用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物探针组合物以及试剂盒的制作方法

1.本发明涉及用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物探针组合物以及试剂盒。


背景技术：

2.幽门螺旋杆菌(h.pylori)是世界上最常见的病原体之一。幽门螺旋杆菌是引起消化性溃疡和慢性活动性胃炎的主要病因，也是世界卫生组织于2012年认定其为胃癌第一类致癌原。及时地诊断并根除幽门螺旋杆菌是治愈胃病的前提。
3.细胞毒素相关基因(cytotoxin associated genea,caga)是幽门螺杆菌中重要的毒力基因，编码表达细胞毒素相关蛋白a(cytotoxin associated protein a,caga)，是幽门螺杆菌产生细胞毒性的重要效应蛋白，其与严重的胃炎、萎缩(atrophy)、异型增生(dysplasia) 及胃腺癌有更高的相关性。caga基因具有多态性，这种多态性可导致检测方法的敏感性差异，造成假阳性和假阴性结果的出现。
4.在临床应用方面，幽门螺杆菌的检查方法主要为经典的pcr方法，一般只用1对或2对引物进行pcr扩增。一方面，幽门螺旋杆菌的dna突变性非常高，存在大量的变异，具有高度不一致性，单一引物pcr常常不能检测到dna突变的菌种，很容易造成假阴性的结果。另一方面，只用一对pcr引物会有很高的概率与其他菌种或生物体的dna片段具有同源性，而导致假阳性结果(例如目前常用的16s亚基序列虽具有保守性比较高的优点，但是它的特异性相对较低，因为所有的细菌核糖体中均有16s亚基序列，虽然在胃酸这一强腐蚀性的液体中能存活的细菌大多为幽门螺旋杆菌，但是在取样和dna提取的过程中若发生细菌污染，则会影响检测结果，造成假阳性)。因此，现有方法的临床敏感性不是十分理想。
5.幽门螺杆菌分为西方型和东亚型，其中东亚型又称东亚高危型。东亚型的幽门螺杆菌毒力更高，更容易引起胃病的发展以及胃癌的发生。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物探针组合物以及试剂盒。
7.本发明提供了一种特异引物探针组组合(引物探针组组合甲)，由如下四个引物探针组组成：引物探针组h48、引物探针组h51、引物探针组h53和引物探针组h54；
8.引物探针组h48由引物h48-f、引物h48-r和探针h48-p组成；引物h48-f为序列表的序列1所示的单链dna分子，引物h48-r为序列表的序列2所示的单链dna分子，探针h48-p 的核苷酸序列如序列表的序列3所示；
9.引物探针组h51由引物h51-f、引物h51-r和探针h51-p组成；引物h51-f为序列表的序列4所示的单链dna分子，引物h51-r为序列表的序列5所示的单链dna分子，探针h51-p 的核苷酸序列如序列表的序列6所示；
10.引物探针组h53由引物h53-f、引物h53-r、探针h53-p2和探针h53-p3组成；引物
h53-f 为序列表的序列7所示的单链dna分子，引物h53-r为序列表的序列8所示的单链dna分子，探针h53-p2的核苷酸序列如序列表的序列9所示，探针h53-p3的核苷酸序列如序列表的序列10所示；
11.引物探针组h54由引物h54-f、引物h54-r和探针h54-p组成；引物h54-f为序列表的序列11所示的单链dna分子，引物h54-r为序列表的序列12所示的单链dna分子，探针h54-p 的核苷酸序列如序列表的序列13所示。
12.各个引物和探针的摩尔配比如下：h48-f 0.3：h48-r 0.3：h48-p 0.15：h51-f 0.15： h51-r 0.15：h51-p 0.1：h53-f 0.45：h53-r 0.45：h53-p2 0.1：h53-p3 0.1：h54-f 0.45： h54-r 0.45：h54-p 0.45。
13.探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有荧光淬灭基团。
14.引物探针组组合甲中，四种探针的荧光基团各不相同。
15.本发明还保护引物探针组组合甲的应用，为如下(g1)和/或(g2)和/或(g3)和/或(g4) 和/或(g5)和/或(g6)和/或(g7)和/或(g8)和/或(g9)和/或(g10)和/或(g11)和 /或(g12)：
16.(g1)制备用于检测受试者是否感染幽门螺杆菌的试剂盒；
17.(g2)制备用于检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌的试剂盒；
18.(g3)制备用于鉴定幽门螺杆菌的试剂盒；
19.(g4)制备用于检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；
20.(g5)制备用于检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；
21.(g6)制备用于鉴定东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；
22.(g7)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；
23.(g8)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；
24.(g9)鉴定幽门螺杆菌；
25.(g10)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；
26.(g11)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；
27.(g12)鉴定东亚型幽门螺杆菌。
28.本发明还保护一种试剂盒，包括引物探针组组合甲；所述试剂盒的功能为如下(h1)和/ 或和/(h2)和/或(h3)和/或(h4)和/或(h5)和/或(h6)：
29.(h1)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；
30.(h2)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；
31.(h3)鉴定幽门螺杆菌；
32.(h4)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；
33.(h5)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；
34.(h6)鉴定东亚型幽门螺杆菌。
35.所述试剂盒还包括pcr反应液。pcr反应液：premix ex taq(probe qpcr)5.5μl，加 dnase/rnase-free去离子水至6μl。
36.所述试剂盒还包括四种标准品质粒：标准品质粒h48、标准品质粒h51、标准品质粒h53 和标准品质粒h54。将序列表的序列14所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒 h48。将序列表的序列15所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h51。将序列
表的序列16所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h53。将序列表的序列17 所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h54。
37.本发明还保护一种特异引物探针组组合(引物探针组组合乙)，由如下三个引物探针组组成：引物探针组h48、引物探针组h51和引物探针组h53；
