疗效评估和筛选中。
23.优选地，所述用于评估或筛选治疗乳腺疾病的药物的方法包括以下步骤：
24.(1)获得原代乳腺上皮细胞，并使用本发明的培养方法进行培养；
25.(2)选定需要检测的药物并按照浓度梯度进行配制；
26.(3)对步骤(1)中培养得到的乳腺上皮细胞添加步骤(2)中配制的不同浓度的药物；和
27.(4)进行细胞活性测试。
28.本发明的有益效果包括：
29.(1)实现了乳腺上皮细胞在短时间内的快速扩增，能够在有效的时间内扩增得到足够数量的细胞，应用于基础研究和药物筛选；
30.(2)使用本发明的培养基和培养方法进行体外培养得到的乳腺上皮细胞能够维持细胞来源病人的异质性，可应用于再生医学领域；
31.(3)所培养的乳腺上皮细胞不受成纤维细胞等细胞的干扰，能得到纯化的乳腺上皮细胞及其后代；
32.(4)培养基成分不含血清等不确定成分，所以不受不同批次血清的质量和数量的影响；
33.(5)所述技术培养乳腺上皮细胞无需添加r-spondin和wnt家族成分等昂贵的干细胞龛因子，相比wo 2021/088119中所公开的培养基，本发明的培养基能够更加迅速地得到大量单层上皮细胞，且扩增得到相同细胞数目的周期要短，适合应用于高通量筛选新候选化合物和为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试等药物疗效的评估、筛选以及毒性测试领域。
34.采用本实施方式的培养基，可培养来源于包括人或其他哺乳动物的乳腺上皮细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织，得到扩增的、相应的乳腺上皮细胞后代。
35.另外，通过本实施方式的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、毒性测试、乳腺上皮细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、药物体外代谢稳定性和代谢谱的测定和针对乳腺疾病的新药研发等。
附图说明
36.图1a-1g是用于说明培养基内不同浓度的添加成分对原代乳腺上皮细胞体外增殖的影响的图。
37.图2a是用本发明的乳腺上皮细胞培养基和对照培养基对从一例乳腺癌临床组织样本分离得到的原代乳腺肿瘤细胞分别平行培养至第三代，再继续培养14天后，对所获得的原代乳腺上皮细胞进行细胞核荧光染色的结果(100倍显微镜下)；图2b是采用图2a的相同培养方法，对三例不同乳腺肿瘤患者来源的原代细胞进行平行培养后，再对细胞核进行荧光标记(dapi)和统计分析的结果，“***”表示p《0.001。
38.图3a和图3b是用于说明采用本发明的培养基和对照培养基分别对一例原代乳腺上皮细胞进行持续培养后的效果对比图及培养天数-群体倍增数的曲线图。
39.图4a和图4b分别是显示采用本发明的培养基和对照培养基分别对另一例原代乳腺上皮细胞进行持续培养后的效果对比图及培养天数-群体倍增数的曲线图。
40.图5是使用本发明的乳腺上皮细胞培养基和对照培养基对从一例乳腺肿瘤临床组织样本分离得到的原代乳腺癌细胞分别平行至第三代，再继续培养14天后，对所获得的乳腺上皮细胞进行dapi荧光标记、腔面细胞(ck8)和肌上皮细胞(ck14)特异性生物标记物免疫荧光染色、以及多通道荧光信号重叠成像(merge)的结果(100倍显微镜下)。
41.图6a-6f是表示不同药物对采用本发明的乳腺上皮细胞培养基培养的乳腺肿瘤细胞的剂量-效应曲线图。
具体实施方式
42.[实施例1]
[0043]
人原代乳腺上皮细胞的分离和乳腺上皮细胞培养基的优化
[0044]
(1)人原代乳腺上皮细胞的分离
[0045]
将市售产品青霉素-链霉素双抗溶液(corning公司制，含10000u/ml青霉素、10mg/ml链霉素)按2％体积比加入dmem/f12培养基(corning公司制)，用于样本的运输和清洗。以下简称“运输液”。
[0046]
乳腺肿瘤组织样本来源于五例进行过说明并获得同意的乳腺肿瘤患者手术切除癌组织样本，它们分别是1#、2#、3#、4#、5#。下面以其中一例样本(1#)进行说明。在患者手术切除后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm3以上，将其置于预冷的运输液中，冰上运输至实验室。
