菊果胶杆菌特异性序列及其在检测魔芋软腐病中的应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及菊果胶杆菌特异性序列及其在检测魔芋软腐病中的应用。


背景技术：

2.魔芋(amorphophallus konjac)为多年生草本植物，主要分布在东南亚和非洲。我国魔芋已有上千年的种植历史，由于魔芋忌高温、喜温暖的特性。魔芋软腐病的发病初期为6-7月，7-8月份为盛发期，且在魔芋生长期和储藏期均能发病，该病不仅危害魔芋植株的地上部分而且能危害地下部分。软腐病一旦发生就会导致魔芋严重减产，产量损失约30％-50％，有的田块达80％以上，甚至绝收。魔芋软腐病属系统性侵染病害，主要通过带病的种芋和土壤传播，至今还没有一种有效的方法来控制该病害。如果种芋带菌，播种后芋块先发生水渍状暗褐色不定形病斑，逐渐向内扩展，使魔芋内部白色组织变成灰白，有时为黄褐色湿腐，球茎软腐成粘稠糊状，有大量菌液溢出。如果土壤带菌，病菌通常先在根基部感染，再往地上部分蔓延，初期感病植株从外观上无异常，内部逐渐通过导管由下往上自叶柄一侧形成水渍状纵长形病斑，病斑随即凹陷成沟槽状，内部组织软腐，向外溢出菌液，散发酒臭味，不久从基部向一边倒伏。
3.迄今为止，魔芋软腐病的防治还是以化学药剂防治为主，但生产上尚未找到防治该病的特效药，同时化学合成农药引起环境问题日益严峻。因此，在播种前检测种植地土壤及魔芋种芋是否携带魔芋软腐病病原菌对于魔芋软腐病的防控具有重要意义。选择优质健康的魔芋育种和不含魔芋软腐病致病菌的土地进行种植能够从源头处阻断魔芋软腐病病害的发生，还可以有效减少种植过程中化学农药的施用。果胶杆菌(pectobacterium)，是植物细菌性软腐病的主要病原菌，发明人团队通过前期调查研究发现湖北省内魔芋软腐病主要致病菌为菊果胶杆菌(pectobacterium chrysanthemi，p.ch)。然而目前仍没有针对菊果胶杆菌(pectobacterium chrysanthemi，p.ch)的有效检测手段。