38.引物探针组h48由引物h48-f、引物h48-r和探针h48-p组成；引物h48-f为序列表的序列1所示的单链dna分子，引物h48-r为序列表的序列2所示的单链dna分子，探针h48-p 的核苷酸序列如序列表的序列3所示；
39.引物探针组h51由引物h51-f、引物h51-r和探针h51-p组成；引物h51-f为序列表的序列4所示的单链dna分子，引物h51-r为序列表的序列5所示的单链dna分子，探针h51-p 的核苷酸序列如序列表的序列6所示；
40.引物探针组h53由引物h53-f、引物h53-r、探针h53-p2和探针h53-p3组成；引物h53-f 为序列表的序列7所示的单链dna分子，引物h53-r为序列表的序列8所示的单链dna分子，探针h53-p2的核苷酸序列如序列表的序列9所示，探针h53-p3的核苷酸序列如序列表的序列10所示。
41.各个引物和探针的摩尔配比如下：h48-f 0.3：h48-r 0.3：h48-p 0.15：h51-f 0.15： h51-r 0.15：h51-p 0.1：h53-f 0.45：h53-r 0.45：h53-p2 0.1：h53-p3 0.1。
42.探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有荧光淬灭基团。
43.引物探针组组合乙中，三种探针的荧光基团各不相同。
44.本发明还保护引物探针组组合乙的应用，为如下(g1)和/或(g2)和/或(g3)和/或(g4) 和/或(g5)和/或(g6)和/或(g7)和/或(g8)和/或(g9)和/或(g10)和/或(g11)和 /或(g12)：
45.(g1)制备用于检测受试者是否感染幽门螺杆菌的试剂盒；
46.(g2)制备用于检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌的试剂盒；
47.(g3)制备用于鉴定幽门螺杆菌的试剂盒；
48.(g4)制备用于检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；
49.(g5)制备用于检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；
50.(g6)制备用于鉴定东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；
51.(g7)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；
52.(g8)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；
53.(g9)鉴定幽门螺杆菌；
54.(g10)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；
55.(g11)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；
56.(g12)鉴定东亚型幽门螺杆菌。
57.本发明还保护一种试剂盒，包括引物探针组组合乙；所述试剂盒的功能为如下(h1)和/ 或(h2)和/或(h3)和/或(h4)和/或(h5)和/或(h6)：
58.(h1)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；
59.(h2)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；
60.(h3)鉴定幽门螺杆菌；
61.(h4)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；
62.(h5)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；
63.(h6)鉴定东亚型幽门螺杆菌。
64.所述试剂盒还包括pcr反应液。pcr反应液：premix ex taq(probe qpcr)5.5μl，加 dnase/rnase-free去离子水至6μl。
65.所述试剂盒还包括三种标准品质粒：标准品质粒h48、标准品质粒h51和标准品质粒h53。将序列表的序列14所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h48。将序列表的序列15所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h51。将序列表的序列16所示的 dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h53。
66.本发明提供的引物探针组组合通过多个基因位点的同时检测，能够克服幽门螺杆菌基因组dna高度不一致的问题，特异性强、灵敏度高，能够简便、快速、准确地检测待测样品是否存在幽门螺杆菌的感染以及是否存在东亚型幽门螺杆菌感染，避免基因突变造成的结果假阴性，能够极大的提高检出率。
67.应用本发明提供的试剂盒检测或辅助检测幽门螺杆菌，具有高灵敏度和高准确度的优点，且操作简便、易于掌握，能够准确、有效地判断是否存在幽门螺杆菌感染以及是否存在东亚型幽门螺杆菌感染。
附图说明
68.图1为实施例1的步骤2的扩增曲线。
69.图2为实施例5的扩增曲线。
70.图3为实施例9中示例性的阳性样本结果。
71.图4为实施例9中示例性的阴性样本结果。
具体实施方式
72.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
73.premix ex taq(probe qpcr)：规格为2倍浓度，takara bio,货号为rr390a。
74.市售预混液1：tbpremix ex taq
tm ii(tli rnaseh plus)；http://www.takarabiomed.com.cn/productshow.aspx？m＝20141215102926123157&productid ＝20141227082641313454。
75.市售预混液2：tbpremix dimereraser
tm
(perfect real time)； http://www.takarabiomed.com.cn/productshow.aspx？m＝20141215102926123157&productid ＝20141227084317280521。
76.实施例1、caga引物对的筛选
77.由于caga基因具有多态性，因此设计针对东亚型幽门螺杆菌caga基因的特异区中的多个靶区段的多个引物对。示例性的，部分引物对序列如下：
78.引物对1：
79.f：tctaattaagggaagaatactccaataa；
80.r：tcgcgatcgggtgttgatttta。
81.引物对2：
82.f：gatcaggcaagcttttgatg；
83.r：ctaaaagattgtttggcaga。
84.引物对3：
85.f：tctaattaagggaagaatactccaataa；
86.r：ctgtagaagattgtttggcaga。
87.引物对4：
88.f：gataacaggcaagcttttgatg；
89.r：tcgcgatcgggtgttgatttta。
90.引物对5：
91.f：gataacaggcaagcttttgaag；
92.r：ctgcaaaagattgtttggga。
93.引物对6：
94.f：gataacaggcaagcttttgaag；
95.r：tcgtcgatcgggtgttgatta。
96.引物对7：
97.f3：gataacaggcaagcttttgagg；
98.r：ctgcaaaagattgtttggga。
99.引物对8：
100.f：gataacaggcaagcttttgagg；
101.r：tcggatcgatcgggtgttgatta。
102.引物对9：
