针对新型冠状病毒2019-nCoV株RBD蛋白的单克隆抗体及免疫检测试剂的制作方法

针对新型冠状病毒2019-ncov株rbd蛋白的单克隆抗体及免疫检测试剂
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用蛋白免疫小鼠制备的鼠单克隆抗体及由其制备的免疫检测试剂。


背景技术：

[0002][0003]
新冠的早期诊断对其传播的阻断有着重要的意义，迄今为止，新冠的诊断技术已经非常完善，诊断方式主要有：临床学诊断(发热、新冠肺炎影像学特征等)、pcr诊断及免疫学的诊断(主要为胶体金试纸条与elisa试剂盒)等。
[0004]
我们研发了核蛋白(np)的elisa试剂盒与胶体金试纸条，灵敏度及特异性均有很大的优势。实验数据表明：有极少数感染者会出现漏检，或者其检测值处于检测的灰区。因此，有需要制备不同毒株rbd蛋白的检测试剂盒，以此对部分漏检进行补充。另一方面同时也是研发此试剂盒的主要目的，rbd蛋白的检测对疫苗评价可提供一定的参考。


技术实现要素：

[0005]
本发明的一个目的在于提供一种杂交瘤细胞，以2019-ncov株的rbd(刺突蛋白受体结合区)蛋白免疫小鼠后制备得到。
[0006]
本发明的另一个目的在于提供一种针对新冠病毒2019-ncov毒株rbd蛋白的特异性单克隆抗体，以及针对新冠病毒不同毒株的通用性单克隆抗体。
[0007]
本发明的再一个目的在于提供一种针对新冠病毒2019-ncov毒株的特异性检测的免疫诊断试剂，以及针对新冠病毒不同毒株的rbd蛋白的通用型免疫诊断试剂。
[0008]
本发明的又一个目的在于提供含有上述免疫诊断试剂的检测试剂盒。
[0009]
根据本发明的一个方面，本发明提供针对新冠病毒2019-ncov毒株rbd蛋白的杂交瘤细胞株。通过合成的2019-ncov rbd-鼠fc(下文为covid-19-rbd-mfc)融合蛋白免疫小鼠，小鼠血清效价经检测其滴度达25600以上，取小鼠脾脏制成脾细胞悬液，随后与sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞，通过合成的2019-ncov株rbd偶联s-tag的融合蛋白rbd-s-tag进行杂交瘤细胞的筛选，从而筛选出表达稳定分泌的针对rbd蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经过筛选评价获得三株表达稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为mr1、mr4和mr25，于2022年8月31日提交到中国典型培养物保藏中(cctcc)保藏，保藏号为：cctcc no：c2022260、cctcc no：c2022261和cctcc no：c2022262。培养上述mr1、mr4、和mr25细胞株，制备单克隆抗体，纯化并鉴定，其属于igg亚类。
[0010]
根据本发明的另一方面，本发明提供针对新冠病毒2019-ncov株rbd蛋白的特异性单克隆抗体，以及针对新冠病毒不同毒株rbd蛋白的通用型单克隆抗体。所述针对新冠病毒2019-ncov株rbd蛋白的特异性单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株mr4制备，所述针对新冠病毒不同毒株rbd蛋白的通用型单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株mr1和/或mr25制备。
[0011]
在所述单克隆抗体的制备中，培养上述杂交瘤细胞株筛选实验后筛选得到的mr1、mr4和mr25细胞株，将培养得到的杂交瘤细胞按5
×
105个细胞注射至石蜡油致敏的小鼠腹腔中，一周左右后取小鼠腹水，腹水抗体经纯化后即为所需的单克隆抗体。
[0012]
根据本发明的又一方面，本发明提供针新冠不同毒株rbd蛋白的通用型及特异性免疫诊断试剂，由mr1、mr4和/或mr25细胞株分泌纯化后的rbd单克隆抗体包板、兔多抗偶联hrp产生。我们制备的rbd蛋白免疫检测试剂可用于不同毒株的通用性和特异性检测试剂。
[0013]
本发明获得了亲和力高、特异性好的鼠单克隆抗体，由此制备的免疫检测试剂灵敏度与特异性高。
[0014]
生物材料的保藏
[0015]
1、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分类命名为mr1，于2022年8月31日提交到中国典型培养物保藏中(cctcc)保藏，保藏号为：cctcc no：c2022260；保藏单位和地址为：cctcc-中国典型培养物保藏中心，中国武汉；2、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分类命名为mr4，于2022年8月31日提交到中国典型培养物保藏中(cctcc)保藏，保藏号为：cctcc no：c2022261；保藏单位和地址为：cctcc-中国典型培养物保藏中心，中国武汉；3、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分类命名为mr25，于2022年8月31日提交到中国典型培养物保藏中(cctcc)保藏，保藏号为：cctcc no：c2022262；保藏单位和地址为：cctcc-中国典型培养物保藏中心，中国武汉；4、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为or2，于2022年8月31日提交到中国典型培养物保藏中(cctcc)保藏，保藏号为：cctcc no：c2022263；保藏单位和地址为：cctcc-中国典型培养物保藏中心，中国武汉。
