一种提高重组蛋白表达效率的酸性表面助溶短肽标签的制作方法

1.本发明属于蛋白纯化领域，具体涉及了一种利用计算机辅助计算设计的酸性表面助溶短肽标签。


背景技术：

2.近年来随着生物技术的不断发展，重组蛋白表达和纯化技术一直受到人们的重视和广泛应用，其中原核表达成本最低，最易于操作和纯化效率最高。大肠杆菌(e.coli)是重组蛋白生产最常用的宿主生物之一。
3.很多富含疏水氨基酸残基的重组蛋白，尤其一些来自非原核生物的重组蛋白，由于原核细胞内部缺乏相应的蛋白折叠和保护机制，常常面临难溶解和大量进入包涵体的问题。这些在表达过程中发生沉淀的重组蛋白即便在重新溶解后也存在大量失活的现象。
4.为达到增加表达量，提高产物的正确构象比例及可溶性，方便下游纯化操作，人们采用助溶蛋白融合表达的方式，应用如绿色荧光蛋白(gfp)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、谷胱甘肽硫转移酶(gst)等。然而，由于这些助溶蛋白自身分子量较大，仍然存在折叠时间较长，助溶效果有限和易干扰重组蛋白活性等缺陷。因此，本领域需要设计和开发新的助溶肽分子助力重组蛋白的生产纯化。


技术实现要素：

5.由于大多数蛋白质具有偏酸性或中性的等电点[link a j et al.，comparing the predicted and observed properties of proteins encoded in the genome of escherichia coli k-12，electrophoresis,1997,18(8):1259-1313]，因此本发明通过计算机辅助计算，对短小的稳定蛋白结构域进行电荷分布的表面化设计，使之表面包含多个负电荷，使之本身极性提高更容易溶于水，并能够与具有偏酸性等电点的蛋白质发生互斥作用，可使蛋白纯化过程中减少聚集，不仅起到优越的助溶作用，也减少了对重组蛋白自身折叠过程的干扰。细菌的一些受体蛋白的溶剂暴露表面，特别是那些含有螺旋束结构的受体表面，被证明是非常稳定的[alexander p et al.，thermodynamic analysis of the folding of the streptococcal protein g igg-binding domains b1 and b2:why small proteins tend to have high denaturation temperatures，biochemistry,1992.31(14):3597-3603]。可以利用这些稳定的溶剂暴露表面区域的区域来设计稳定的助溶肽。
[0006]
本发明的酸性表面助溶短肽标签(sacid)基于葡萄球菌蛋白a的b结构域[n et al.，a synthetic igg-binding domain based on staphylococcal protein a，protein eng,1(2):107-113，1987]改造而来。该结构域短小稳定，仅含57个氨基酸残基，分子量仅8kd，适合进行电荷分布改造和作为融合标签添加到重组蛋白上，其可高效助溶重组蛋白，在提纯过程中稳定重组蛋白构象，提高重组蛋白表达效率，维持其生物学功能活性。本发明将这种改造后的表面富含负电荷的短小多肽嫁接到目标重组蛋白，与早期其他研究
者已发表的正电荷助溶标签相比，对提高重组蛋白的表达效率、溶解性和生物活性方面更具优势。
[0007]
在第一方面，本发明提供了一种分离的肽，其包含氨基酸序列vdnkfnke qqx1afyeilhlpnlneeqrnafiqx2lkddpx3x4sx5x6x7lx8eax9x
10
lnda qpk(seq id no：9)，其中：x
1-x
10
均是带负电荷氨基酸，优选为谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)。
[0008]
在第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其编码第一方面的肽。
[0009]
在第三方面，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽是第一方面的肽，所述第二肽是目的多肽。
[0010]
在第四方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其编码第三方面的融合蛋白。
[0011]
在第五方面，本发明提供了一种构建体，其包含第四方面的多核苷酸。
[0012]
在第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含第四方面的多核苷酸或第五方面的构建体，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白。
[0013]
在第七方面，本发明提供了一种生产融合蛋白的方法，包括：(a)在适合融合蛋白表达的条件下培养第六方面的宿主细胞；和(b)回收融合蛋白，任选地，(c)切割融合蛋白以释放目的多肽和(d)回收所述目的多肽。
[0014]
在第八方面，本发明提供了第一方面的肽或第二方面的多核苷酸用于生产目的蛋白的用途。
[0015]
在第九方面，本发明提供了一种生产目的蛋白的方法，包括：(a)在宿主细胞中表达目的蛋白与第一方面的肽融合形成的融合蛋白；(b)切割融合蛋白，释放目的蛋白；和(c)任选地，分离和/或纯化所述目的蛋白。
附图说明
[0016]
图1：不同短肽标签的氨基酸序列的序列比对结果。其中，wt相应于seq idno：4；zbasic相应于seq id no：7；sacid相应于seq id no：1；sacid1相应于seq id no：2；以及sacid2相应于seq id no：3。
[0017]
图2：不同短肽标签在生理ph的静电势模型；a图为葡萄球菌蛋白a的b结构域在生理ph下n端(左)和c端(右)的静电势模型；b图为zbasic在生理ph下n端(左)和c端(右)的静电势模型；c图为sacid在生理ph下n端(左)和c端(右)的静电势模型；d图为sacid 1在生理ph下n端(左)和c端(右)的静电势模型；e图为sacid 2在生理ph下n端(左)和c端(右)的静电势模型。
[0018]