[0047]
在生物安全柜内，将组织样本(1#)转移至100mm细胞培养皿内，用运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉，并剔除组织样本表面的肌肉、筋膜等不需要的组织。
[0048]
将润洗后的组织样本转移至另一个新的100mm培养皿内，加入10ml运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为直径小于1mm3的组织碎块。
[0049]
将组织样本碎块转移至50ml离心管内，用台式离心机以1200转/分钟离心5分钟；然后用移液器小心移除离心管内上清，再用10ml含胶原酶ii(1mg/ml)(sigma公司制)和胶原酶iv(1mg/ml)(sigma公司制)的无血清dmem/f12培养基重悬，置37℃恒温摇床上进行振荡消化，时间为30分钟～90分钟；之后用台式离心机以350g/分钟离心5分钟，弃去上清液，消化后的组织细胞用10ml含10％胎牛血清(gibco公司制)的dmem/f12培养基重悬，研磨过筛，细胞筛孔径为100μm，将过筛的细胞悬液收集于50ml离心管中；用血细胞计数板计数。
[0050]
然后将细胞悬液在离心机中以350g/分钟离心5分钟，弃去上清，再用下述的基础培养基重悬。
[0051]
另外四例乳腺肿瘤组织样本按照以上同样的方法进行分离。
[0052]
(2)细胞培养板的包被
[0053]
将细胞外基质胶(matrigel，corning公司制)使用dmem/f12按1:50稀释比例，配制成细胞外基质胶稀释液，在24孔培养板内加入250μl/孔的细胞外基质胶稀释液使其完全覆
盖培养板孔的底部。在37℃培养箱内静置1小时后，移除细胞外基质胶稀释液，得到包被有细胞外基质胶的培养板。
[0054]
(3)原代乳腺上皮细胞培养基中添加因子的筛选
[0055]
首先配制基于wo 2021/088119的基础培养基。向市售的dmem/f-12培养基中以说明书浓度(1:100倍稀释)加入glutamax-i(thermo fisher scientific公司制)，以最终浓度10μg/ml的条件添加人胰岛素(sigma公司制)，以最终浓度10μm的条件添加rock激酶抑制剂y27632(sigma公司制)，以1:100倍稀释比例加入青霉素-链霉素(thermo fisher scientific公司制)，以最终浓度20ng/ml的条件添加人双向调节素(r&d systems公司制)，以最终浓度10ng/ml的条件添加表皮生长因子(egf，peprotech公司制)，以1:50比例稀释条件添加b27(thermo fisher scientific公司制)，以最终浓度10nm的条件添加人神经调节素1(peprotech公司制)，以最终浓度10ng/ml添加成纤维细胞生长因子7(fgf7，r&d systems公司制)，以最终浓度500nm条件添加tgfβ1抑制剂a8301(mce公司制)，制备原代乳腺上皮细胞基础培养基。以下简称“基础培养基”。
[0056]
接着，在基础培养基内分别加入不同种类的添加剂(表1)配制成含有不同添加成分的乳腺上皮细胞培养基。将不同成分的培养基按500μl/孔体积加入至包被有细胞外基质胶的24孔板内，每种培养基配方3个复孔。将本实施例之(1)中从乳腺肿瘤组织分离得到的乳腺癌细胞(1#)以3
×
104个/孔的细胞密度接种在细胞外基质胶包被过的24孔培养板内，以37℃、5％co2浓度的条件，分别在不同的培养基配方条件下进行培养。培养开始后每3天进行一次培养基的更换。培养14天后，进行细胞计数。其中，作为实验对照，使用未添加表1中添加因子的基础培养基。
[0057]
其余四例乳腺肿瘤组织样本分离得到的肿瘤细胞也分别按照以上同样的方法进行培养和计数。
[0058]
将统计结果示于表1。
[0059]
[表1]
[0060][0061]
