一种新灵芝菌株ZL76及其用途

一种新灵芝菌株zl76及其用途
技术领域
1.本发明涉及中药领域，具体涉及一种新灵芝菌株zl76及其用途。


背景技术：

2.灵芝(ganodermasp.)隶属于担子菌纲(basidiomycetes)多孔菌目(polyporales)多孔菌科(polyporaceae)灵芝属(ganoderma)，是一种重要的药用真菌，在传统中医中被广泛应用，其药理作用多有论述。《神农本草经》中记载灵芝具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿等功效，现代药理学与临床试验进一步证明灵芝具有抗衰老、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、保肝等作用。赤芝和紫芝是仅有的两个被《中华人民共和国药典》收录的灵芝属。
3.《中华人民共和国药典》(2020年版一部)规定灵芝水分不得过17.0％，总灰分不得过3.2％，浸出物不得少于3.0％，灵芝多糖不得少于0.9％，含三萜及甾醇以齐墩果酸计不得少于0.5％。然而，而灵芝的产地、品种使得我国灵芝品质良莠不齐，功效差异很大。如虽然部分灵芝具有美白功效，但并非所有灵芝品种均具有美白功效。
4.寻找到品质优良，具有抑制黑色素，具有美白功效的灵芝菌株，对于灵芝产业的发展具有重要作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种新灵芝菌株zl76及其用途。
6.本发明提供的灵芝菌株zl76是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)的保藏编号为cgmcc no.23882的灵芝。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年11月29日，分类命名为灵芝ganoderma lucidum。
7.本发明还提供了一种灵芝提取物，它是由前述的灵芝菌株经过乙醇提取后得到的醇提物；或者，由前述的灵芝菌株经过水提取后得到的水提物。
8.进一步地，所述醇提物的制备方法包括如下步骤：
9.取烘干的前述的灵芝，粉碎后加入40～50倍量(g/ml)的乙醇浸泡0.5～3h，然后回流提取1～5h，抽滤收集提取液；滤渣再加入40～50倍量(g/ml)的乙醇回流提取1～5h，抽滤后将滤液减压蒸发，再蒸干得到醇提物。
10.进一步地，所述水提物的制备方法包括如下步骤：
11.将前述醇提后的滤渣晾干，加入40～50倍量(g/ml)的水回流提取两次，每次1～5h，合并提取液，抽滤后减压蒸发，最后蒸干，得到水提物。
12.本发明还提供了前述的灵芝菌株或前述的灵芝提取物在制备预防和/或治疗黑色素瘤的药物中的用途；
13.优选地，所述药物为抑制黑色素瘤细胞活性的药物。
14.本发明还提供了前述的灵芝菌株或前述的灵芝提取物在制备具有美白功效的药物和/或具有美白功效的化妆品中的用途。
15.进一步地，所述药物为抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素生产的药物。
16.本发明还提供了前述的灵芝菌株或前述的灵芝提取物在制备保健食品和/或食品中的用途。
17.本发明还提供了一种保健食品、化妆品或药物制剂，它是以前述的灵芝菌株或前述的灵芝提取物为活性成分，加上保健食品、化妆品或药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的保健食品、化妆品和药物制剂。
18.本发明还提供了一种食品，它是前述的灵芝菌株或前述的灵芝提取物加上食品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的食品。
19.本发明提供了一种新的灵芝菌株zl76，该灵芝菌株具有遗传性状稳定、产量高、品质优的特点。同时，该灵芝菌株对黑色素瘤细胞活性具有显著的抑制作用，可用于抑制黑色素瘤；此外，该灵芝菌株对酪氨酸酶活性和黑色素生产均良好的抑制作用，具有美白的功效。本发明灵芝菌株zl76可用于制备抑制黑色素瘤、抑制酪氨酸酶活性和具有美白功效的药物，也可以用于制备具有美白功效的化妆品，还可以用于制备食品或保健食品，具有良好的应用前景。