103.f：aggcatgataaagttgat；
104.r：aaaggtccgccgagatcat。
105.引物对10：
106.f：accctagtcggtaatggg；
107.r：tgccctacaccacccaaa。
108.引物对11：
109.f：aaaaatccgactcaatc；
110.r：gctttagctgataccgc。
111.引物对12：
112.f：aaaggagtgggcggtttca；
113.r：cctgcttgatttgcctcatca。
114.引物对13：
115.f：accctagtcagtaatggg；
116.r：gcaattttgttaatccggtc。
117.引物对14：
118.f：gcatcagcaggtaaaggagt；
119.r：gttttagcttctgacactgc。
120.引物对15：
121.f：aggcatgataaagatgat；
122.r：cctgcttgattttcatca。
123.引物对16：
124.f(序列表的序列1)：gcatcagcaggtaaaggagt；
125.r(序列表的序列2)：cctgcttgatttgcctcatca。
126.18例临床样本：样本为通过胃镜获取的患者的胃部组织或黏液，均已由医院确诊为幽门螺杆菌阳性。患者均为知情同意的志愿者。
127.1、将18例临床样本等质量混合，然后提取总dna。
128.2、以步骤1得到的dna为模板，分别采用各个引物对进行pcr扩增。
129.反应体系组成(10μl)：1μl模板溶液(dna含量为5-20ng)、2.5μl市售预混液1、 2μl市售预混液2、每条引物，余量为水。反应体系中，引物f的浓度为0.4μm、引物r的浓度为0.4μm。
130.pcr扩增程序：
131.第一步：94℃2min；
132.第二步：94℃1min，63-59℃(第一个循环为63℃，每个循环降低1℃)40s，72℃30s， 5个循环；
133.第三步：94℃20s，58℃20s，72℃25s，35个循环；72℃收集sybr荧光信号。
134.结果见图1。引物对16的扩增效果显著优于其他引物对。由于模板dna提取自混合临床样本，引物对扩增效果越高，意味着其靶序列越多，也就是说其可以实现扩增的caga基因多态类型越多。
135.3、分别提取18例临床样本的dna。
136.4、分别以步骤3提取的各个dna为模板，分别采用各个引物对进行pcr扩增。
137.反应体系组成以及pcr扩增程序同步骤2。
138.对于18例临床样本来说，引物对1的检出率为0，引物对2的检出率为5.6％，引物对3 的检出率为5.6％，引物对4的检出率为0，引物对5的检出率为0，引物对6的检出率为11.1％，引物对7的检出率为0，引物对8的检出率为0，引物对9的检出率为0，引物对10的检出率为5.6％，引物对11的检出率为0，引物对12的检出率为0，引物对13的检出率为0，引物对14的检出率为0，引物对15的检出率为0，引物对16的检出率为83.3％。
139.结果表明，引物对16可以鉴定东亚型幽门螺杆菌caga基因的特异区最多的突变形式。
140.实施例2、引物探针的选择
141.设计大量引物探针组，并验证其扩增效率，其中扩增效率最高的引物探针组为引物探针组h48、引物探针组h51、引物探针组h53、引物探针组和h57引物探针组h54。
142.引物探针组h48如下：
143.h48-f(序列表的序列1)：5
’‑
gcatcagcaggtaaaggagt-3’；
144.h48-r(序列表的序列2)：5
’‑
cctgcttgatttgcctcatca-3’；
145.h48-p(序列表的序列3)：5
’‑
6-fam-tcagctagccctgaacccatttacgctac-bhq1-3’。
146.引物探针组h51如下：
147.h51-f(序列表的序列4)：5
’‑
tgcgaagtggagccaatctt-3’；
148.h51-r(序列表的序列5)：5
’‑
ggaacgtattcaccgcaaca-3’；
149.h51-p(序列表的序列6)：5
’‑
texas red-cctctcagttcggattgtaggctgcaac-bhq2-3’。
150.引物探针组h53如下：
151.h53-f(序列表的序列7)：5
’‑
gacagcggtaaggtttga-3’；
152.h53-r(序列表的序列8)：5
’‑
cttgcctatcaaccaacg-3’；
153.h53-p2(序列表的序列9)：5
’‑
vic-ttctgttgccgccaatgtcaatca-bhq1-3’；
154.h53-p3(序列表的序列10)：5
’‑
vic-ttctgctgccgccaatgtcaatca-bhq1-3’。
155.引物探针组h54如下：
156.h54-f(序列表的序列11)：5
’‑
gtagcaatttgtactgatgg-3’；
157.h54-r(序列表的序列12)：5
’‑
gaggtctaagtgatgacag-3’；
158.h54-p(序列表的序列13)：5
’‑
cy5-tgtccttggctcttctggca-bhq2-3’。
159.引物探针组h57如下：
160.h57-f：5
’‑
gcacgatattccctaaattatc-3’；
161.h57-r：5
’‑
caaccaattaagccagga-3’；
162.h57-p：5
’‑
cy3-tagcctgtcagcatcgccat-bhq-2-3’；
163.48例临床样本：为从医院获取的通过胃镜获取的人的胃部组织或黏液。
164.提取临床样本的基因组dna，采用引物探针组合进行多重pcr扩增。
165.多重pcr扩增的反应体系(11μl)中，含6μl pcr反应液、引物探针组合的各条引物和探针、1μl基因组dna溶液(dna含量为5-20ng)。pcr反应液：premix ex taq(probe qpcr) 5.5μl，加dnase/rnase-free去离子水至6μl。
166.多重pcr扩增的反应条件：94℃2min；94℃45s、退火1min(第一个循环退火温度为 61℃，之后每隔循环比前一循环降低1℃)，5个循环；94℃20s、56℃1min，40个循环； 40℃30s。
167.检测texas red荧光信号和vic荧光信号，如果texas red荧光信号和/或vic荧光信号显示为s型扩增曲线，且ct≤29判断为阳性(即具有幽门螺杆菌)，如ct≥32判断为阴性(不具有幽门螺杆菌或幽门螺杆菌低于检测限)。
168.分别采用第一组引物探针组合和第二组引物探针组合。第一组引物探针组合，由引物探针组h48、引物探针组h51、引物探针组h53和引物探针组h54组成。第二组引物探针组合，由引物探针组h48、引物探针组h51、引物探针组h54和引物探针组h57组成。
169.结果见表1。第一组引物探针组合检测的幽门螺杆菌阳性样本数为17个，第二组引物探针组合检测的幽门螺杆菌阳性样本数为9个。经后续追踪，第一组引物探针组合的阳性样本均确诊为幽门螺杆菌阳性。
170.表1
[0171][0172][0173]
实施例3、引物以及标准品质粒的制备
[0174]
一、引物的制备
[0175]
分别制备以下各条引物和探针：
[0176]
h48-f(序列表的序列1)：5
’‑
gcatcagcaggtaaaggagt-3’；
[0177]
h48-r(序列表的序列2)：5
’‑
cctgcttgatttgcctcatca-3’；
[0178]
h48-p(序列表的序列3)：5
’‑
6-fam-tcagctagccctgaacccatttacgctac-bhq1-3’；
[0179]
h51-f(序列表的序列4)：5
’‑
tgcgaagtggagccaatctt-3’；
[0180]
h51-r(序列表的序列5)：5
’‑
ggaacgtattcaccgcaaca-3’；
[0181]