附图说明
[0016]
图1为covid-19-rbd-mfc融合表达上清，融合蛋白约为55kd；
[0017]
图中自左至右：第一泳道为maker，第二到第七泳道依次为covid-19-rbd-mfc连接表达载体pevl7.3、pevl7.4、pevl8.3、pevl8.4、pevl9.3、pevl9.4的融合蛋白表达上清。
[0018]
图2为omicron、delta株rbd-mfc融合蛋白的表达上清与裂解液；图中自左至右第一泳道为maker，第二到第四泳道为omicron株rbd-mfc连接表达载体pevl7.4、pevl8.4、pevl9.4的融合蛋白表达上清；第五到第七泳道为delta株rbd-mfc连接表达载体pevl7.4、pevl8.4、、pevl9.4的融合蛋白表达上清；第八到第十泳道为omicron株rbd-mfc连接表达载体pevl7.4、pevl8.4、pevl9.4的融合蛋白表达的细胞裂解液；第十一到第十三泳道为delta株rbd-mfc连接表达载体pevl7.4、pevl8.4、pevl9.4的融合蛋白表达的细胞裂解液。
具体实施方式
[0019]
以下实施例以举例的方式描述本发明，其不应视为对本发明的限制。所使用的实验材料如无特别说明，均为市售购买。
[0020]
【实施例1】杂交瘤细胞的制备
[0021]
经ncbi查阅：covid-19株rbd核酸序列为：cctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattatt
ctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgag；(seq id no.1)
[0022]
delta株rbd核酸序列为：cctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattaccggtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcaaaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgag；(seq id no.2)
[0023]
omicron株rbd核酸序列为：cctaatattacaaacttgtgcccttttgatgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataatctcgcaccatttttcacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaatattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaagcttgattctaaggttagtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtaacaaaccttgtaatggtgttgcaggttttaattgttactttcctttacgatcatatagtttccgacccacttatggtgttggtcaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaaaaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagtga；(seq id no.3)
[0024]
鼠fc核酸序列为：ggcggcggcggctccggctccgagcccagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggt
tcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgtga；(seq id no.4)
[0025]
委托生工生物工程(上海)股份有限公司将covid-19-rbd-mfc、delta-rbd-mfc、omicron-rbd-mfc基因进行合成。在基因上游引入了xhoi酶切位点，下游引入了bamhi酶切位点；rbd基因长度分别为762bp，融合基因长度为1479bp；与covid-19 rbd相比，delta株rbd只有123、149两位氨基酸突变，omicronrbd有10、42、44、46、88、111、117、148、149、155、164、167、169、172、176、218共16位氨基酸；基因由生工生物工程(上海)股份有限公司优化并合成，以质粒puc57-rbd-mfc、puc57-delta-rbd-mfc、puc57-omicron-rbd-mfc形式提供，表达载体信息如表1。