其中，“+”表示相比基础培养基，加入该添加剂的培养基对从乳腺肿瘤组织分离出的原代乳腺癌细胞中的至少三例有促进增殖的作用，“+”的数目代表促增殖的程度；“－”表示添加该添加剂的培养基对从乳腺肿瘤组织分离出的原代乳腺癌细胞中的至少两例显示
有抑制增殖的作用；
“○”
表示添加该添加剂的培养基对从乳腺肿瘤组织分离出的原代乳腺癌细胞中的至少三例的增殖没有明显的影响。
[0062]
结果显示，胰岛素生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子10、肿瘤坏死因子α几种添加剂对从乳腺肿瘤组织分离出的原代乳腺肿瘤细胞中的至少三例有促进增殖的作用，其中碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子α的作用更强。而将以上因子全部添加至基础培养基后，促增殖程度显著增加。
[0063]
(4)人乳腺上皮细胞培养基中添加因子的浓度优化
[0064]
进一步配制了如下7种不同配方的培养基：
[0065]
配方1：在基础培养基内分别添加1:100倍稀释的mem-neaa、1mm的丙酮酸钠、50ng/ml的igf1、20ng/ml的bfgf、10ng/ml的tnf-α和20ng/ml的fgf10；
[0066]
配方2：在基础培养基内分别添加10nm的β-雌二醇、1mm的丙酮酸钠、50ng/ml的igf1、20ng/ml的bfgf、10ng/ml的tnf-α和20ng/ml的fgf10；
[0067]
配方3：在基础培养基内分别添加10nm的β-雌二醇、1:100倍稀释的mem-neaa、50ng/ml的igf1、20ng/ml的bfgf、10ng/ml的tnf-α和20ng/ml的fgf10；
[0068]
配方4：在基础培养基内分别添加10nm的β-雌二醇、1:100倍稀释的mem-neaa、1mm的丙酮酸钠、20ng/ml的bfgf、10ng/ml的tnf-α和20ng/ml的fgf10；
[0069]
配方5：在基础培养基内分别添加10nm的β-雌二醇、1:100倍稀释的mem-neaa、1mm的丙酮酸钠、50ng/ml的igf1、10ng/ml的tnf-α和20ng/ml的fgf10；
[0070]
配方6：在基础培养基内分别添加10nm的β-雌二醇、1:100倍稀释的mem-neaa、1mm的丙酮酸钠、50ng/ml的igf1、20ng/ml的bfgf和20ng/ml的fgf10；
[0071]
配方7：在基础培养基内分别添加10nm的β-雌二醇、1:100倍稀释的mem-neaa、1mm的丙酮酸钠、50ng/ml的igf1、20ng/ml的bfgf和10ng/ml的tnf-α。
[0072]
随后，在配方1内分别加入β-雌二醇(sigma公司制)配制成含有终浓度为5nm、10nm、50nm、100nm的β-雌二醇的人乳腺上皮细胞培养基，将各培养基按100μl/孔体积加入至包被有matrigel的96孔板内，每个浓度3个复孔。将本实施例之(1)从乳腺肿瘤组织分离得到的原代乳腺癌细胞(2#)以500个/孔的细胞密度接种在matrigel包被过的96孔培养板内，以37℃、5％co2浓度条件，在含不同浓度β-雌二醇的配方1条件下进行培养。培养开始后每3天进行一次培养基的更换。在培养第14天，进行细胞计数。其中，作为实验对照，使用配方1，即，β-雌二醇含量为0nm。将结果示于图1a。
[0073]
在配方2内分别加入非必需氨基酸(mem-neaa)添加剂(thermo fisher公司制)以1:200倍稀释比例、1:100倍稀释比例、1:50倍稀释比例、1:20倍稀释比例配制成含有不同浓度非必需氨基酸的人乳腺上皮细胞培养基，按100μl/孔体积将不同配方的培养基加入至包被有matrigel的96孔板内，每个浓度3个复孔。与上述同样地进行原代细胞的培养和计数。其中，作为实验对照，使用配方2，即，非必需氨基酸含量为0。将结果示于图1b。
[0074]
同样的，在配方3内分别加入丙酮酸钠(thermo fisher公司制)配制成含有终浓度为0.5mm、1mm、2mm、4mm的丙酮酸钠的人乳腺上皮细胞培养基，按100μl/孔体积将不同配方的培养基加入至包被有matrigel的96孔板内，每个浓度3个复孔。与上述同样地进行原代细胞的培养和计数。其中，作为实验对照，使用配方3，即，丙酮酸钠含量为0。将结果示于图1c。