h51-p(序列表的序列6)：5
’‑
texas red-cctctcagttcggattgtaggctgcaac-bhq2-3’。
[0182]
h53-f(序列表的序列7)：5
’‑
gacagcggtaaggtttga-3’；
[0183]
h53-r(序列表的序列8)：5
’‑
cttgcctatcaaccaacg-3’；
[0184]
h53-p2(序列表的序列9)：5
’‑
vic-ttctgttgccgccaatgtcaatca-bhq1-3’；
[0185]
h53-p3(序列表的序列10)：5
’‑
vic-ttctgctgccgccaatgtcaatca-bhq1-3’；
[0186]
h54-f(序列表的序列11)：5
’‑
gtagcaatttgtactgatgg-3’；
[0187]
h54-r(序列表的序列12)：5
’‑
gaggtctaagtgatgacag-3’；
[0188]
h54-p(序列表的序列13)：5
’‑
cy5-tgtccttggctcttctggca-bhq2-3’。
[0189]
引物均为单链dna分子。f代表上游引物，r代表下游引物。h48-f与h48-r的靶序列位于幽门螺杆菌caga基因(东亚型幽门螺杆菌caga基因独有的特异区)。h51-f与h51-r的靶序列位于幽门螺杆菌核糖体16s核糖体rna(ribosomal 16s ribosomal rna)基因。h53-f与h53-r的靶序列位于幽门螺杆菌脲酶亚单位α(urease subunit alpha)基因。h54-f与h54-r的靶序列位于人血红蛋白亚单位β(hemoglobin subunit beta)(hbb)基因。
[0190]
探针为单链dna分子，5’末端具有荧光基团，3’末端具有荧光淬灭基团。6-fam：激发光494nm，发射光518nm。texas red：激发光595nm，发射光615nm。vic：激发光538nm，发射光554nm。cy5：激发光643nm，发射光667nm。
[0191]
h48-f、h48-r和h48-p组成引物探针组h48。h51-f、h51-r和h51-p组成引物探针组h51。h53-f、h53-r、h53-p2和h53-p3组成引物探针组h53。h54-f、h54-r 和h54-p组成引物探针组h54。
[0192]
二、标准品质粒的制备
[0193]
将序列表的序列14所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h48。
[0194]
将序列表的序列15所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h51。
[0195]
将序列表的序列16所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h53。
[0196]
将序列表的序列17所示的dna分子插入pmd18-t载体，得到标准品质粒h54。
[0197]
如无特殊说明，后续实施例中的四种标准品质粒，指的是标准品质粒h48、标准品质粒h51、标准品质粒h53和标准品质粒h54。
[0198]
实施例4、引物探针组浓度的优化
[0199]
取四种标准品质粒混合液，用1
×
te溶液悬浮，得到模板溶液。模板溶液中每种质粒浓度均为32000拷贝/μl。
[0200]
一、引物探针组h48浓度的优化
[0201]
设置不同分组，进行引物探针组h48中引物和探针浓度的优化。
[0202]
分组分别如下：
[0203]
反应体系中，h48-f浓度为0.9μm，h48-r浓度为0.9μm，h48-p浓度为0.25μm；
[0204]
反应体系中，h48-f浓度为0.9μm，h48-r浓度为0.9μm，h48-p浓度为0.2μm；
[0205]
反应体系中，h48-f浓度为0.9μm，h48-r浓度为0.9μm，h48-p浓度为0.15μm；
[0206]
反应体系中，h48-f浓度为0.9μm，h48-r浓度为0.9μm，h48-p浓度为0.1μm；
[0207]
反应体系中，h48-f浓度为0.45μm，h48-r浓度为0.45μm，h48-p浓度为0.25μm；
[0208]
反应体系中，h48-f浓度为0.45μm，h48-r浓度为0.45μm，h48-p浓度为0.2μm；
[0209]
反应体系中，h48-f浓度为0.45μm，h48-r浓度为0.45μm，h48-p浓度为0.15μm；
[0210]
反应体系中，h48-f浓度为0.45μm，h48-r浓度为0.45μm，h48-p浓度为0.1μm；
[0211]
反应体系中，h48-f浓度为0.3μm，h48-r浓度为0.3μm，h48-p浓度为0.25μm；
[0212]
反应体系中，h48-f浓度为0.3μm，h48-r浓度为0.3μm，h48-p浓度为0.2μm；
[0213]
反应体系中，h48-f浓度为0.3μm，h48-r浓度为0.3μm，h48-p浓度为0.15μm；
[0214]
反应体系中，h48-f浓度为0.3μm，h48-r浓度为0.3μm，h48-p浓度为0.1μm；
[0215]
反应体系中，h48-f浓度为0.15μm，h48-r浓度为0.15μm，h48-p浓度为0.25μm；
[0216]
反应体系中，h48-f浓度为0.15μm，h48-r浓度为0.15μm，h48-p浓度为0.2μm；
[0217]
反应体系中，h48-f浓度为0.15μm，h48-r浓度为0.15μm，h48-p浓度为0.15μm；
[0218]
反应体系中，h48-f浓度为0.15μm，h48-r浓度为0.15μm，h48-p浓度为0.1μm；
[0219]
反应体系中，h48-f浓度为0.075μm，h48-r浓度为0.075μm，h48-p浓度为0.25μm；
[0220]
反应体系中，h48-f浓度为0.075μm，h48-r浓度为0.075μm，h48-p浓度为0.2μm；
[0221]
反应体系中，h48-f浓度为0.075μm，h48-r浓度为0.075μm，h48-p浓度为0.15μm；
[0222]
反应体系中，h48-f浓度为0.075μm，h48-r浓度为0.075μm，h48-p浓度为0.1μm。
[0223]
优化浓度：h48-f浓度为0.3μm，h48-r浓度为0.3μm，h48-p浓度为0.15μm。
[0224]
二、引物探针组h51浓度的优化
[0225]
设置不同分组，进行引物探针组h51中引物和探针浓度的优化。
[0226]
分组分别如下：
[0227]
反应体系中，h51-f浓度为0.9μm，h51-r浓度为0.9μm，h51-p浓度为0.25μm；
[0228]
反应体系中，h51-f浓度为0.9μm，h51-r浓度为0.9μm，h51-p浓度为0.2μm；
[0229]
反应体系中，h51-f浓度为0.9μm，h51-r浓度为0.9μm，h51-p浓度为0.15μm；
[0230]
反应体系中，h51-f浓度为0.9μm，h51-r浓度为0.9μm，h51-p浓度为0.1μm；
[0231]
反应体系中，h51-f浓度为0.45μm，h51-r浓度为0.45μm，h51-p浓度为0.25μm；
[0232]
反应体系中，h51-f浓度为0.45μm，h51-r浓度为0.45μm，h51-p浓度为0.2μm；
[0233]
反应体系中，h51-f浓度为0.45μm，h51-r浓度为0.45μm，h51-p浓度为0.15μm；
[0234]
反应体系中，h51-f浓度为0.45μm，h51-r浓度为0.45μm，h51-p浓度为0.1μm；
[0235]
反应体系中，h51-f浓度为0.3μm，h51-r浓度为0.3μm，h51-p浓度为0.25μm；
[0236]
反应体系中，h51-f浓度为0.3μm，h51-r浓度为0.3μm，h51-p浓度为0.2μm；
[0237]