图3：通过计算机辅助预测的溶解度及等电点(网址https://protein-sol.manchester.ac.uk/)。其基于序列预测蛋白质可溶性。基于对无细胞表达的大肠杆菌蛋白质溶解度双峰分布的观察[niwa t et al.，bimodal protein solubility distribution revealed by an aggregation analysis of the entire ensemble of escherichia coli proteins，proceedings of the national academy ofsciences of the united states of america,2009,106(11):4201-4206]，这些测量报告了一种蛋白质的可溶性部分(在离心后的上清液中)与该蛋白质的总量之比，而不是一种热力学属性。该工具计算35种特征，包括：20种氨基酸组成；7种氨基酸组合：k-r、d-e、k+r、d+e、k+r-d-e、k+r+d+e、f+w+y；8种预测的特征：长度、等电点、疏水性、ph＝7.0时蛋白的净电荷、折叠倾向、
无序区、序列熵、和β链倾向。结合35个特征的线性模型给出了对溶解度数据的初步拟合。返回值介于0-1之间，如果高于0.45(大肠杆菌表达的蛋白数据集niwa et al(2009)的平均值)，意味着蛋白的溶解性可能比大肠杆菌表达的蛋白平均的溶解性要高。
[0019]
a图和b图为不同助溶标签的溶解度。从图中可知，本发明的酸性短肽助溶标签(sacid)和改造前的野生型(wt)标签的自身溶解性虽然相差不大，甚至略低于sumo标签(a图)，但是由于其带电基团集中在表面，因而在和重组蛋白融合后，能比其他标签更有效与水中带正电的质子发生相互作用形成水化膜，从而帮助重组蛋白溶解。因而sacid标签在与目的蛋白融合后，可明显提高目的蛋白的溶解度(b图)。本发明的酸性短肽助溶标签(sacid)比已知发表的正电荷标签(zbasic)的自身溶解度要高(a图)，二者电荷均分布在表面，但是由于酸性表面的负电荷可以和大多偏弱酸性的重组蛋白表面更多的负电荷相互排斥，因而不容易发生聚集，比碱性助溶肽标签的助溶效果更好。因而，在与目的蛋白融合后，助溶效果明显优于正电荷标签(zbasic)(b图)。类似的，和其他常见的已知助溶标签相比，本发明的酸性短肽助溶标签(sacid)自身的助溶效果也明显更优。
[0020]
c图和d图为不同助溶标签的等电点。从图中可知本发明的酸性短肽助溶标签体现出更好的偏酸性。在与目的蛋白融合后，融合蛋白的pi仍体现较强偏酸性。
[0021]
e图为本发明的酸性短肽助溶标签(sacid)预测的特征(ph＝7.0时蛋白的净电荷、折叠倾向等)。
[0022]
图4：本发明所采用的蛋白表达纯化技术示意图。
[0023]
图5：不同纯化标签纯化目的蛋白的电泳鉴定。
[0024]
a图为单独表达nsii蛋白时的情况。m：蛋白质分子量标准；f：strep-tag ii纯化流穿液；w1、w2：strep-tag ii纯化洗杂液；e：strep tag ii纯化洗脱液。箭头指向目的蛋白，从图中可见，单独表达nsii蛋白，由于该蛋白正确折叠前易发生聚集沉淀，其表达量不高，纯化后，目的蛋白明显减少甚至完全损失。
[0025]
b图为采用neongreen作为助溶肽表达nsii，neongreen-nsii融合蛋白的可溶性表达情况。m：蛋白质分子量标准；f：strep-tag ii纯化流穿液；w1、w2：strep-tag ii纯化洗杂液；e：strep tag ii纯化洗脱液。箭头指向融合蛋白，说明采用neongreen作为助溶蛋白融合表达的方式，虽然也能够实现融合蛋白的纯化和富集，但由于自身分子量较大，仍然存在折叠时间较长，助溶效果有限和易干扰重组蛋白活性等缺陷，从图中可看出大部分蛋白以不溶性包涵体存在且融合蛋白易降解。
[0026]
c图为采用其他研究者已发表的正电荷助溶标签(zbasic)作为纯化标签，采用strep-tag ii亲和柱层析纯化融合蛋白的电泳鉴定。m：蛋白质分子量标准；f：strep-tag ii纯化流穿液；w1、w2：strep-tag ii纯化洗杂液；e：strep tag ii纯化洗脱液。箭头指向融合蛋白，与图5d相比，已发表的正电荷助溶标签(zbasic)产量偏低；侧面说明本发明sacid标签可高效助溶重组蛋白，在提纯过程中稳定重组蛋白构象，提高重组蛋白表达效率。
[0027]
d图为采用本发明技术以sacid作为纯化标签，采用strep-tag ii亲和柱层析纯化融合蛋白的电泳鉴定。m：蛋白质分子量标准；f：strep-tag ii纯化流穿液；w1：strep-tag ii纯化洗杂液；e：strep tag ii纯化洗脱液。箭头指向融合蛋白，与图5c相比，sacid标签明显提高了融合蛋白的可溶性，且经过strep-tag ii纯化后得到目的蛋白。
[0028]
图6：sacid与neongreen纯化标签纯化目的蛋白的比较
[0029]
a图为采用sacid和neongreen作为助溶肽表达tevp蛋白的sds page图。m：蛋白质分子量标准；st：sacid-tevp融合蛋白；nt：neongreen-tevp融合蛋白。箭头指向融合蛋白，从图中仅能观察到sacid-tevp在39kd处有一条较浓的条带，而采用neongreen作为助溶蛋白融合表达的方式却不能很好的看出目的条带。
[0030]
b图为采用sacid和neongreen作为助溶肽表达tevp的western印迹图。m：蛋白质分子量标准；st：sacid-tevp融合蛋白；nt：neongreen-tevp融合蛋白。箭头指向融合蛋白，从图中可以看出，采用sacid作为助溶肽，western印迹结果显示在39kd出有明显的条带，但采用neongreen作为助溶肽，western印迹却未观察到目的条带，与a图的sds page结果基本一致。说明采用本发明融合表达后，目的蛋白表达量得到了大幅度提高；与其他标签相比，本发明sacid标签明显提高了融合蛋白的可溶性。
[0031]