[0075]
接着，在配方4内分别加入胰岛素生长因子1(igf1，r&d公司制)配制成含有终浓度
为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的igf1的人乳腺上皮细胞培养基，分别将含不同浓度igf1的培养基按100μl/孔体积加入至包被有matrigel的96孔板内，每个浓度3个复孔。与上述同样地进行原代细胞的培养和计数。其中，作为实验对照，使用配方4，即，igf1含量为0。将结果示于图1d。
[0076]
同样地，使用配方5分别配制含不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf，r&d公司制)的人乳腺上皮细胞培养基，bfgf的终浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml，与上述同样地进行原代细胞的培养和计数。其中，作为实验对照，使用配方5，即，bfgf含量为0。将结果示于图1e。
[0077]
然后，使用配方6分别配制含不同浓度的肿瘤坏死因子-α(tnf-α，novoprotein公司制)的人乳腺上皮细胞培养基，tnf-α的终浓度分别为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml，与上述同样地进行原代细胞的培养和计数。其中，作为实验对照，使用配方6，即，tnf-α含量为0。将结果示于图1f。
[0078]
最后，使用配方7分别配制含不同浓度的成纤维细胞生长因子10(fgf10，r&d公司制)的人乳腺上皮细胞培养基，fgf10的终浓度分别为20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml，与上述同样地进行原代细胞的培养和计数。其中，作为实验对照，使用配方7，即，fgf10的含量为0。将结果示于图1g。
[0079]
结果显示，不同浓度的添加剂在一定的浓度范围内对原代乳腺癌细胞的体外增殖有剂量依赖性的促增殖作用。其中，β-雌二醇、igf1、bfgf、tnf-α在以较低浓度添加后就开始显示明显的促增殖作用。更进一步地，β-雌二醇的优选添加浓度为5nm～50nm，更优选为5nm～10nm；igf1的优选添加浓度为10ng/ml～200ng/ml，更优选为20ng/ml～100ng/ml；bfgf的优选添加浓度为10ng/ml～200ng/ml，更优选为20ng/ml～100ng/ml；tnf-α的优选添加浓度为2ng/ml～100ng/ml，更优选为5ng/ml～50ng/ml。另外，添加剂fgf10在一定的浓度范围内对原代乳腺癌细胞的体外增殖也有剂量依赖性的促增殖作用，其优选添加浓度为0ng/ml～50ng/ml。
[0080]
(5)人乳腺上皮细胞培养基的促增殖效果的研究
[0081]
进一步配制如下2种不同配方的培养基：
[0082]
1.对照培养基：配制步骤参见wo 2021/088119，即配制含有以下组分的培养基：dmem/f-12培养基(corning公司制)+1:100体积比的glutamax-i(thermo fisher scientific公司制)+10μg/ml的人胰岛素(sigma公司制)+10μm的y27632(sigma公司制)+1:100体积比的青霉素-链霉素(thermo fisher scientific公司制)+20ng/ml的人双向调节素(r&d systems公司制)+10ng/ml的egf(peprotech公司制)+1:50体积比的b27(thermo fisher scientific公司制)+10nm的人神经调节素1(peprotech公司制)+10ng/ml的fgf7(r&d systems公司制)+500nm的a8301(mce公司制)+500nm的sb202190；
[0083]