反应体系中，h51-f浓度为0.3μm，h51-r浓度为0.3μm，h51-p浓度为0.15μm；
[0238]
反应体系中，h51-f浓度为0.3μm，h51-r浓度为0.3μm，h51-p浓度为0.1μm；
[0239]
反应体系中，h51-f浓度为0.15μm，h51-r浓度为0.15μm，h51-p浓度为0.25μm；
[0240]
反应体系中，h51-f浓度为0.15μm，h51-r浓度为0.15μm，h51-p浓度为0.2μm；
[0241]
反应体系中，h51-f浓度为0.15μm，h51-r浓度为0.15μm，h51-p浓度为0.15μm；
[0242]
反应体系中，h51-f浓度为0.15μm，h51-r浓度为0.15μm，h51-p浓度为0.1μm；
[0243]
反应体系中，h51-f浓度为0.075μm，h51-r浓度为0.075μm，h51-p浓度为0.25μm；
[0244]
反应体系中，h51-f浓度为0.075μm，h51-r浓度为0.075μm，h51-p浓度为0.2μm；
[0245]
反应体系中，h51-f浓度为0.075μm，h51-r浓度为0.075μm，h51-p浓度为0.15μm；
[0246]
反应体系中，h51-f浓度为0.075μm，h51-r浓度为0.075μm，h51-p浓度为0.1μm。
[0247]
优化浓度：h51-f浓度为0.075μm，h51-r浓度为0.075μm，h51-p浓度为0.1μm。
[0248]
三、引物探针组h53浓度的优化
[0249]
设置不同分组，进行引物探针组h53中引物和探针浓度的优化。
[0250]
分组分别如下：
[0251]
反应体系中，h53-f浓度为0.9μm，h53-r浓度为0.9μm，h53-p2浓度为0.25μm；
[0252]
反应体系中，h53-f浓度为0.9μm，h53-r浓度为0.9μm，h53-p2浓度为0.2μm；
[0253]
反应体系中，h53-f浓度为0.9μm，h53-r浓度为0.9μm，h53-p2浓度为0.15μm；
[0254]
反应体系中，h53-f浓度为0.9μm，h53-r浓度为0.9μm，h53-p2浓度为0.1μm；
[0255]
反应体系中，h53-f浓度为0.45μm，h53-r浓度为0.45μm，h53-p2浓度为0.25μm；
[0256]
反应体系中，h53-f浓度为0.45μm，h53-r浓度为0.45μm，h53-p2浓度为0.2μm；
[0257]
反应体系中，h53-f浓度为0.45μm，h53-r浓度为0.45μm，h53-p2浓度为0.15μm；
[0258]
反应体系中，h53-f浓度为0.45μm，h53-r浓度为0.45μm，h53-p2浓度为0.1μm；
[0259]
反应体系中，h53-f浓度为0.3μm，h53-r浓度为0.3μm，h53-p2浓度为0.25μm；
[0260]
反应体系中，h53-f浓度为0.3μm，h53-r浓度为0.3μm，h53-p2浓度为0.2μm；
[0261]
反应体系中，h53-f浓度为0.3μm，h53-r浓度为0.3μm，h53-p2浓度为0.15μm；
[0262]
反应体系中，h53-f浓度为0.3μm，h53-r浓度为0.3μm，h53-p2浓度为0.1μm；
[0263]
反应体系中，h53-f浓度为0.15μm，h53-r浓度为0.15μm，h53-p2浓度为0.25μm；
[0264]
反应体系中，h53-f浓度为0.15μm，h53-r浓度为0.15μm，h53-p2浓度为0.2μm；
[0265]
反应体系中，h53-f浓度为0.15μm，h53-r浓度为0.15μm，h53-p2浓度为0.15μm；
[0266]
反应体系中，h53-f浓度为0.15μm，h53-r浓度为0.15μm，h53-p2浓度为0.1μm；
[0267]
反应体系中，h53-f浓度为0.075μm，h53-r浓度为0.075μm，h53-p2浓度为0.25μm；
[0268]
反应体系中，h53-f浓度为0.075μm，h53-r浓度为0.075μm，h53-p2浓度为0.2μm；
[0269]
反应体系中，h53-f浓度为0.075μm，h53-r浓度为0.075μm，h53-p2浓度为0.15μm；
[0270]
反应体系中，h53-f浓度为0.075μm，h53-r浓度为0.075μm，h53-p2浓度为0.1μm；
[0271]
反应体系中，h53-f浓度为0.9μm，h53-r浓度为0.9μm，h53-p3浓度为0.25μm；
[0272]
反应体系中，h53-f浓度为0.9μm，h53-r浓度为0.9μm，h53-p3浓度为0.2μm；
[0273]
反应体系中，h53-f浓度为0.9μm，h53-r浓度为0.9μm，h53-p3浓度为0.15μm；
[0274]
反应体系中，h53-f浓度为0.9μm，h53-r浓度为0.9μm，h53-p3浓度为0.1μm；
[0275]
反应体系中，h53-f浓度为0.45μm，h53-r浓度为0.45μm，h53-p3浓度为0.25μm；
[0276]
反应体系中，h53-f浓度为0.45μm，h53-r浓度为0.45μm，h53-p3浓度为0.2μm；
[0277]
反应体系中，h53-f浓度为0.45μm，h53-r浓度为0.45μm，h53-p3浓度为0.15μm；
[0278]
反应体系中，h53-f浓度为0.45μm，h53-r浓度为0.45μm，h53-p3浓度为0.1μm；
[0279]
反应体系中，h53-f浓度为0.3μm，h53-r浓度为0.3μm，h53-p3浓度为0.25μm；
[0280]
反应体系中，h53-f浓度为0.3μm，h53-r浓度为0.3μm，h53-p3浓度为0.2μm；
[0281]
反应体系中，h53-f浓度为0.3μm，h53-r浓度为0.3μm，h53-p3浓度为0.15μm；
[0282]
反应体系中，h53-f浓度为0.3μm，h53-r浓度为0.3μm，h53-p3浓度为0.1μm；
[0283]
反应体系中，h53-f浓度为0.15μm，h53-r浓度为0.15μm，h53-p3浓度为0.25μm；
[0284]
反应体系中，h53-f浓度为0.15μm，h53-r浓度为0.15μm，h53-p3浓度为0.2μm；
[0285]
反应体系中，h53-f浓度为0.15μm，h53-r浓度为0.15μm，h53-p3浓度为0.15μm；
[0286]
反应体系中，h53-f浓度为0.15μm，h53-r浓度为0.15μm，h53-p3浓度为0.1μm；
[0287]
反应体系中，h53-f浓度为0.075μm，h53-r浓度为0.075μm，h53-p3浓度为0.25μm；
[0288]
反应体系中，h53-f浓度为0.075μm，h53-r浓度为0.075μm，h53-p3浓度为0.2μm；
[0289]
反应体系中，h53-f浓度为0.075μm，h53-r浓度为0.075μm，h53-p3浓度为0.15μm；
[0290]
反应体系中，h53-f浓度为0.075μm，h53-r浓度为0.075μm，h53-p3浓度为0.1μm；
[0291]
优化浓度：h53-f浓度为0.3μm，h53-r浓度为0.3μm，h53-p2浓度为0.15μm,h53-p3浓度为0.15μm。
[0292]
四、引物探针组h54浓度的优化
[0293]
设置不同分组，进行引物探针组h54中引物和探针浓度的优化。
[0294]
分组分别如下：
[0295]
反应体系中，h54-f浓度为0.9μm，h54-r浓度为0.9μm，h54-p浓度为0.25μm；
[0296]
反应体系中，h54-f浓度为0.9μm，h54-r浓度为0.9μm，h54-p浓度为0.2μm；
[0297]
反应体系中，h54-f浓度为0.9μm，h54-r浓度为0.9μm，h54-p浓度为0.15μm；
[0298]