20.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
21.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
22.除另有说明外，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
23.实施例1、本发明的灵芝菌株zl76
24.本发明灵芝菌株zl76保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年11月29日，保藏编号为cgmcc no.23882，分类命名为灵芝ganoderma lucidum。
25.该灵芝菌株的主要特征特性：
26.1、外观
27.具典型的赤芝[ganoderma lucidum(leyss.ex fr.)karst.]形态特征。子实体外形呈伞状，菌盖肾形，直径10-16cm，厚1-2cm，皮壳坚硬，浅黄褐色，有光泽，具环状棱纹和辐射状皱纹，边缘薄而平截，常稍内卷，腹面黄白色。
[0028]
2、生产周期：约90天。
[0029]
3、产量：按常规袋料栽培技术，产量≥59.60g/kg.袋料。
[0030]
4、品质：经检测，浸出物6.42％，多糖0.93％，三萜及甾醇0.89％，各项检验应符合《中华人民共和国药典》(2020年版，一部)标准。
[0031]
实施例2、本发明灵芝醇提物的制备
[0032]
取实施例1取烘干的灵芝子实体，切块粉碎。称取5g，加250ml乙醇浸泡半小时，回流提取1h，收集提取液。再加200ml乙醇继续回流1h，抽滤，将滤液减压蒸发再蒸干得到醇提物。
[0033]
实施例3、本发明灵芝水提物的制备
[0034]
取实施例2醇提抽滤后的滤渣晾干，以200ml水回流提取两次，每次1h。合并提取液，抽滤后减压蒸发，最后蒸干，得到水提物。
[0035]
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
[0036]
实验例1、本发明灵芝菌株zl76特性和品质的研究
[0037]
1、生产周期：约90天。
[0038]
2、外观形态：具典型的赤芝[ganoderma lucidum(leyss.ex fr.)karst.]形态特征。子实体外形呈伞状，菌盖肾形，直径10-16cm，厚1-2cm，皮壳坚硬，浅黄褐色，有光泽，具环状棱纹和辐射状皱纹，边缘薄而平截，常稍内卷，腹面黄白色。
[0039]
3、产量：按常规袋料栽培技术，产量≥59.60g/kg.袋料。
[0040]
4、品质：经检测，浸出物6.42％，多糖0.93％，三萜及甾醇0.89％，各项检验应符合《中华人民共和国药典》(2020年版，一部)标准。
[0041]
实验结果表明：该灵芝菌株遗传性状稳定一致，符合《中华人民共和国药典》标准，具有高产、优质的特点。
[0042]
实施例2、灵芝菌株美白功效研究
[0043]
1、实验材料
[0044]
取本发明实施例1的灵芝菌株和对照灵芝菌株，共2个菌株。本发明灵芝菌株编号为zl76，对照灵芝菌株编号为zl214。分别采用醇提和水提方式，获得实验样品，共4个实验样品(zl76醇提物、zl76水提物、zl214醇提物、zl214水提物)。
[0045]
编号为zl76的灵芝菌株的保藏信息为：它是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)的保藏编号为cgmcc no.23882的灵芝，保藏日期：2021年11月29日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为灵芝ganoderma lucidum。
[0046]
编号为zl214的灵芝菌株的保藏信息为：它是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)的保藏编号为cgmcc no.23881的灵芝，保藏日期：2021年11月29日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为灵芝ganoderma lucidum。
[0047]