2.完全培养基(以下简称为“本发明培养基”)：在基础培养基内分别添加10nm的β-雌二醇、20ng/ml的bfgf、50ng/ml的igf1、和10ng/ml的tnf-α。
[0084]
比较对照培养基和本发明培养基在体外对原代乳腺癌细胞的促增殖作用。将对照培养基和本发明培养基按500μl/孔体积加入至包被有matrigel的24孔板内，每组3个复孔。
[0085]
按实施例1的(1)的方法，从乳腺肿瘤组织分离得到乳腺癌细胞(1#～3#)，分别以3
×
104个/孔的细胞密度接种在matrigel包被过的24孔培养板内，以37℃、5％co2浓度的条
件，分别在两种不同的培养基配方条件下进行培养。细胞按照相等接种密度传代培养至第三代后再接着培养至第14天，对不同培养基配方下的乳腺癌细胞进行细胞核荧光染色和计数。具体地，用pbs缓冲液润洗各组细胞2次，采用4％多聚甲醛将细胞固定15分钟，随后用含1％bsa(上海生工生物制)、1％triton x-100(生工生物制)的tbst(tbs(生工生物制)+0.1％tween 20)在室温下孵育细胞一个小时，tbst缓冲液冲洗3次，每次3分钟。除去tbst液。用1μg/ml的dapi染料(sigma公司制)孵育细胞10分钟。pbs漂洗细胞一次。用一滴封片剂(thermo fisher scientific公司制)封闭盖玻片后，在100倍荧光显微镜下进行随机视野的拍摄。
[0086]
代表性结果示于图2a和图2b。图2a为2#乳腺癌细胞在给予对照培养基和本发明培养基连续培养至第三代后，再按3
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104个/孔密度接着培养14天后的镜下照片。图2b显示采用和2#同样操作的不同来源患者的乳腺癌细胞(1#～3#)的dapi计数结果统计。纵坐标为随机视野下dapi染色的计数结果统计。由图2a和图2b可知，与使用对照培养基相比，使用本发明培养基培养至第三代后细胞数量可在14天内继续提高约5.2倍。
[0087]
[实施例2]
[0088]
人乳腺上皮细胞的体外持续培养及与现有培养方法的比较
[0089]
(1)人乳腺肿瘤组织来源的原代乳腺上皮细胞的培养
[0090]
使用与实施例1的(1)同样的方法分别从两例乳腺肿瘤患者的癌组织分离获得原代乳腺癌细胞(6#，7#)。接着，将分离得到的乳腺癌细胞用血细胞计数板进行计数，然后按相同密度(2
×
105个/孔)将6#平行接种至两个matrigel(corning公司制)包被处理过的6孔板内。其中，包被方法为：将matrigel使用dmem/f12培养基按1:50稀释比例，配制成细胞外基质稀释液，在6孔培养板内加入1.5ml/孔的细胞外基质胶稀释液使其完全覆盖培养板孔的底部，在37℃培养箱内静置1小时后，移除细胞外基质胶稀释液，得到包被有细胞外基质的培养板。
[0091]
向两个包被有细胞外基质的6孔板培养孔中分别添加3ml/孔按照实施例1的(5)中配制的对照培养基和本发明培养基，在37℃以5％co2浓度的条件进行培养。培养开始后每3天进行一次培养基的更换。
[0092]
新鲜分离得到的原代乳腺癌细胞7#按照6#的同样方法进行重复操作。
[0093]
(2)采用不同人乳腺上皮细胞培养基进行体外持续培养的效果比较
[0094]
当人乳腺癌细胞在培养板内生长达到约80％板底面积时，弃去原6孔板内的培养基上清。加入1ml 0.05％胰酶(thermo fisher：25300062)对细胞进行消化，37℃下孵育10～20分钟。待细胞完全消化后，用含有10％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem/f12培养液5ml重悬消化处理后的细胞并收集至离心管内，以300g/分钟转速离心5分钟。使用对照培养基或本发明培养基重悬离心后的细胞沉淀，细胞计数板对细胞悬液进行计数。按1:10传代比例将各组细胞接种置另一包被有matrigel的12孔培养板中继续培养。
[0095]
当传代后的细胞在培养板内生长再次达到约80％板底面积时，再次按上述操作方法消化收集所培养获得的细胞并计数。同样按1:10比例接种并持续培养。