[0026]
表1表达载体信息
[0027][0028]
表达载体双酶切条件：体系100μl，质粒1μg、限制性核酸内切酶xhoi 1μl、bamhi1 μl、cutsmart buffer(10
×
)10μl、ddh2o补至100μl，37℃4h。基因双酶切条件：体系50μl，基因6ug、限制性核酸内切酶xhoi4 μl、bamhi 4μl、cutsmart buffer(10
×
)5μl、ddh2o补至50μl，37℃4h。表达载体与基因连接条件：体系5μl，质粒双酶切产物1μl、基因双酶切产物3μl、t4dna连接酶0.5μl、t4dna连接酶buffer 0.5μl，16℃过夜连接。转化：将连接产物加入25μl dh5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激45s；冰浴2min；加500μl soc培养基，37℃摇床培养箱，200rpm，培养1h；10000rpm离心1min；弃400μl上清，重悬菌体；涂布含amp的lb固体培养基中；37℃培养箱，倒置培养12h左右。挑菌送测序。比对测序结果，保菌提质粒，按照omega质粒小提试剂盒说明书提取质粒。
[0029]
covid-19-rbd-mfc、delta-rbd-mfc、omicron-rbd-mfc基因蛋白的小量表达：小量表达由重组质粒瞬时转染293t17实现，将293t17培养至对数期后，按2
×
105个/ml的密度接种细胞于24孔细胞培养板中，当密度达到70％左右时进行转染。按照lipofectamine 3000说明书进行转染，转染4-6h后换液，即将含有血清的培养基替换为无血清培养基freestyle，37℃细胞培养箱继续培养。转染48h后收样。wb验证表达情况，确定最适表达载体。
[0030]
结果如图1和2：rbd-mfcs、omicron-rbd-mfcs、delta-rbd-mfcs为融合蛋白的表达上清，融合蛋白约为55kd。
[0031]
根据wb鉴定结果，rbd-mfc、omicron-rbd-mfc、delta-rbd-mfc蛋白在细胞上清中均有表达，选择rbd-mfc-pevl9.4、omicron-rbd-mfc-pevl9.4为最适表达载体。
[0032]
rbd-mfc、omicron-rbd-mfc蛋白的大量表达：根据小量表达的wb实验结果，按照
omega质粒大提试剂盒说明书对相应的表达载体进行质粒大提。大量转染所用转染试剂为pei，将重组质粒转染悬浮细胞293f，293f细胞培养条件为：37℃，8％co2，120rpm。转染过程如下：转染前一天将细胞密度调整至5
×
105个/ml，取600ml细胞于3l细胞培养锥形摇瓶中，待第二天细胞密度达1
×
106个/ml左右时进行转染；取600μg质粒于50ml离心管中；加60ml d-pbs，轻轻混匀三次，每次隔6s；加1.8ml pei(1mg/ml)，按上述方法混匀，静置20-30min；滴加至细胞摇瓶中，继续培养直至收样。
[0033]
rbd-mfc、omicron-rbd-mfc蛋白的纯化、浓缩与浓度测定：取2ml左右的proteina填料与表达目的蛋白的细胞上清进行结合，4℃旋转混匀2h以上。手动过柱，分别收集填料与滤穿液，使用ph8.0 pbs洗柱。加一定体积的ph2.3甘氨酸-盐酸缓冲液于填料中洗脱目的蛋白，收集洗脱液。浓缩：将纯化得到的洗脱液加至超滤管中，4℃，4000rpm，离心40-60min，倒出超滤管中的滤液，加剩余的洗脱液至管中，继续离心，直至加完所有洗脱液。待洗脱液浓缩至1ml左右时，加适量的pbs至满，4℃，4000rpm，离心30-40min。重复加pbs三到五次，使蛋白最终保存于pbs中，最后将蛋白浓缩至2ml左右。所得蛋白稀释三到四个梯度，按照invitrogen2.0荧光定量仪说明书进行蛋白浓度测定，经检测rbd-mfc、omicron-rbd-mfc蛋白浓度为3.7mg/ml、1.8mg/ml。
[0034]
1.免疫方法和程序：
[0035]
免疫途径按照表2进行，在第四次免疫后，7-10天左右时需对小鼠血清抗体水平进行检测，采用elisa法检测血清效价。检测结果表明：小鼠血清效价均在5万倍以上。选定做融合的小鼠(效价最高)后，抗原脾脏加强，3天后进行细胞融合实验。
[0036]
表2 balb/c小鼠的免疫过程
[0037][0038][0039]
2.杂交瘤细胞株制备：
[0040]
2.1细胞融合：
[0041]