醇提法具体包括如下步骤：取烘干的灵芝子实体，切块粉碎。各称取5g，加250ml乙醇浸泡半小时，回流提取1h，收集提取液。再加200ml乙醇继续回流1h,抽滤，将滤液减压蒸发再蒸干得到醇提物。
[0048]
水提法具体包括如下步骤：将醇提抽滤后的滤渣晾干，以200ml水回流提取两次，每次1h。合并提取液，抽滤后减压蒸发，最后蒸干，得到水提物。
[0049]
醇提物来源样品按每100mg加入1ml量加入dmso。-20℃保存。
[0050]
水提物来源样品按每10mg加入1ml量加入无菌水，过滤除菌，-20℃保存。
[0051]
2、实验方法
[0052]
(1)细胞培养
[0053]
b16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)购自中科院细胞所。所用培养液为dmem高糖培养液90％(含1
×
非必需氨基酸、2mm谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠、1.5g/l碳酸氢钠)+胎牛血清10％。取对数生长期b16细胞吸出原有培养液，加入0.05％胰蛋白酶-0.53mm edta消化，2-5min待细胞能被培养液吹掉为止。加入新鲜培养液反复吹打，混匀。按1:4比例传代。
[0054]
(2)样品测定
[0055]
以下所有操作均在无菌条件下进行，所用器具均为无菌。
[0056]
①
对b16细胞增殖的影响作用
[0057]
细胞铺板
[0058]
取对数生长期的b16细胞吸出原有培养液，加入0.05％胰蛋白酶-0.53mm edta消化，2-5min待细胞能被培养液吹掉为止。加入新鲜培养液反复吹打，混匀转移至青霉素瓶中。取20μl细胞悬液至ep管中，加入180μl台盼蓝溶液，混匀。显微镜下镜检、计数。
[0059]
取适量细胞悬液至50ml玻璃瓶中，以新鲜培养液补足体积至18ml，96孔细胞培养板中，每孔加入稀释后的细胞悬液180μl，使每孔细胞数为6
×
103个。细胞板置co2培养箱中孵育过夜。
[0060]
加样
[0061]
取2μl得到的灵芝样品，室温解冻后，震荡溶解，混匀，得样品母液。根据预测实验结果，确定各样品起始浓度范围，并根据样品加样浓度设立溶剂对照。样品母液稀释100倍，得应用液1，应用液1稀释4倍，得应用液2。
[0062]
每个样品设置5个样品浓度梯度，每个梯度重复3次。在96孔细胞培养板中，加入应用液1或应用液2，并以pbs补充至20μl，使样品终浓度分别为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml。空白对照孔加入20μlpbs。混匀。细胞板置co2培养箱中孵育48h。
[0063]
mtt检测
[0064]
细胞培养结束前4小时，取出细胞培养板。小心、缓慢吸去培养液，加入pbs100μl。加入mtt溶液(5mg/ml)10μl，混匀。
[0065]
细胞板置co2培养箱中孵育4-6h后，每孔加入sds溶液100μl。细胞板置co2培养箱中孵育过夜。采用酶标仪570nm处测定od值。
[0066]
②
对b16细胞酪氨酸酶活性的影响作用
[0067]
细胞铺板
[0068]
取对数生长期的b16细胞吸出原有培养液，加入0.05％胰蛋白酶-0.53mm edta消化，2-5min待细胞能被培养液吹掉为止。加入新鲜培养液反复吹打，混匀转移至青霉素瓶中。取20μl细胞悬液至ep管中，加入180μl台盼蓝溶液，混匀。显微镜下镜检、计数。
[0069]
取适量细胞悬液至50ml玻璃瓶中，以新鲜培养液补足体积至18ml，96孔细胞培养板中，每孔加入稀释后的细胞悬液180μl，使每孔细胞数为6
×
103个。细胞板置co2培养箱中孵育过夜。
[0070]
诱导
[0071]
每孔细胞加入终浓度为1mm的茶碱。
[0072]
加样
[0073]
取2μl得到的灵芝样品，室温解冻后，震荡溶解，混匀，得样品母液。根据预测实验结果，确定各样品起始浓度范围，并根据样品加样浓度设立溶剂对照。样品母液稀释100倍，得应用液1，应用液1稀释4倍，得应用液2。
[0074]
每个样品设置5个样品浓度梯度，每个梯度重复3次。在96孔细胞培养板中，加入应用液1或应用液2，并以pbs补充至20μl，使样品终浓度分别为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml。空白对照孔加入20μlpbs。混匀。细胞板置co2培养箱中孵育48h。