[0096]
原代乳腺癌细胞7#按照6#的同样方法进行重复操作。
[0097]
图3a是在100倍相差显微镜下对采用对照培养基和本发明的培养基分别培养至第
二代和第五代的6#细胞进行拍摄得到的细胞照片。
[0098]
图3b是以培养天数为横坐标，细胞群体倍增数为纵坐标，采用graphpad prism7.0软件绘制的本发明培养基和对照培养基培养条件下6#细胞的持续生长曲线。
[0099]
以下为原代乳腺上皮细胞在不同技术培养条件下细胞的群体倍增数的计算公式：
[0100]
细胞群体倍增数＝[log(n/x0)]/log2
[0101]
其中，n为传代时的细胞数目，x0为初始接种时的细胞数目(参见greenwood等，environ mol mutagen 2004，43(1):36-44)。
[0102]
图4a是7#细胞按照同样的操作步骤持续培养后，在100倍相差显微镜下对采用对照培养基和本发明的培养基分别培养至第二代和第四代的7#细胞进行拍摄得到的细胞照片。图4b是采用graphpad prism7.0软件绘制的本发明培养基和对照培养基培养条件下7#细胞的培养天数-群体倍增数的曲线图。
[0103]
由图3a、3b和图4a、4b可以确认，采用本发明的培养基培养的乳腺癌细胞可持续增殖，其增殖速率明显优于已知的对照培养基。
[0104]
[实施例3]
[0105]
乳腺上皮细胞免疫标记物的鉴定
[0106]
(1)按照实施例1的(5)的描述配置对照培养基和本发明的培养基。
[0107]
(2)从一例乳腺癌患者的临床手术切除样本取出约黄豆粒大小的癌组织，使用与实施例1的(1)同样的方法分别分离获得原代乳腺癌细胞(3#)。分别使用实施例2的(1)和(2)中的方法平行培养原代乳腺癌细胞(3#)至第三代。
[0108]
(3)采用免疫荧光法检测人乳腺癌细胞上与癌症相关的重要生物标记物的表达。
[0109]
本实验中所用的一抗为ck8(abcam公司制)和ck14(abcam公司制)。针对ck8，使用二抗anti-mouse igg(h+l),f(ab')2fragment(alexa488conjugate)(cell signaling technology公司制)，针对ck14，使用二抗anti-rabbit igg(h+l),f(ab')2fragment(alexa594conjugate)(cell signaling technology公司制)。其中，ck8是乳腺癌的重要生物标志物，一般在乳腺肿瘤腔面细胞上表达；ck14则是公认的乳腺肿瘤肌上皮细胞的重要生物标志物。在临床上，ck8和ck14常用于乳腺癌的鉴别诊断。
[0110]
具体而言，弃去原6孔板内的培养基上清，加入1ml 0.05％胰酶(thermo fisher公司制)对细胞进行消化，37℃下孵育15分钟后，用含有10％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem/f12培养液5ml重悬消化处理后的细胞并收集至离心管内，以300g/分钟转速离心5分钟。分别使用本发明的培养基和已知的对照培养基重悬离心后的各组细胞沉淀，使用细胞计数板对细胞悬液进行计数。按4
×
104个/盖玻片的密度将细胞分别接种至包被有matrigel的盖玻片上，包被方式同实施例1的(2)，继续分别使用本发明的培养基和已知的对照培养基对各组细胞分别进行培养，使细胞在盖玻片上生长。
[0111]
培养14天后，用pbs缓冲液润洗细胞2次，采用4％多聚甲醛将细胞固定15分钟，随后用含1％bsa(上海生工生物制)、1％triton x-100的tbst(tbs+0.1％tween 20)在室温下孵育细胞一个小时，tbst缓冲液冲洗3次，每次3分钟。除去tbst液，在载玻片上滴加50μl一抗稀释液(1:100倍稀释ck8抗体；1:1000倍稀释ck14抗体)，4℃孵育12～16小时后，pbs冲洗三次，每次3分钟；滴加二抗anti-mouse igg(h+l),f(ab')2fragment(alexa488conjugate)(8μg/ml)，室温下孵育60分钟，pbs冲洗三次，每次3分钟。接着，滴加二抗