图7：纯化蛋白的活性测试，使用含单个nsii酶切位点和单个hindiii酶切位点的质粒做底物，进行双酶切反应后，得到3392bp和1987bp的目标条带。对提纯的nsii酶进行梯度(101～108倍)稀释后进行双酶切反应(37℃，1小时)。a图为单独表达的nsii蛋白和neongreen-nsii蛋白的双酶切鉴定；b图为正电荷助溶标签(zbasic)表达的nsii蛋白和本发明sacid-nsii蛋白的双酶切鉴定。从图中可以看出，单独表达的nsii蛋白几乎无活性；neongreen-nsii融合蛋白及正电荷助溶标签(zbasic)表达的nsii蛋白活性基本一致；而采用本发明技术以sacid作为纯化标签，纯化的蛋白sacid-nsii的活性得到大幅度提高，比neongreen-nsii融合蛋白及正电荷助溶标签(zbasic)表达的nsii蛋白活性均较高。
[0032]
图8：不同方式纯化的酶的比活力(一个单位定义为在50μl反应缓冲液中在37℃、1小时消化1μg含单个nsii酶切位点的质粒dna所需的酶量)。
具体实施方式
[0033]
除非另有说明或者上下文明显，本文所用的缩写具有其在化学和生物学领域内的常规含义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。本发明中未作具体说明的实验方法，均根据《分子克隆实验指南》(第四版)j.萨姆布鲁克一书中具体方法进行，或者按照相关产品说明书进行。本发明中所用生物试剂，无特殊说明，均可以从商业途径获得。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。
[0034]
除非另有说明，本文中提及核酸序列时从左至右为5
′
至3
′
方向；提及氨基酸序列时从左(上游)至右(下游)为氨基(n)至羧基(c)方向。
[0035]
本发明以葡萄球菌蛋白a的b结构域所示的氨基酸序列为基础，利用计算机辅助计算，对天然葡萄球菌蛋白a的b结构的c端结构域进行改造，引入带负电荷的氨基酸，让带负电的氨基酸集中在一面，设计了酸性表面助溶短肽标签(sacid)。
[0036]
本发明通过计算机辅助计算，对短小的稳定蛋白结构域进行电荷分布的表面化设计，使之表面包含多个负电，设计了几种酸性短肽标签，即sacid(seq idno：1)、sacid1(seq id no：2)、sacid2(seq id no：3)，发现sacid标签的电荷比较集中，较其他设计的标签更加偏酸性，且能够与具有低等电点的蛋白质发生互斥作用，可使蛋白纯化过程中减少聚集，起到优越的助溶作用。将此标签与目的蛋白融合，发现该标签可高效助溶重组蛋白，在提纯过程中稳定重组蛋白构象，提高重组蛋白表达效率，维持其生物学功能活性。所述方法将所要
研究的酸性表面助溶短肽标签与目的蛋白融合表达，通过亲和层析快速实现目的蛋白的纯化。
[0037]
在第一方面，本发明提供了一种分离的肽，其包含氨基酸序列vdnkfnke qqx1afyeilhlpnlneeqrnafiqx2lkddpx3x4sx5x6x7lx8eax9x
10
lnda qpk(seq id no：9)，其中：x
1-x
10
均是带负电荷氨基酸，优选为谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)。
[0038]
在一个实施方案中，x1为d。在一个实施方案中，x2为e。在一个实施方案中，x3为e。在一个实施方案中，x4为e。在一个实施方案中，x5为d。在一个实施方案中，x6为e。在一个实施方案中，x7为e。在一个实施方案中，x8为e。在一个实施方案中，x9为d。在一个实施方案中，x
10
为d。
[0039]
本发明提供的分离的肽是一种能够提高重组蛋白表达效率的酸性表面助溶短肽，其基于葡萄球菌蛋白a的b结构域的氨基酸序列(seq id no：4)，引入带负电荷的氨基酸并让带负电的氨基酸集中在表面。通过计算机辅助预测(参见https://protein-sol.manchester.ac.uk/)，基于序列预测蛋白质可溶性。该工具计算35种特征，包括：20种氨基酸组成；7种氨基酸组合：k-r、d-e、k+r、d+e、k+r-d-e、k+r+d+e、f+w+y；8种预测的特征：长度、等电点、疏水性、ph＝7.0时蛋白的净电荷、折叠倾向、无序区、序列熵、和β链倾向。结合35个特征的线性模型给出了对溶解度数据的初步拟合。预测的返回值介于0-1之间，如果高于0.45(大肠杆菌表达的蛋白数据集niwa et al(2009)的平均值)，意味着蛋白的溶解性可能比大肠杆菌表达的蛋白平均的溶解性要高。
[0040]
因此，在一个优选实施方案中，seq id no：9所示的肽的预测的溶解度大于0.45，如基于https://protein-sol.manchester.ac.uk/所预测的。在一个实施方案中，seq id no：9所示的肽的预测的溶解度等于或大于0.70，如基于https://protein-sol.manchester.ac.uk/所预测的。
[0041]
在一个实施方案中，所述seq id no：9的助溶肽的等电点pi等于或小于5.0。
[0042]
在一个实施方案中，所述肽包含seq id no：1所示的氨基酸序列或由seq id no：1所示的氨基酸序列组成。
[0043]
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且定义为由通过肽键连接的氨基酸残基组成的生物分子。
[0044]
在第二方面，本发明涉及编码第一方面的肽的多核苷酸。
[0045]
如本文所用，术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸”和“核酸序列”可互换使用，是指多个核苷酸通过3
’‑5’‑
磷酸二酯键连接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本发明的多核苷酸的序列可以针对不同的宿主细胞(如大肠杆菌)进行密码子优化，从而改善融合蛋白的表达。进行密码子优化的方法是本领域已知的。
[0046]
在第三方面，本发明涉及分离的融合蛋白，其包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽是本发明第一方面的肽，所述第二肽是目的多肽。
[0047]
如本文所用，“目的多肽”是指可通过本发明的方法生产并纯化的任何多肽或蛋白质，其非限制性例子包括酶、激素、免疫球蛋白链、诸如抗癌多肽的治疗性多肽、诊断性多肽或者可以用于免疫目的的多肽或其生物学活性片段等等。目的多肽可以来自任何来源，包括微生物来源多肽、哺乳动物来源多肽和人工蛋白质(例如融合蛋白或突变的蛋白质)等等。