[0075]
酪氨酸酶检测
[0076]
细胞培养结束后，取出细胞培养板。小心、缓慢吸去培养液，加入1％triton x-100溶液100μl，-80℃放置60min。取出细胞板，恢复至室温后，取10μl用bca法测定蛋白含量。另取80μl，加入0.1％l-dopa溶液50ul，37℃孵育2h，采用酶标仪490nm处测定od值。
[0077]
③
对b16细胞黑色素生成的影响作用
[0078]
细胞铺板
[0079]
取对数生长期的b16细胞吸出原有培养液，加入0.05％胰蛋白酶-0.53mm edta消化，2-5min待细胞能被培养液吹掉为止。加入新鲜培养液反复吹打，混匀转移至青霉素瓶中。取20μl细胞悬液至ep管中，加入180μl台盼蓝溶液，混匀。显微镜下镜检、计数。
[0080]
取适量细胞悬液至50ml玻璃瓶中，以新鲜培养液补足体积至18ml，96孔细胞培养板中，每孔加入稀释后的细胞悬液180μl，使每孔细胞数为6
×
103个。细胞板置co2培养箱中孵育过夜。
[0081]
加样
[0082]
取适量的灵芝样品，室温解冻后，震荡溶解，混匀，得样品母液。根据预测实验结果，确定各样品起始浓度范围，并根据样品加样浓度设立溶剂对照。
[0083]
每孔细胞加入终浓度为1mm的茶碱。
[0084]
每个样品设置3个样品浓度梯度。在96孔细胞培养板中，加入样品，并以pbs补充至20μl，使样品终浓度分别为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml。空白对照孔加入20μl pbs。混匀。细胞板置co2培养箱中孵育72h。
[0085]
黑素生成检测
[0086]
细胞培养结束后，取出细胞培养板。小心、缓慢吸去培养液，用pbs清洗两次，加入1mol/l naoh 50μl，37℃放置60min。采用酶标仪460nm处测定od值。
[0087]
3、实验结果
[0088]
(1)对b16细胞增殖的影响作用
[0089]
实验结果见表1和表2所示：两种灵芝醇提物对b16细胞增殖的抑制作用都强于水提物，且有较为明显的量效关系，说明灵芝醇提物对b16细胞的抑制效果优于水提物。同时，编号为zl76的灵芝水提物和醇提物对b16细胞增殖的抑制作用均强于编号为zl214的灵芝，说明灵芝zl76对b16细胞的抑制效果优于灵芝zl214，进一步说明灵芝zl76对黑色素瘤的抑制效果优于灵芝zl214。灵芝zl214水提物基本没有抑制b16细胞的效果。
[0090]
表1.灵芝水提物对b16细胞增殖的抑制作用(％)
[0091][0092][0093]
表2.灵芝醇提物对b16细胞增殖的抑制作用(％)
[0094][0095]
(2)对b16细胞酪氨酸酶活性的抑制作用
[0096]
实验结果见表3和表4所示：编号为zl76的灵芝的水提物和醇提物对b16细胞酪氨酸酶活性均具有良好的抑制作用，且有明显的量效关系；编号为zl214的灵芝的水提物和醇提物均不具备对b16细胞酪氨酸酶活性明显的抑制作用。酪氨酸酶是一种氧化酶，是调控黑色素生成的限速酶，这种酶参与黑色素的合成，抑制酪氨酸酶可以抑制黑色素合成，进而起到美白功效。实验结果说明编号为zl76的灵芝对酪氨酸酶有显著抑制作用，进而说明其可抑制黑色素生成，具有美白功效；而编号为zl214的灵芝不具有上述功效。
[0097]
表3.灵芝水提物对b16细胞酪氨酸酶活性的抑制作用(％)
[0098][0099]
表4.灵芝醇提物对b16细胞酪氨酸酶活性的抑制作用(％)
[0100][0101]
(3)对b16细胞黑色素生成的抑制作用
[0102]
实验结果见表5和表6所示：编号为zl76的灵芝的水提物和醇提物对b16细胞黑色素的生成均具有抑制作用，且有明显的量效关系；编号为zl214的灵芝水提物和醇提物对b16细胞黑色素生成的抑制作用很差，基本不具备对b16细胞黑色素生成的抑制作用。与上述结果一致，说明zl76的灵芝具有美白功效；而编号为zl214的灵芝不具有美白功效。
[0103]
表5.灵芝水提物样品对b16细胞黑色素生产的抑制作用(％)
[0104][0105][0106]