anti-rabbit igg(h+l),f(ab')2fragment(alexa594conjugate)(8μg/ml)，室温下孵育60分钟，pbs冲洗三次，每次3分钟。用1μg/ml的dapi染料(sigma公司制)孵育细胞10分钟。pbs漂洗细胞一次。用一滴封片剂(thermo fisher scientific公司制)封闭盖玻片后，在100倍荧光显微镜下进行拍摄。
[0112]
结果如图5所示，显示腔面细胞(ck8)和肌上皮细胞(ck14)特异性生物标记物免疫荧光染色的结果；此外，dapi荧光标记用于指示细胞核位置和数目，merge用于指示将ck8、ck14和dapi三种荧光染色标记重叠后产生的成像结果。
[0113]
根据图5可知，采用本发明的培养基和培养方法可培养得到大量高表达乳腺癌细胞特异性生物标记物ck8和ck14蛋白的细胞；而采用已知的对照培养基培养的源自同一样本的原代乳腺癌细胞仅培养得到少数的乳腺癌细胞，提示采用本发明的培养技术可实现高效培养乳腺癌细胞的效果。
[0114]
[实施例4]
[0115]
乳腺癌细胞的体外药物敏感性测试
[0116]
下面以乳腺肿瘤患者手术切除样本为例，说明由病人来源的乳腺肿瘤组织样本培养得到的乳腺癌细胞可以用于检测病人肿瘤细胞对不同药物的敏感性。
[0117]
一、原代乳腺癌细胞的铺板：使用实施例1的(5)的本发明培养基，通过实施例2的(1)中所述方法培养得到乳腺肿瘤细胞(5#)，将其按3000～5000个/孔密度接种于384孔板中，使细胞贴壁过夜。
[0118]
二、药物梯度实验：
[0119]
(1)采用浓度梯度稀释的方法配制药物贮存板：分别吸取10μl的待测药物母液(药物母液浓度按2倍于该药物在人体中的最大血药浓度c
max
配制)，加入到含20μl的dmso的0.5ml的ep管中，再从上述ep管中吸取10μl到第二个已装有20μl的dmso的0.5ml的ep管中，即按照1:3稀释药品。重复以上方法，依次稀释，最后得到加药所需的8或9种浓度。将不同浓度的药物加入384孔药物储存板中。溶剂对照组各孔加入等体积的dmso作为对照。本实施例中，待测药物为临床上已批准的抗肿瘤药物多西他赛(mce公司制)、帕博西尼(mce公司制)、多芬替尼(mce公司制)、卡培他滨(mce公司制)、克唑替尼(mce公司制)和依托泊苷(mce公司制)。
[0120]
(2)使用高通量自动化工作站(购自perkin elmer公司)将384孔药物贮存板内的不同浓度药物和溶剂对照加入到铺有乳腺肿瘤细胞的384孔细胞培养板中，药物组和溶剂对照组都各设3个复孔。每孔加入药物体积为100nl。
[0121]
(3)细胞活性检测：给药72小时后，用cell titer-glo检测试剂(promega公司制)检测加药培养后细胞的化学发光数值，化学发光数值的大小反映细胞活力以及药物对细胞活力的影响，每孔加入配制好的cell titer-glo检测液，混匀后使用酶标仪检测化学发光数值。
[0122]
使用graphpad prism 7.0软件作图并计算半数抑制浓度ic
50
。
[0123]
(4)药物敏感性测试结果如图6a-6f所示。
[0124]
图6a-6f表示从一个乳腺肿瘤患者的手术切除癌组织样本所培养获得的乳腺肿瘤细胞(5#)对三个靶向药物帕博西尼、克唑替尼和多芬替尼及三个化疗药物多西他赛、卡培他滨和依托泊苷的药物敏感性。结果显示，同一病人的细胞对不同药物具有不同的敏感性。
[0125]
其中，乳腺癌细胞(5#)对多西他赛和依托泊苷的敏感度较高，而对卡培他滨、克唑替尼、多芬替尼和帕博西尼的敏感度较低。这提示多西他赛和依托泊苷可能是治疗5#病人乳腺肿瘤的潜在有效药物。
[0126]
本实施例的结果表明，应用本发明的乳腺上皮细胞培养基培养患者来源的乳腺癌细胞并进行体外药物敏感性测试，在筛选和预测乳腺肿瘤患者临床用药疗效方面具有应用潜力。
[0127]
工业应用性
[0128]
本发明提供一种用于乳腺上皮细胞的培养基及培养方法，可将培养得到的细胞应用于药物的疗效评估和筛选。因而，本发明适于工业应用。