技术实现要素：

4.鉴于上述内容，在探明湖北魔芋软腐病病原菌种类的研究基础上，申请人提供了菊果胶杆菌特异性序列，所述序列为seq id no.1所示。
5.本发明的另一个目的在于提供了seq id no.1所示多核苷酸在鉴定菊果胶杆菌(pectobacterium chrysanthemi，p.ch)中的应用，利用该方法，可以鉴定湖北省内的魔芋软腐病。
6.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
7.申请人通过分离，测序，比对，获得了菊果胶杆菌特异性序列，所述序列为seq id no.1所示。
8.本发明的保护内容还包括，上述特异性序列在鉴定菊果胶杆菌(pectobacteriumchrysanthemi，p.ch)中的应用，及该序列可以鉴定菊果胶杆菌，同时还可
以鉴定由菊果胶杆菌感染引起的病症。
9.所述的pcr检测引物如下：
10.正向引物：5
′‑
aggaataccggtggcgaaggcg-3
′
11.反向引物：5
′‑
cacgtgctacaatggcgtatac-3
′
。
12.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
13.本发明针对湖北省魔芋软腐病主要由致病菌菊果胶杆菌(pectobacteriumchrysanthemi，p.ch)侵染引起的特性，筛选出一段特异性序列用于鉴定菊果胶杆菌。进一步的，申请人针对该特异性序列设计引物，制备成dna检测试剂盒，可以有效快速检测土壤样品及魔芋样品中是否含有魔芋软腐病致病菌菊果胶杆菌(pectobacterium chrysanthemi，p.ch)，检测效果精准可靠，pcr产物条带清晰。使用本技术的试剂盒最大优势是可在魔芋种植前对种植地土壤和魔芋种芋进行检测，能够从源头处阻断魔芋软腐病病害的发生，为湖北地区魔芋软腐病的防控提供有效的检测手段。
14.每个样本仅需要0.1g土壤或魔芋植株样品，样品dna提取及后续pcr检测可实现批量操作，整套检测流程可在4h内完成。
附图说明
15.图1为利用本发明的引物对土壤中魔芋软腐病致病菌的检测验证图；
16.其中m为d2000 dna marker，条带从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；(+)为阳性对照，dna模板为菊果胶杆菌(pectobacterium chrysanthemi，p.ch)菌液；(-)为阴性对照，dna模板为ddh2o；1-10号为待测土壤样品。
17.实施例1：
18.菊果胶杆菌特异性序列的获得及检测：
19.菊果胶杆菌是湖北省内魔芋软腐病主要致病菌，申请人通过分离，测序，比对，获得了菊果胶杆菌特异性序列，所述序列为seq id no.1所示。
20.针对上述特异性序列，申请人设计了pcr检测引物如下：
21.正向引物：5
′‑
aggaataccggtggcgaaggcg-3
′
22.反向引物：5
′‑
cacgtgctacaatggcgtatac-3
′
。
23.利用上述引物检测菊果胶杆菌的方法，包括如下步骤：
24.所述pcr扩增反应的体系总体积20μl，具体为2
×
pcr master mix试剂10μl；10μmol/l的引物对正向引物1μl；10μmol/l的引物对反向引物1μl；待测dna 1μl；ddh2o 7μl。
25.pcr扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，总共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃终止反应。
26.pcr扩增产物有大小为539bp的片段条带，说明土壤中含有魔芋软腐病病原菌菊果胶杆菌(pectobacterium chrysanthemi，p.ch)。
27.实施例2：
28.菊果胶杆菌特异性序列在检测湖北省内魔芋软腐病中的应用：
29.步骤1：魔芋土壤样品取样：在湖北省主要魔芋产区十堰、恩施、宜昌等地进行样方地选取并采用五点取样法进行田间土壤取样。
30.步骤2：提取土壤样品dna：每个样品称取0.1g新鲜土壤样品，利用土壤dna快速提
取试剂盒进行dna提取，所得到的土壤dna用于后续pcr检测，可置于-20℃的冰箱中保存。
31.步骤3：进行pcr检测：采用上述描述的pcr检测体系及反应程序对样品进行检测，检测结果如图1所示。其中(+)为阳性对照，dna模板为菊果胶杆菌(pectobacteriumchrysanthemi，p.ch)菌液；(-)为阴性对照，dna模板为ddh2o；1-10号为待测土壤样品，其中1、2、3、10号样品pcr扩增产物有大小为539bp的片段条带，说明土壤中含有魔芋软腐病病原菌菊果胶杆菌(pectobacterium chrysanthemi，p.ch)，4、5、6、7、8、9号样品pcr扩增产物没有条带，说明土壤中不含魔芋软腐病病原菌。
32.(4)测试样品土壤魔芋种植实验：将上述1-10号土壤样品分装至营养钵中，每个样品3个重复，分别将通过组织培养获得的魔芋无菌组培苗移栽如营养钵中，对照组为灭菌基质。于光照培养室中进行培养，后期结果为对照组及未检出病原菌的4、5、6、7、8、9号土壤样品种植的魔芋组培苗生长正常；1、2、3、10号检测出含有软腐病致病菌土壤种植的魔芋组培苗发病死亡。魔芋植株种植实验结果与土壤pcr检测结果一致，表明本技术的试剂盒可准确有效地检测魔芋软腐病致病菌菊果胶杆菌(pectobacterium chrysanthemi，p.ch)。

技术特征：
1. 菊果胶杆菌（pectobacterium chrysanthemi，p.ch)特异性序列，所述序列为seq id no.1所示。2. 检测权利要求1所述的序列的引物在鉴定果胶杆菌感染引起的病症中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，所述的引物为：正向引物：5
′‑
aggaataccggtggcgaaggcg-3
′
反向引物：5
′‑
cacgtgctacaatggcgtatac-3
′
。

技术总结
本发明涉及基因试剂盒检测技术领域，公开了菊果胶杆菌特异性序列及其在检测魔芋软腐病中的应用。本发明针对湖北省魔芋软腐病致病菌主要为菊果胶杆菌（Pectobacterium chrysanthemi，P.ch)的特点，设计该病原菌的PCR特异性引物，制备特异的检测试剂盒，该试剂盒能快速有效地检测出土壤及魔芋种芋中是否携带病原菌，可为湖北省内魔芋软腐病病害的监测、防控防治及种芋检测提供了有效快速手段。防控防治及种芋检测提供了有效快速手段。


技术研发人员：齐传东 吴金平 周洁 郭凤领 肖颖
受保护的技术使用者：湖北省农业科学院经济作物研究所
技术研发日：2022.11.28
技术公布日：2023/8/1