[0048]
目的多肽可以是任何长度的多肽和蛋白。在一个实施方案中，可通过本发明的方法生产并纯化的目的多肽的长度可以是20-500个氨基酸残基，例如，大约30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个氨基酸残基。
[0049]
在一个实施方案中，本文所述目的多肽是具有低于、等于或略大于7.0的酸性或中性或弱碱性等电点，例如等于或低于8.0、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5或4.0。
[0050]
在一些实施方案中，第一肽可以位于第二肽的上游(n端)或下游(c端)，优选位于上游(n端)。在一些实施方案中，第一肽位于第二肽的上游。在一些实施方案中，第一肽位于第二肽的下游。
[0051]
如本文所用，第一肽位于第二肽的“上游”是指第一肽的c末端残基位于第二肽的n末端残基之前；第一肽位于第二肽的“下游”是指第一肽的n末端残基位于第二肽的c末端残基之后。
[0052]
本发明目的多肽的生产和纯化可在较温和的ph变化(例如ph 7-11)条件下实现，对于目的多肽的种类和性质没有特殊的限制，可用于多种不同多肽的表达和纯化，且最终目的多肽的产量和产率均较高。
[0053]
可通过本发明的方法来生产并纯化的“目的多肽”的实例包括但不限于枯草芽孢杆菌脂肪酶a(lipa)、绿色荧光蛋白(gfp)和烟曲霉ii型酮胺氧化酶(ama)、胰高血糖素样肽(glp-1)、基质细胞衍生因子(sdf-1α)、舍莫瑞林(sermorelin)、pleurocidin样阳离子抗菌肽nrc-03(pnrc03)和hinnavin ii-melanocyte(hm)或它们的生物学活性片段等。
[0054]
在一个实施方案中，所述目的多肽是nsii蛋白，例如包含seq id no：5所示的氨基酸序列。
[0055]
在一个实施方案中，所述目的多肽是tevp蛋白，例如包含seq id no：8所示的氨基酸序列。
[0056]
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中的第一肽和第二肽通过间隔物连接。
[0057]
如本文所用，“间隔物”或“间隔序列”是指具有一定长度的由低疏水性和低电荷效应的氨基酸组成的肽，其用于融合蛋白时可以使所连接的各部分充分展开、互不干扰地充分折叠成各自的天然构象。本领域常用的间隔物包括例如，富含甘氨酸(g)和丝氨酸(s)的柔性的gs型接头；富含脯氨酸(p)和苏氨酸(t)的刚性的pt型接头。由于gs型接头具有较合适的氨基酸长度，同时具有疏水性和延展性并能使功能蛋白具有较好的稳定性和生物活性，因而在本发明中优选使用gs型接头。
[0058]
在某些应用中，例如在多肽类药物的生产中，需要重组生产的多肽与目的多肽具有一致的序列，即两端不具有额外的氨基酸残基。为此，在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中的间隔物还包含切割位点。通过所述切割位点的切割，可以将目的多肽从融合蛋白中释放。
[0059]
合适的切割位点包括可以化学切割、酶法切割或自切割的切割位点，或本领域技术人员已知的其它任何切割位点。本发明中优选的切割位点可以进行自切割，例如，其包含可自切割的内含肽的氨基酸序列。这是因为基于内含肽的切割方法不需要外加酶或使用如化学法中所用的溴化氢等有害物质，而仅仅需要改变聚集体所处的缓冲环境就能简单地诱导切割。本领域已知多种自切割内含肽，例如neb公司的一系列具有不同自切割特性的内含肽。
[0060]
在一些实施方案中，间隔序列可以含有能被特异性化学切割或生物酶解的特定序列，例如met(甲硫氨酸)残基可被cnbr化学切割，lys(赖氨酸)或arg(精氨酸)残基可被胰蛋白酶切割，lysarg或argarg可被双碱基蛋白酶类如kex2切割，gluasnleutyrphegln可被烟草蚀纹病毒蛋白酶(tev蛋白酶，tevp)识别和切割，ilegluglyarg可被xa因子(xa蛋白酶)识别和切割，以及其它合适的蛋白酶切位点或者内切肽(intein)。
[0061]
在进一步的实施方案中，所述融合蛋白还可以包含与第二肽(目的多肽)连接的用于分离纯化第二肽的部分，例如6组氨酸标签、gst标签、strep标签、twin-strep标签、mbp标签等。由此，在去除所述第一肽后，可以通过该部分来分离纯化第二肽。
[0062]
在一个实施方案中，所述融合蛋白包含本发明第一方面所述的肽、间隔物、目的多肽和用于分离纯化第二肽的部分。
[0063]
在第四方面，本发明涉及包含编码所述融合蛋白的核苷酸序列的分离的多核苷酸，以及在第五方面，本发明涉及包含第四方面的多核苷酸的构建体、特别是表达构建体。
[0064]
在本发明的表达构建体中，编码所述融合蛋白的多核苷酸的序列与表达控制序列可操纵地连接以进行希望的转录及最终在宿主细胞中生产所述融合蛋白。合适的表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、核糖体作用位点如核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录剪接序列、转录终止序列和稳定mrna的序列等等。
[0065]
用于构建本发明的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞dna中并和宿主细胞dna一起复制的载体。可商购获得许多适于本发明的载体。在一个实施方案中，所述质粒为适用于原核或真核表达系统的质粒。在一个具体实施方案中，所述质粒为或衍生自pet28a。
[0066]
在第六方面，本发明涉及能够表达本发明第三方面的融合蛋白的宿主细胞。所述宿主细胞含有本发明第四方面的多核苷酸或本发明第五方面的构建体例如表达构建体，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白。
[0067]