反应体系中，h54-f浓度为0.9μm，h54-r浓度为0.9μm，h54-p浓度为0.1μm；
[0299]
反应体系中，h54-f浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.25μm；
[0300]
反应体系中，h54-f浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.2μm；
[0301]
反应体系中，h54-f浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.15μm；
[0302]
反应体系中，h54-f浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.1μm；
[0303]
反应体系中，h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.25μm；
[0304]
反应体系中，h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.2μm；
[0305]
反应体系中，h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.15μm；
[0306]
反应体系中，h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.1μm；
[0307]
反应体系中，h54-f浓度为0.15μm，h54-r浓度为0.15μm，h54-p浓度为0.25μm；
[0308]
反应体系中，h54-f浓度为0.15μm，h54-r浓度为0.15μm，h54-p浓度为0.2μm；
[0309]
反应体系中，h54-f浓度为0.15μm，h54-r浓度为0.15μm，h54-p浓度为0.15μm；
[0310]
反应体系中，h54-f浓度为0.15μm，h54-r浓度为0.15μm，h54-p浓度为0.1μm；
[0311]
反应体系中，h54-f浓度为0.075μm，h54-r浓度为0.075μm，h54-p浓度为0.25μm；
[0312]
反应体系中，h54-f浓度为0.075μm，h54-r浓度为0.075μm，h54-p浓度为0.2μm；
[0313]
反应体系中，h54-f浓度为0.075μm，h54-r浓度为0.075μm，h54-p浓度为0.15μm；
[0314]
反应体系中，h54-f浓度为0.075μm，h54-r浓度为0.075μm，h54-p浓度为0.1μm；
[0315]
反应体系中，h54-f浓度为0.9μm，h54-r浓度为0.9μm，h54-p浓度为0.5μm；
[0316]
反应体系中，h54-f浓度为0.9μm，h54-r浓度为0.9μm，h54-p浓度为0.45μm；
[0317]
反应体系中，h54-f浓度为0.9μm，h54-r浓度为0.9μm，h54-p浓度为0.4μm；
[0318]
反应体系中，h54-f浓度为0.9μm，h54-r浓度为0.9μm，h54-p浓度为0.35μm；
[0319]
反应体系中，h54-f浓度为0.9μm，h54-r浓度为0.9μm，h54-p浓度为0.3μm；
[0320]
反应体系中，h54-f浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.5μm；
[0321]
反应体系中，h54-f浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.45μm；
[0322]
反应体系中，h54-f浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.4μm；
[0323]
反应体系中，h54-f浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.35μm；
[0324]
反应体系中，h54-f浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.3μm；
[0325]
反应体系中，h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.5μm；
[0326]
反应体系中，h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.45μm；
[0327]
反应体系中，h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.4μm；
[0328]
反应体系中，h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.35μm；
[0329]
反应体系中，h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.3μm；
[0330]
反应体系中，h54-f浓度为0.15μm，h54-r浓度为0.15μm，h54-p浓度为0.5μm；
[0331]
反应体系中，h54-f浓度为0.15μm，h54-r浓度为0.15μm，h54-p浓度为0.45μm；
[0332]
反应体系中，h54-f浓度为0.15μm，h54-r浓度为0.15μm，h54-p浓度为0.4μm；
[0333]
反应体系中，h54-f浓度为0.15μm，h54-r浓度为0.15μm，h54-p浓度为0.35μm；
[0334]
反应体系中，h54-f浓度为0.15μm，h54-r浓度为0.15μm，h54-p浓度为0.3μm；
[0335]
反应体系中，h54-f浓度为0.075μm，h54-r浓度为0.075μm，h54-p浓度为0.5μm；
[0336]
反应体系中，h54-f浓度为0.075μm，h54-r浓度为0.075μm，h54-p浓度为0.45μm；
[0337]
反应体系中，h54-f浓度为0.075μm，h54-r浓度为0.075μm，h54-p浓度为0.4μm；
[0338]
反应体系中，h54-f浓度为0.075μm，h54-r浓度为0.075μm，h54-p浓度为0.35μm；
[0339]
反应体系中，h54-f浓度为0.075μm，h54-r浓度为0.075μm，h54-p浓度为0.3μm。
[0340]
优化浓度：h54-f浓度为0.3μm，h54-r浓度为0.3μm，h54-p浓度为0.4μm。
[0341]
实施例5、四重pcr反应体系的优化
[0342]
取四种标准品质粒混合液，用1
×
te溶液悬浮，得到模板溶液。模板溶液中每种质粒浓度均为32000拷贝/μl。
[0343]
四重pcr反应体系中，同时具有引物探针组h48、引物探针组h51、引物探针组h53和引物探针组h54。进行各个引物探针的浓度的优化。
[0344]
h48-f在反应体系中分别设置以下浓度：0.3-0.9μm(0.3μm、0.45μm、0.9μm)；
[0345]
h48-r在反应体系中分别设置以下浓度：0.3-0.9μm(0.3μm、0.45μm、0.9μm)；
[0346]
h48-p在反应体系中分别设置以下浓度：0.1-0.25μm(0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25 μm)；
[0347]
h51-f在反应体系中分别设置以下浓度：0.075-0.3μm(0.075μm、0.15μm、0.3μm)；
[0348]
h51-r在反应体系中分别设置以下浓度：0.075-0.3μm(0.075μm、0.15μm、0.3μm)；
[0349]
h51-p在反应体系中分别设置以下浓度：0.1-0.25μm(0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25 μm)；