2.1.1小鼠脾脏加强3天后，摘眼球取血留样。小鼠颈椎脱臼处死，置于75％酒精内消毒后置超净台中。无菌取出小鼠脾脏，hanks液清洗脾脏表面，尽量去掉结缔组织，后将脾脏置于另一装有hanks液的玻璃平皿中。用注射器针头不断地戳脾脏以释放其中的脾细胞，制成脾细胞悬液。吸取脾细胞悬液，尽量不吸其中的组织块，1200rpm离心5min，弃上清。加1ml红细胞裂解液裂解红细胞，处理1min，加20ml hanks液稀释终止反应，1200rpm离心5min，弃上清。若红细胞未裂解完全，则再处理一次。用hanks液洗细胞两次，用10ml hanks液重悬脾细胞。
[0042]
2.1.2取生长状态良好的sp2/0骨髓瘤细胞，台酚蓝计数，一般一次融合需要约6千
万个细胞。1200rpm离心5min，弃上清，并用hanks液洗涤两次，最后用hanks液重悬sp2/0细胞。
[0043]
2.1.3取hanks液重悬的sp2/0细胞与脾细胞混匀，1200rpm离心5min，弃上清。加800μl 37℃预热的50％peg，45s内加完，边加边旋转混匀，静置30s。用吸管吸取一管hanks液，沿管壁缓慢加至融合细胞中，45s内加完。加第二管hanks液，45s内加完。之后每45s内加一次hanks液，速度由慢至快，直至加完40ml hanks液，混匀。1200rpm离心5min，弃上清，加65ml hat选择培养基(含10％gt-t551)重悬融合细胞。每孔65μl加至制备的饲养层细胞中，置于培养箱中。第二天、第三天每孔补加65μl hat选择培养基至融合细胞中。第四天弃2/3的细胞上清，加65μl hat选择培养基。第五天不做处理。第六天每孔补加65μl hat培养基至融合细胞中。第七天不处理。
[0044]
2.1 4第八天观察融合细胞生长状况，直至出现杂交瘤细胞集落，早期杂交瘤细胞培养物。直至集落达2-3mm时需要筛选上清液中抗体的活性。经鉴定适合于进一步克隆的杂交瘤细胞，用无菌巴斯德管吸出于24孔培养板中并进一步克隆。直至形成稳定的分泌抗体的细胞株。
[0045]
2.2细胞株筛选：
[0046]
2.2.1 covid-19-rbd-mfc免疫小鼠杂交瘤细胞筛选
[0047]
兔抗鼠igg多抗包被elisa板，加免疫鼠血清，37℃孵育40min，洗板。加分别加50ul covid-19、delta株、omicron株rbd-s-tag(偶联s-tag标签)表达上清和50ul s-tag-hrp(偶联hrp的s-tag兔多抗)，37孵育30min，洗板，显色。实验结果如下表3：
[0048]
表3筛选原类型与稀释度
[0049][0050]
由结果可知：covid-19-rbd-mfc免疫小鼠血清与covid-19、delta株rbd均反应结果良好，与omicron株rbd反应较弱。因此，我们在细胞上清筛选时选择covid-19与omicron株rbd作筛选原，covid-19、omicron株筛选原稀释度分别为200、原倍。此外，后续未选择delta株rbd作免疫原和筛选原。
[0051]
按照上述实验确定的筛选方式进行细胞株的筛选，用这种方式筛选到亲和力高特异性好的3株抗rbd蛋白的单克隆抗体，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为mr1、mr4和mr25。
[0052]
2.2.2 omicron株rbd-mfc免疫小鼠杂交瘤细胞筛选
[0053]
同covid-19rbd-mfc免疫小鼠杂交瘤细胞筛选，最终筛选到亲和力高特异性好的1株抗rbd蛋白的单克隆抗体，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为or2。
[0054]
于2022年8月31日提交到中国典型培养物保藏中(cctcc)保藏，保藏号为：c2022260、c2022261、c2022262和c2022263。
[0055]
关于为何没有选择delta株rbd蛋白免疫小鼠及单抗筛选作以下解释：delta株与
covid-19rbd蛋白只有两个氨基酸的差异，在实验时，我们发现covid-19rbd蛋白免疫小鼠产生的单克隆抗体均与delta株rbd反应良好。关于为何选rbd与鼠fc融合蛋白免疫小鼠作以下解释：前期我们表达纯化了covid-19rbd-s-tag融合蛋白，经过一段时间的冷冻保存后，发现蛋白形成了颗粒状沉淀，免疫小鼠效果不好。在尝试偶联鼠fc作融合蛋白的表达中，发现融合蛋白表达量与稳定性高于偶联s-tag标签的融合蛋白。
[0056]
【实施例2】新冠不同毒株rbd蛋白单克隆抗体的制备
[0057]
单抗制备：每株细胞扩大培养注射到石蜡油致敏处理balb/c小鼠腹腔制备腹水抗体，每只小鼠腹腔注射5
×
105个细胞，待小鼠活力下降时处死小鼠，采集腹水。离心取上层腹水于离心管中，经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化igg类腹水抗体。
[0058]
1.1腹水抗体纯化：
[0059]