用于表达本发明融合蛋白的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(escherichia)、芽孢杆菌属(bacillus)、沙门氏菌属(salmonella)以及假单胞菌属(pseudomonas)和链霉菌属(streptomyces)的细菌。在优选的实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。在更优选的实施方案中，宿主细胞是是大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽抱杆菌(bacillus subtilis)或巨大芽抱杆菌(bacillus megaterium)。在本发明的一个具体实施方案中，所使用的宿主细胞为大肠杆菌rosetta(de3)菌株细胞。
[0068]
可以通过许多已熟知的技术之一将本发明的多核苷酸或构建体例如表达构建体导入宿主细胞以表达编码的氨基酸序列，这样的技术包括但不限于：热激转化，电穿孔，deae-葡聚糖转染，显微注射，脂质体接介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。
[0069]
在一个实施方案中，编码融合蛋白的多核苷酸可以整合入宿主细胞的基因组中，其可以在适当的条件下表达所编码的融合蛋白或者组成性表达所编码的融合蛋白。
[0070]
在一个实施方案中，编码融合蛋白的多核苷酸以染色体外的形式(例如质粒或构建体例如表达载体)存在于宿主细胞中。
[0071]
在第七方面，本发明还涉及制备本发明第三方面的融合蛋白的方法，包括：在适合
融合蛋白表达的条件下培养本发明第六方面的宿主细胞；和回收融合蛋白，任选地，通过融合蛋白切割以释放目的多肽和回收所述目的多肽。
[0072]
在一个实施方案中，所述方法包括：用本发明第五方面的构建体特别是表达构建体转化宿主细胞，在适合融合蛋白表达的条件下培养经转化的宿主细胞以及回收融合蛋白，任选地，通过切割融合蛋白以释放目的多肽和回收所述目的多肽。
[0073]
本领域已知表达融合蛋白的条件，例如温度、ph、培养基等。本领域已知回收融合蛋白的任何合适方法，包括但不限于例如通过层析、离心、透析等。
[0074]
如本文所述，回收融合蛋白可以采用本领域已知的任何合适方法进行。例如，在融合蛋白表达后，收集宿主细胞，裂解细胞，收集上清(例如通过离心除去细胞碎片)，任选地分离(例如通过特定标签或特异性结合分子如抗体)融合蛋白。
[0075]
在一个实施方案中，所述方法包括：用本发明第五方面的构建体特别是表达构建体转化宿主细胞，在适合融合蛋白表达的条件下培养经转化的宿主细胞，收集并裂解细胞，收集上清，任选地分离融合蛋白。
[0076]
在优选的实施方案中，在所述融合蛋白的短肽标签和目的蛋白之间包括间隔序列，所述间隔序列包含可被切割的切割位点(如本文所述的切割位点)，由此通过切割该切割位点，可以去除短肽标签，由此释放目的蛋白。
[0077]
在第八方面，本发明提供了第一方面的肽或第二方面的多核苷酸用于在宿主细胞中准备目的蛋白的用途。
[0078]
本发明第一方面的肽可以与目的蛋白形成融合蛋白，从而在宿主细胞中表达后，可以增加融合蛋白的溶解度，提高融合蛋白的表达效率，并且可以保持目的蛋白的生物学活性。
[0079]
例如，可以将第二方面的多核苷酸与编码目的蛋白的多核苷酸符合读框地连接在一起，并置于合适的表达调控元件(例如启动子)的控制下，从而在合适的表达系统中表达希望的融合蛋白。
[0080]
在第九方面，本发明提供了一种生产目的蛋白的方法，包括在宿主细胞中表达本发明第一方面所述的肽与目的蛋白融合形成的例如本发明第三方面所述的融合蛋白，回收融合蛋白，切割所述融合蛋白以释放目的蛋白，任选地分离纯化释放的目的蛋白。
[0081]
在一个实施方案中，所述方法包括：构建表达构建体(例如质粒或病毒载体)，其包含编码本发明第一方面所述的肽与目的蛋白融合形成的融合蛋白的核苷酸序列，用所述表达构建体转化宿主细胞，在适合融合蛋白表达的条件下培养经转化的宿主细胞，回收融合蛋白，切割所述融合蛋白以释放目的蛋白，任选地分离纯化释放的目的蛋白。
[0082]
如本文所述，回收融合蛋白可以采用本领域已知的任何合适方法进行。例如，在融合蛋白表达后，收集宿主细胞，裂解细胞，收集上清(例如通过离心除去细胞碎片)，任选地分离(例如通过特定标签或特异性结合分子如抗体)融合蛋白。
[0083]
在一个实施方案中，所述方法包括：用本发明第五方面的构建体特别是表达构建体转化宿主细胞，在适合融合蛋白表达的条件下培养经转化的宿主细胞，收集并裂解细胞，收集上清，切割所述融合蛋白以释放目的蛋白，任选地分离纯化释放的目的蛋白。
[0084]
如本文所述，切割融合蛋白可以采用本领域已知的任何合适手段进行，例如在短肽标签和目的蛋白之间包括间隔序列，所述间隔序列包含可被切割的切割位点(如本文所
述的切割位点)，由此通过切割融合蛋白可以去除短肽标签，从而释放目的蛋白。
[0085]
在进一步的实施方案中，所述融合蛋白还可以包含与目的蛋白连接的用于分离纯化目的的部分，例如6组氨酸标签、gst标签、strep标签、twin-strep标签、mbp标签等。由此，在去除所述第一肽后，可以通过该部分来分离纯化目的蛋白。
[0086]
在一个实施方案中，所述方法包括构建表达构建体，其包含编码本发明第一方面所述的肽核苷酸序列、编码间隔序列的核苷酸序列、编码目的蛋白的核苷酸序列和编码用于分离纯化第二肽的部分的核苷酸序列。
[0087]
在一个实施方案中，所述宿主细胞选自原核生物、酵母和真核细胞例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，更优选选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和链霉菌属，更优选选自埃希氏菌属，更优选是大肠杆菌、枯草芽抱杆菌或巨大芽抱杆菌，更优选大肠杆菌rosetta(de3)。
[0088]
在一个实施方案中，所述目的蛋白具有低于、等于或略大于7.0的酸性或中性或弱碱性等电点，例如等于或低于8.0、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5或4.0，更优选是包含seq id no：5所示氨基酸序列的nsii蛋白或包含seq id no：8所示氨基酸序列的tevp蛋白。