[0350]
h53-f在反应体系中分别设置以下浓度：0.3-0.9μm(0.3μm、0.45μm、0.9μm)；
[0351]
h53-r在反应体系中分别设置以下浓度：0.3-0.9μm(0.3μm、0.45μm、0.9μm)；
[0352]
h53-p2在反应体系中分别设置以下浓度：0.1-0.25μm(0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25 μm)；
[0353]
h53-p3在反应体系中分别设置以下浓度：0.1-0.25μm(0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25 μm)；
[0354]
h54-f在反应体系中分别设置以下浓度：0.3-0.9μm(0.3μm、0.45μm、0.9μm)；
[0355]
h54-r在反应体系中分别设置以下浓度：0.3-0.9μm(0.3μm、0.45μm、0.9μm)；
[0356]
h54-p在反应体系中分别设置以下浓度：0.25-0.5μm(0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4 μm、0.45μm、0.5μm)。
[0357]
在优选浓度下的照片见图2。图2中：h48-f浓度为0.3μm，h48-r浓度为0.3μm，h48-p 浓度为0.15μm；h51-f浓度为0.15μm，h51-r浓度为0.15μm，h51-p浓度为0.1μm；h53-f 浓度为0.45μm，h53-r浓度为0.45μm，h53-p2浓度为0.1μm,h53-p3浓度为0.1μm；h54-f 浓度为0.45μm，h54-r浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.45μm。
[0358]
实施例6、试剂盒的组成和使用方法
[0359]
一、试剂盒的组成
[0360]
pcr反应液：premix ex taq(probe qpcr)5.5μl，加dnase/rnase-free去离子水至6μl。
[0361]
检测液：提供的有效成分为引物探针组h48、引物探针组h51、引物探针组h53和引
物探针组h54。
[0362]
阳性对照：四种标准品质粒。
[0363]
阴性对照：灭菌超纯水。
[0364]
二、试剂盒的使用方法
[0365]
1、制备反应体系
[0366]
反应体系(11微升)：6μl pcr反应液+4μl检测液+1μl模板溶液。
[0367]
模板溶液即对临床样本提取总dna得到的dna溶液。1μl模板溶液中的dna含量为5-20ng。
[0368]
反应体系中：h48-f浓度为0.3μm，h48-r浓度为0.3μm，h48-p浓度为0.15μm；h51-f 浓度为0.15μm，h51-r浓度为0.15μm，h51-p浓度为0.1μm；h53-f浓度为0.45μm，h53-r 浓度为0.45μm，h53-p2浓度为0.1μm,h53-p3浓度为0.1μm；h54-f浓度为0.45μm，h54-r 浓度为0.45μm，h54-p浓度为0.45μm。
[0369]
2、采用荧光定量pcr仪进行多重pcr反应
[0370]
反应条件：94℃2min；94℃45s、退火1min(第一个循环退火温度为61℃，之后每隔循环比前一循环降低1℃)，5个循环；94℃20s、56℃1min，40个循环；40℃30s。
[0371]
3、结果判断
[0372]
cy5荧光信号对应作为内参基因的人血红蛋白亚单位β基因。如果cy5荧光信号显示为 s型扩增曲线，说明临床样本可信。
[0373]
6-fam荧光信号对应东亚型幽门螺杆菌。如果6-fam荧光信号显示为s型扩增曲线，且 ct≤29判断为阳性(即具有东亚型幽门螺杆菌)，如ct≥32判断为阴性(不具有东亚型幽门螺杆菌或东亚型幽门螺杆菌低于检测限)；
[0374]
texas red荧光信号和vic荧光信号对应幽门螺杆菌。如果texas red荧光信号和/或vic 荧光信号显示为s型扩增曲线，且ct≤29判断为阳性(即具有幽门螺杆菌)，如ct≥32判断为阴性(不具有幽门螺杆菌或幽门螺杆菌低于检测限)。
[0375]
实施例7、灵敏度
[0376]
标准品：取四种标准品质粒，混合，梯度稀释，稀释度1中四种质粒的浓度均为100000 拷贝/μl，稀释度2中四种质粒的浓度均为10000拷贝/μl，稀释度3中四种质粒的浓度均为1000拷贝/μl，稀释度4中四种质粒的浓度均为100拷贝/μl，稀释度5中四种质粒的浓度均为50拷贝/μl，稀释度6中四种质粒的浓度均为25拷贝/μl。稀释度7中四种质粒的浓度均为10拷贝/μl。
[0377]
将各个稀释度的标准品作为模板溶液，采用实施例6制备的试剂盒并按实施例6的步骤二进行操作。
[0378]
结果表明，四种引物探针组的最低检测限均为25拷贝/μl。
[0379]
实施例8、特异性
[0380]
一、试验一
[0381]
16株菌的信息如下(北京北纳创联生物技术研究院)：脆弱拟杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、两歧双歧杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、白假丝酵母菌、甲型溶血性链球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺菌、乙型溶血性链球菌、厌氧消化链球菌。
[0382]
3株菌的信息如下(自行分离)：大肠杆菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌。
[0383]
分别提取各个菌的基因组dna，作为模板溶液。采用实施例6制备的试剂盒并按实施例6 的步骤二进行操作。
[0384]
对于每种菌来说，每个引物探针组的检测结果均为阴性。
[0385]
二、对人基因组的特异性
[0386]
人基因组(获自健康志愿者全血)，作为模板溶液。
[0387]
采用实施例6制备的试剂盒并按实施例6的步骤二进行操作。
[0388]
引物探针组h54的结果为阳性，另外三个引物探针组的结果为阴性。
[0389]
实施例9、探针法与呼气试验对比
[0390]
分别应用实施例6制备的试剂盒和尿素[14c]呼气试验药盒对同一批临床样本进行检测，结果见表2和表3。
[0391]
尿素[14c]呼气试验药盒：
[0392]
http://www.headwaychina.com/hdw/cyyfw/cpzx/yh/364610/365778/index.html。
[0393]
表2幽门螺杆菌(texas red荧光信号和/或vic荧光信号)的结果
[0394]
[0395][0396]
注：1表示阳性，0表示阴性，—表示没有检测。
[0397]
表3检测结果统计
[0398][0399]
经后续追踪，本发明提供的试剂盒的检测结果正确。
[0400]
示例性的阳性样本结果见图3，示例性的阴性样本结果见图4。