[0129]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种用于培养乳腺上皮细胞的培养基，特征在于：其含有β-雌二醇、胰岛素生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子-α、以及任选的成纤维细胞生长因子10。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：β-雌二醇的浓度为5nm～50nm；胰岛素生长因子1的浓度为10ng/ml～200ng/ml；碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml～200ng/ml；肿瘤坏死因子-α的浓度为2ng/ml～100ng/ml。3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：β-雌二醇的浓度为5nm～10nm；胰岛素生长因子1的浓度为20ng/ml～100ng/ml；碱性成纤维细胞生长因子的浓度为20ng/ml～100ng/ml；肿瘤坏死因子-α的浓度为5ng/ml～50ng/ml；任选添加的成纤维细胞生长因子10的浓度为0ng/ml～50ng/ml。4.如权利要求1～3中任一项所述的基，其特征在于所述培养基还含有双向调节素、表皮生长因子、胰岛素、b27、y27632、神经调节素1、成纤维细胞生长因子7、a8301、和glutamax-i。5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于所述培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：双向调节素的含量为10ng/ml～100ng/ml，表皮生长因子的含量为2.5ng/ml～20ng/ml，胰岛素的含量为1μg/ml～10μg/ml，b27以1:25～1:100的体积比加入，y27632含量为5μm～15μm，神经调节素1的含量为5nm～20nm，成纤维细胞生长因子7的含量为2.5ng/ml～20ng/ml，a8301的含量为100nm～500nm，glutamax-i以1:50～1:200体积比加入。6.如权利要求1～3中任一项所述的培养基，其特征在于所述培养基还含有选自dmem/f12、dmem、f12或rpmi-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素b和primocin中的一种或多种的抗生素。7.一种培养乳腺上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括使用如权利要求1～6中任一项所述的培养基对原代乳腺上皮细胞进行培养。8.如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制如权利要求1～6中所述的培养基；；(2)用细胞外基质胶包被培养器皿；(3)在包被好的培养器皿内接种原代乳腺上皮细胞，使用步骤(1)中配制的培养基进行培养。9.一种用于评估或筛选治疗乳腺疾病的药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得原代乳腺上皮细胞，并使用如权利要求7或8所述的培养方法进行培养；(2)选定需要检测的药物并按照浓度梯度进行配制；(3)对步骤(1)中培养得到的乳腺上皮细胞添加步骤(2)中配制的不同浓度的药物；和
(4)进行细胞活性测试。

技术总结
本发明提供一种用于培养乳腺上皮细胞的培养基，其含有β-雌二醇、胰岛素生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子-α、以及任选的成纤维细胞生长因子10。本发明还提供采用上述培养基培养乳腺上皮细胞的方法，以及采用该培养方法得到的细胞在药物疗效评估或筛选中的方法和应用。选中的方法和应用。


技术研发人员：刘青松 刘飞扬 张杰 陈程 王文超
受保护的技术使用者：合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/8/1