[0089]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0090]
1)本发明与传统技术相比，能够克服目的蛋白在原核表达系统易形成包涵体的缺点，可高效助溶重组蛋白，在提纯过程中稳定重组蛋白构象，提高重组蛋白表达效率，维持其生物学功能活性，可广泛应用于难溶解蛋白的发酵生产领域；
[0091]
2)本发明的酸性短肽助溶标签可替代gst、mbp、neongreen等助溶标签，比现有已知的常用助溶标签均更短小，且结构稳定，仅含57个氨基酸残基，分子量仅8kd，和重组蛋白融合表达时对重组蛋白潜在的影响更少；
[0092]
3)与之前已知的正电荷助溶标签(zbasic)相比，本发明的酸性助溶标签(sacid)与生物体内广泛存在的偏酸性蛋白之间相互排斥，更不容易发生聚集效应，从而更有利于重组蛋白的溶解和折叠，在提高重组蛋白的溶解性，表达效率和生物活性等方面更具优势；
[0093]
4)本发明标签在亲和纯化应用中同样能获得高纯度的目标蛋白，说明改造并没有对亲和纯化产生影响。
[0094]
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。
[0095]
如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在一些实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。在一些实施方案中，约是指到具体数值的+/-10％。
[0096]
虽然在此示出并描述了本发明的各个实施方案和各方面，但是本领域技术人员显然了解这些实施方案和各个方面只是举例说明本发明。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。应理解本文所述的本发明的实施方案的各种替代选择可用于本发明的实施中。
[0097]
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0098]
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均
可容易地从商业公司获取。
[0099]
常规质粒构建所涉及的pcr、酶切、连接等实验，以及蛋白质表达所涉及的转化、细菌培养等实验为本领域研究人员所熟悉，所以具体相关实验细节没有详细注明，具体可参照分子克隆实验指南[j.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第三版)[m]，科学出版社，2002]所述常规实验条件。
[0100]
除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0101]
实施例
[0102]
实施例1：酸性标签设计
[0103]
基于葡萄球菌蛋白a的b结构域所示的氨基酸序列，如seq id no：4所示；利用计算机辅助计算设计出酸性表面助溶短肽标签(sacid，seq id no：1)(网址：https://www.expasy.org/resources/swiss-model)，引入带负电荷的氨基酸，让带负电的氨基酸集中在表面。此标签仅为预测酸性标签的一种表现形式。
[0104]
swiss-model是一款预测蛋白质结构模型的工具，它利用同源建模的方法实现对一段未知序列的三级结构的预测。
[0105]
实施例2：构建目的蛋白表达载体
[0106]
将目的蛋白编码基因序列与酸性表面助溶短肽标签(sacid)编码基因序列融合后获得目的蛋白表达单元(其中sacid氨基酸序列位于目的蛋白氨基酸序列上游)，并将所述目的蛋白表达单元插入表达质粒pet-28a(novagen，usa)上，人工合成获得目的蛋白表达载体pet-28a/sacid-nsii。
[0107]
实施例3：单独表达nsii蛋白
[0108]
将nsii核苷酸序列(编码氨基酸序列seq id no：5)插入到原核表达载体pet28a，得到表达载体pet28a/nsii，通过测序验证载体构建正确后，将质粒按照碱裂解法抽提并转化表达宿主菌rosetta(de3)(天根生化科技(北京)有限公司)。将含有重组质粒pet28a/nsii的表达宿主菌单菌落接种于卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb液体培养中，37℃，220rpm培养16小时，作为种子菌。
[0109]
取种子菌按1:50体积比接种于无菌的卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb培养基中，37℃，200rpm振荡培养至合适对数生长期(od600＝0.6-0.8)，加入0.5mm iptg，27℃诱导表达4h-16h，收集菌液并离心，将菌体沉淀按照10％-20％浓度重悬到20mm tris-hcl、300mm nacl ph 8.0的缓冲液中，超声破碎细胞。裂解菌液8000rpm离心30min，分离上清和沉淀，进行sds-page鉴定目的蛋白的表达情况。
[0110]
结果如图5的a图所示，nsii目的蛋白单独表达，其分子量约50kda，从sds-page难以看到箭头所指位置的明显目的条带，其表达量不高，蛋白明显减少甚至完全损失且纯化后杂蛋白较多。
[0111]
实施例4：利用neongreen作为助溶肽与nsii融合表达
[0112]
(1)neongreen与nsii融合表达载体和宿主菌的构建
[0113]
本实验中采用neongreen的氨基酸序列如seq id no：6所示。
[0114]
将neongreen和nsii(seq id no：5)及原核表达载体pet28a的基因通过人工合成
连接到一起(其中neongreen氨基酸序列位于nsii蛋白氨基酸序列上游)，获得目的蛋白表达载体pet-28a/neongreen-nsii。
[0115]
(2)重组neongreen-nsii蛋白的表达与纯化
[0116]
将重组质粒pet-28a/neongreen-nsii转化表达宿主菌rosetta(de3)，挑取表达宿主菌单菌落接种于卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb液体培养中，37℃、220rpm培养12小时，作为种子菌。