[0401]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.特异引物探针组组合，由如下四个引物探针组组成：引物探针组h48、引物探针组h51、引物探针组h53和引物探针组h54；引物探针组h48由引物h48-f、引物h48-r和探针h48-p组成；引物h48-f为序列表的序列1所示的单链dna分子，引物h48-r为序列表的序列2所示的单链dna分子，探针h48-p的核苷酸序列如序列表的序列3所示；引物探针组h51由引物h51-f、引物h51-r和探针h51-p组成；引物h51-f为序列表的序列4所示的单链dna分子，引物h51-r为序列表的序列5所示的单链dna分子，探针h51-p的核苷酸序列如序列表的序列6所示；引物探针组h53由引物h53-f、引物h53-r、探针h53-p2和探针h53-p3组成；引物h53-f为序列表的序列7所示的单链dna分子，引物h53-r为序列表的序列8所示的单链dna分子，探针h53-p2的核苷酸序列如序列表的序列9所示，探针h53-p3的核苷酸序列如序列表的序列10所示；引物探针组h54由引物h54-f、引物h54-r和探针h54-p组成；引物h54-f为序列表的序列11所示的单链dna分子，引物h54-r为序列表的序列12所示的单链dna分子，探针h54-p的核苷酸序列如序列表的序列13所示。2.权利要求1所述特异引物探针组组合的应用，为如下(g1)和/或(g2)和/或(g3)和/或(g4)和/或(g5)和/或(g6)和/或(g7)和/或(g8)和/或(g9)和/或(g10)和/或(g11)和/或(g12)：(g1)制备用于检测受试者是否感染幽门螺杆菌的试剂盒；(g2)制备用于检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌的试剂盒；(g3)制备用于鉴定幽门螺杆菌的试剂盒；(g4)制备用于检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；(g5)制备用于检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；(g6)制备用于鉴定东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；(g7)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；(g8)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；(g9)鉴定幽门螺杆菌；(g10)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；(g11)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；(g12)鉴定东亚型幽门螺杆菌。3.一种试剂盒，包括权利要求1所述特异引物探针组组合；所述试剂盒的功能为如下(h1)和/或(h2)和/或(h3)和/或(h4)和/或(h5)和/或(h6)：(h1)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；(h2)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；(h3)鉴定幽门螺杆菌；(h4)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；(h5)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；(h6)鉴定东亚型幽门螺杆菌。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括pcr扩增的其它试剂。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品质粒。6.特异引物探针组组合，由如下三个引物探针组组成：引物探针组h48、引物探针组h51和引物探针组h53；引物探针组h48由引物h48-f、引物h48-r和探针h48-p组成；引物h48-f为序列表的序列1所示的单链dna分子，引物h48-r为序列表的序列2所示的单链dna分子，探针h48-p的核苷酸序列如序列表的序列3所示；引物探针组h51由引物h51-f、引物h51-r和探针h51-p组成；引物h51-f为序列表的序列4所示的单链dna分子，引物h51-r为序列表的序列5所示的单链dna分子，探针h51-p的核苷酸序列如序列表的序列6所示；引物探针组h53由引物h53-f、引物h53-r、探针h53-p2和探针h53-p3组成；引物h53-f为序列表的序列7所示的单链dna分子，引物h53-r为序列表的序列8所示的单链dna分子，探针h53-p2的核苷酸序列如序列表的序列9所示，探针h53-p3的核苷酸序列如序列表的序列10所示。7.权利要求6所述特异引物探针组组合的应用，为如下(g1)和/或(g2)和/或(g3)和/或(g4)和/或(g5)和/或(g6)和/或(g7)和/或(g8)和/或(g9)和/或(g10)和/或(g11)和/或(g12)：(g1)制备用于检测受试者是否感染幽门螺杆菌的试剂盒；(g2)制备用于检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌的试剂盒；(g3)制备用于鉴定幽门螺杆菌的试剂盒；(g4)制备用于检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；(g5)制备用于检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；(g6)制备用于鉴定东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；(g7)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；(g8)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；(g9)鉴定幽门螺杆菌；(g10)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；(g11)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；(g12)鉴定东亚型幽门螺杆菌。8.一种试剂盒，包括权利要求6所述特异引物探针组组合；所述试剂盒的功能为如下(h1)和/或(h2)和/或(h3)和/或(h4)和/或(h5)和/或(h6)：(h1)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；(h2)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；(h3)鉴定幽门螺杆菌；(h4)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；(h5)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；(h6)鉴定东亚型幽门螺杆菌。9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括pcr扩增的其它试剂。10.如权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品质粒。

技术总结
本发明公开了用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物探针组合物以及试剂盒。引物探针组组合组成：序列1所示引物H48-F，序列2所示引物H48-R，序列3所示探针H48-P；序列4所示引物H51-F，序列5所示引物H51-R，序列6所示探针H51-P；序列7所示引物H53-F，序列8所示引物H53-R，序列9所示探针H53-P2，序列10所示探针H53-P3；序列11所示引物H54-F，序列12所示引物H54-R，序列13所示探针H54-P。应用本发明提供的引物探针组组合检测或辅助检测幽门螺杆菌，具有高灵敏度和高准确度的优点，且操作简便、易于掌握，能够准确、有效地判断是否存在幽门螺杆菌感染以及是否存在东亚型幽门螺杆菌感染。染。


技术研发人员：孟祥珠
受保护的技术使用者：沈阳祥伴科技有限公司
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/8/1