表6.灵芝醇提物样品对b16细胞黑色素生产的抑制作用(％)
[0107][0108]
上述试验结果说明：与灵芝zl214相比，本发明灵芝zl76对黑色素瘤细胞活性具有显著的抑制作用，可用于抑制黑色素瘤；同时，与灵芝zl214不能抑制酪氨酸酶活性和黑色素生产，不具有美白功效相比，本发明灵芝zl76对酪氨酸酶活性和黑色素生产均良好的抑制作用，说明其具有良好美白的功效。
[0109]
综上，本发明提供了一种新的灵芝菌株zl76，该灵芝菌株具有遗传性状稳定、产量高、品质优的特点。同时，该灵芝菌株对黑色素瘤细胞活性具有显著的抑制作用，可用于抑制黑色素瘤；此外，该灵芝菌株对酪氨酸酶活性和黑色素生产均良好的抑制作用，具有美白的功效。本发明灵芝菌株zl76可用于制备抑制黑色素瘤、抑制酪氨酸酶活性和具有美白功效的药物，也可以用于制备具有美白功效的化妆品，还可以用于制备食品或保健食品，具有良好的应用前景。

技术特征：
1.一种灵芝菌株，其特征在于：它是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.23882的灵芝。2.一种灵芝提取物，其特征在于：它是由权利要求1所述的灵芝菌株经过乙醇提取后得到的醇提物；或者，由权利要求1所述的灵芝菌株经过水提取后得到的水提物。3.根据权利要求2所述灵芝提取物，其特征在于：所述醇提物的制备方法包括如下步骤：取烘干的权利要求1所述的灵芝，粉碎后加入40～50倍量(g/ml)的乙醇浸泡0.5～3h，然后回流提取1～5h，抽滤收集提取液；滤渣再加入40～50倍量(g/ml)的乙醇回流提取1～5h，抽滤后将滤液减压蒸发，再蒸干得到醇提物。4.根据权利要求2所述灵芝提取物，其特征在于：所述水提物的制备方法包括如下步骤：将权利要求3中醇提后的滤渣晾干，加入40～50倍量(g/ml)的水回流提取两次，每次1～5h，合并提取液，抽滤后减压蒸发，最后蒸干，得到水提物。5.权利要求1所述的灵芝菌株或权利要求2～4任一项所述的灵芝提取物在制备预防和/或治疗黑色素瘤的药物中的用途；优选地，所述药物为抑制黑色素瘤细胞活性的药物。6.权利要求1所述的灵芝菌株或权利要求2～4任一项所述的灵芝提取物在制备具有美白功效的药物和/或具有美白功效的化妆品中的用途。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述药物为抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素生产的药物。8.权利要求1所述的灵芝菌株或权利要求2～4任一项所述的灵芝提取物在制备保健食品和/或食品中的用途。9.一种保健食品、化妆品或药物制剂，其特征在于：它是以权利要求1所述的灵芝菌株或权利要求2～4任一项所述的灵芝提取物为活性成分，加上保健食品、化妆品或药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的保健食品、化妆品和药物制剂。10.一种食品，其特征在于：它是权利要求1所述的灵芝菌株或权利要求2～4任一项所述的灵芝提取物加上食品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的食品。

技术总结
本发明提供了一种新灵芝菌株ZL76及其用途，涉及中药领域。该灵芝菌株ZL76是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.23882的灵芝。本发明灵芝菌株ZL76具有遗传性状稳定、产量高、品质优的特点。同时，该灵芝菌株对黑色素瘤细胞活性具有显著的抑制作用，可用于抑制黑色素瘤；此外，该灵芝菌株对酪氨酸酶活性和黑色素生产均良好的抑制作用，具有美白的功效。本发明灵芝菌株ZL76可用于制备抑制黑色素瘤、抑制酪氨酸酶活性和具有美白功效的药物，也可以用于制备具有美白功效的化妆品，还可以用于制备食品或保健食品，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：罗霞 江南 贺黎铭 李芳 余梦瑶 罗舒 宋怡 许晓燕 周州
受保护的技术使用者：四川省中医药科学院
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/8/1