[0117]
取种子菌按1:50体积比接种于无菌的卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至合适对数生长期(od600＝0.6-0.8)，添加iptg诱导剂，将温度调到27℃培养4-16小时。将200ml诱导后的菌液进行离心收菌，用30ml 20mm tris hcl、300mm nacl(ph8.0)重悬菌体，然后超声破碎。将裂解菌液8000rpm离心30min，分离上清和沉淀，上清用0.45um滤器过滤去除不溶性的菌体蛋白，并将沉淀用去离子水或pbs重悬，对表达产物进行sds-page分析。
[0118]
(3)结果分析
[0119]
如图5的b图所示，采用neongreen作为助溶肽，neongreen-nsii融合蛋白的表达情况，分子量约70kd，箭头指向融合蛋白，从图可知，采用neongreen作为助溶蛋白融合表达的方式，虽然也能够实现融合蛋白的纯化和富集，但由于自身分子量较大，仍然存在折叠时间较长，助溶效果有限和易干扰重组蛋白活性等缺陷，从图中可看出大部分蛋白以不溶性包涵体存在且融合蛋白易降解。
[0120]
实施例5：已发表的正电荷助溶标签(zbasic)与nsii融合表达
[0121]
(1)已发表的正电荷助溶标签(zbasic)与nsii融合表达载体和宿主菌的构建
[0122]
已发表的正电荷助溶标签zbasic[hedhammar m,hober s，z(basic)
‑‑
a novel purification tag for efficient protein recovery，journal of chromatography a,2007,1161(1-2):22-28]的氨基酸序列如seq id no：7所示。如实施例4所示方法，将zbasic编码序列与nsii编码序列连接获得融合蛋白表达载体pet-28a/zbasic-nsii，其中zbasic氨基酸序列位于nsii氨基酸序列上游。
[0123]
(2)已发表的正电荷助溶标签(zbasic)与nsii重组蛋白的表达与纯化
[0124]
将质粒转化表达宿主菌rosetta(de3)，得到目的工程菌株。具体实施例均采用实验室小规模摇瓶表达。在37℃条件下含卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb液体培养基中振荡活化16h，之后将过夜培养物按1:50比例转到新的含有卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb培养基(约200ml)中，37℃振荡培养至合适对数生长期(od600＝0.6-0.8)，27℃，0.5mm iptg诱导表达4h-16h。
[0125]
取诱导菌液1ml，8000rpm于4℃离心2min后弃上清，收集菌体，用200μl体积的pbs重悬后直接加入50μl体积的5
×
sds上样缓冲液(300mm tris-hcl(ph 6.8)、20％β-巯基乙醇、20％sds、25％甘油、0.05％溴酚蓝)，沸水浴10min，-20℃保存。
[0126]
取诱导样品200ml，8000rpm于4℃离心20min后弃上清，收集菌体，用30ml体积的tris hcl缓冲液重悬，加入1％triton x-100，1
×
cokitail蛋白酶抑制剂和1mm pmsf后混匀，超声破碎30min。全菌裂解样品12000rpm于4℃离心20min，上清、沉淀分离。取40μl体积的上清，加入10μl体积的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存。将沉淀用1ml体积的pbs重悬后取其中40μl加入10μl体积5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存。
[0127]
将破碎上清用亲和层析柱获得纯化的融合蛋白，取40ul洗脱液，加入10μl体积的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存，通过strep tag ii亲和层析柱纯化得到目的蛋白，取40ul洗脱液，加入10μl体积的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存，作为目的蛋白样品。上述各种样品在电泳检测中的稀释度相同，其蛋白含量具有直接可比性。
[0128]
(3)蛋白电泳(sds-page)
[0129]
sds-page凝胶按常规方法配制。对已制备好的蛋白样品等体积上样，进行10％ sds-page检测。先恒压80v电泳30min，再恒压125v。电泳结束后进行考马斯亮蓝r-250染色，经脱色后得电泳结果。
[0130]
(4)结果分析
[0131]
图5的c图为采用已发表的正电荷助溶标签(zbasic)表达的nsii蛋白，分子量约45kda，箭头指示位置为目的蛋白条带。从图5的d图可知，已发表的正电荷助溶标签(zbasic)与sacid相比，蛋白的表达量相对较差。
[0132]
实施例6：sacid与目的蛋白nsii融合表达
[0133]
(1)sacid与nsii融合表达载体和宿主菌的构建
[0134]
将sacid(seq id no：1)和nsii(seq id no：5)及原核表达载体pet28a的基因通过人工合成连接到一起，得到表达融合蛋白的重组表达质粒pet-28a/sacid-nsii，其中sacid氨基酸序列位于nsii蛋白氨基酸序列上游。
[0135]
(2)重组sacid-nsii的表达与纯化
[0136]
将质粒转化表达宿主菌rosetta(de3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到目的工程菌株。具体实施例均采用实验室小规模摇瓶表达。在37℃条件下含卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb液体培养基中振荡活化16h，之后将过夜培养物按1:50比例转到新的含有卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb培养基(约200ml)中，37℃振荡培养至合适对数生长期(od600＝0.6-0.8)，27℃，0.5mm iptg诱导表达4h-16h。