记录腹水体积n ml，将腹水置于烧杯中，边搅拌边加4n ml的60mm ph 4.0 naac-hac缓冲液，加入总体积0.025倍的辛酸，室温搅拌30min。4℃9000rpm离心15min，经擦镜纸过滤后取上清，加总体积0.35倍的固体(nh4)2so4，搅拌均匀。待溶解后，氨水调节ph至7-8，4℃9000rpm离心15min。弃上清，沉淀用1-2ml pbs重悬，装透析袋，于pbs中4℃透析，透析4h以上更换透析液，换3次即可收样。
[0060]
1.2抗体纯度鉴定：
[0061]
抗体纯度用sds-page鉴定，要求上样蛋白质在25kd和50kd出现清晰两条带。纯度在90％以上。克隆编号及亚类如表4：
[0062]
表4：单抗克隆号及亚类
[0063][0064]
【实施例3】新冠不同毒株rbd蛋白检测的免疫诊断试剂的制备
[0065]
主要试剂：实施例2中纯化所得的单克隆抗体及由北京生物制品研究所馈赠的covid-19-rbd免疫的兔多抗、hrp
[0066]
1.抗体预处理
[0067]
取抗体于pbs中透析，除去其中的防腐剂。
[0068]
2.hrp的预处理
[0069]
2.1称10mg hrp，加纯水制成溶液。
[0070]
2.2称10mgnaio4，加纯水溶解制成溶液。
[0071]
2.3将2.2所制溶液加至2.1中，4℃避光反应30min。
[0072]
2.4取10μl乙二醇加纯水制成乙二醇溶液，加至2.3反应结束的混合液中，室温避光反应30min。
[0073]
3.hrp与抗体结合
[0074]
3.1将1与2中处理好的单抗与hrp混合，置于4℃，ph9.6的碳酸盐缓冲液中透析，过夜。
[0075]
3.2取2mg左右的nabh4，加纯水溶解。加至前一步反应结束的混合液中，4℃避光反应2h。
[0076]
3.3将3.2中的反应结束的抗体混合液放于pbs中，4℃透析过夜，除去其中的残留物。
[0077]
3.4收样，加等体积甘油，混匀，放置-20℃保存。
[0078]
4.新冠rbd检测试剂检测疫苗
[0079]
4.1实施例2中纯化所得的单克隆抗体包被elisa板子，按5μg/ml浓度包被过夜，洗板封闭制成干板。
[0080]
4.2分别加前疫苗样品(由北京生物制品研究所馈赠)与样品稀释液(阴性对照)37℃孵育40min，洗板。在此，前疫苗指的是未加佐剂的疫苗前品。
[0081]
4.3加3.4中保存的hrp标记的抗rbd的单克隆抗体，37℃孵育30min，洗板。
[0082]
4.4加tmb底物显色15分钟，加硫酸终止，酶标仪双波长读数，od450-od630。其结果见表5/6/7.
[0083]
表5通用型检测试剂盒
[0084][0085]
表6 covid-19检测试剂盒
[0086][0087][0088]
表7 omicron株检测试剂盒
[0089][0090]
4.5实验操作注意事项
[0091]
①
试剂使用前应充分摇匀。
[0092]
②
洗涤时各孔均需加满洗液，以防止孔口有游离酶标记物未被洗净。
[0093]
③
结果判读请在反应终止后15分钟内完成。

技术特征：
1.一种针对新型冠状病毒2019-ncov株rbd蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由杂交瘤细胞产生，所述杂交瘤细胞以2019-ncov株的rbd蛋白免疫小鼠后制备得到，所述杂交瘤细胞的保藏号为cctcc no：c2022260、cctcc no：c2022261和cctcc no：c2022262。2.一种新型冠状病毒的免疫诊断试剂，含有权利要求1所述的针对新型冠状病毒2019-ncov株的单克隆抗体。3.根据权利要求2所述的免疫诊断试剂，其中所述的免疫诊断试剂包含由保藏号为cctcc no：c2022261的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，所述免疫诊断试剂用于2019-ncov的特异性检测。4.根据权利要求2所述的免疫诊断试剂，其中所述的免疫诊断试剂包含由保藏号为cctcc no：c2022260和/或cctcc no：c2022262的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，所述免疫诊断试剂用于新型冠状病毒的通用型检测。5.一种检测试剂盒，含有权利要求1所述的针对新型冠状病毒2019-ncov株rbd蛋白的单克隆抗体或权利要求2所述的免疫诊断试剂。6.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞以2019-ncov株的rbd蛋白免疫小鼠后制备得到，保藏号为cctcc no：c2022260、cctcc no：c2022261和cctcc no：c2022262。

技术总结
本发明提供针对新型冠状病毒2019-nCoV株RBD(刺突蛋白受体结合区)蛋白片段的单克隆抗体和由其制备的通用型及特异性免疫检测试剂。本发明获得了亲和力高、特异性好的鼠单克隆抗体，由此制备的免疫检测试剂灵敏度与特异性高。高。


技术研发人员：严兵 卢卫嘉 张越 彭璐 舒晏妮 肖庆红 申佳美
受保护的技术使用者：武汉科源安博生物技术有限公司
技术研发日：2022.09.30
技术公布日：2023/8/1