[0137]
取诱导菌液1ml，8000rpm于4℃离心2min后弃上清，收集菌体，用200μl体积的pbs重悬后直接加入50μl体积的5
×
sds上样缓冲液(300mm tris-hcl(ph 6.8)、20％β-巯基乙醇、20％sds、25％甘油、0.05％溴酚蓝)，沸水浴10min，-20℃保存。
[0138]
取诱导样品200ml，8000rpm于4℃离心20min后弃上清，收集菌体，用30ml体积的tris hcl缓冲液重悬，加入1％triton x-100，1
×
cokitail蛋白酶抑制剂和1mm pmsf后混匀，超声破碎30min。全菌裂解样品12000rpm于4℃离心20min，上清、沉淀分离。取40μl体积的上清，加入10μl体积的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存。将沉淀用lml体积的pbs重悬后取其中40μl加入10μl体积5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存。
[0139]
将破碎上清用亲和层析柱获得纯化的融合蛋白，取40ul洗脱液，加入10μl体积的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存，通过strep tag ii亲和层析柱纯化得到目的蛋白，取40ul洗脱液，加入10μl体积的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存，作为目的蛋白样品。上述各种样品在电泳检测中的稀释度相同，其蛋白含量具有直接可比性。
[0140]
(3)蛋白电泳(sds-page)
[0141]
sds-page凝胶按常规方法配制。对已制备好的蛋白样品等体积上样，进行10％ sds-page检测。先恒压80v电泳30min，再恒压125v。电泳结束后进行考马斯亮蓝r-250染色，经脱色后得电泳结果。
[0142]
(4)结果分析
[0143]
图5d为采用本发明方法融合表达sacid-nsii，分子量约45kda，箭头指示位置在纯化后样品中有明显的目的蛋白条带，从图中看出采用本发明融合表达后目的蛋白表达量得到了大幅度提高；与其他标签相比，本发明sacid标签明显提高了融合蛋白的可溶性。
[0144]
实施例7：利用neongreen作为助溶肽与tevp融合表达
[0145]
(1)neongreen与tevp融合表达载体和宿主菌的构建
[0146]
本实验中采用neongreen的氨基酸序列如seq id no：6所示。
[0147]
将neongreen和tevp(seq id no：8)及原核表达载体pet28a的基因通过人工合成连接到一起(其中neongreen氨基酸序列位于tevp蛋白氨基酸序列上游)，获得目的蛋白表达载体pet-28a/neongreen-tevp。
[0148]
(2)重组neongreen-tevp蛋白的表达与纯化
[0149]
将重组质粒pet-28a/neongreen-tevp转化表达宿主菌rosetta(de3)，挑取表达宿主菌单菌落接种于卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb液体培养中，37℃、220rpm培养12小时，作为种子菌。
[0150]
取种子菌按1:50体积比接种于无菌的卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至合适对数生长期(od600＝0.6-0.8)，添加iptg诱导剂，将温度调到27℃培养4-16小时。将200ml诱导后的菌液进行离心收菌，用30ml 20mm tris hcl、300mm nacl(ph8.0)重悬菌体，然后超声破碎。将裂解菌液8000rpm离心30min，分离上清和沉淀，上清用0.45um滤器过滤去除不溶性的菌体蛋白，并将沉淀用去离子水或pbs重悬，对表达产物进行sds-page及western印迹分析。
[0151]
(3)结果分析
[0152]
如图6的a图所示，采用neongreen作为助溶肽，neongreen-tevp融合蛋白破碎上清的表达情况，nt分子量约为70kd，箭头指向融合蛋白，从图a的sds page尚不能明显区分目的条带，为了更好的观察两者的条带，将蛋白进行western印迹，结果如图6b的nt所示，从western印迹的结果中可知，neongreen-tevp融合蛋白未表达。
[0153]
实施例8：sacid与目的蛋白tevp融合表达
[0154]
(1)sacid与tevp融合表达载体和宿主菌的构建
[0155]
将sacid(seq id no：1)和tevp(seq id no：8)及原核表达载体pet28a的基因通过人工合成连接到一起(其中sacid氨基酸序列位于tevp蛋白氨基酸序列上游)，得到重组表达质粒pet-28a/sacid-tevp。
[0156]
(2)重组sacid-tevp的表达与纯化
[0157]
将质粒转化表达宿主菌rosetta(de3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到目的工程菌株。具体实施例均采用实验室小规模摇瓶表达。在37℃条件下含卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb液体培养基中振荡活化16h，之后将过夜培养物按1:50比例转到新的含有卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb培养基(约200ml)中，37℃振荡培养至合适对数生长期(od600＝0.6-0.8)，27℃，0.5mm iptg诱导表达4h-16h。
[0158]
取诱导菌液1ml，8000rpm于4℃离心2min后弃上清，收集菌体，用200μl体积的pbs重悬后直接加入50μl体积的5
×
sds上样缓冲液(300mm tris-hcl(ph 6.8)、20％β-巯基乙醇、20％sds、25％甘油、0.05％溴酚蓝)，沸水浴10min，-20℃保存。
[0159]
取诱导样品200ml，8000rpm于4℃离心20min后弃上清，收集菌体，用30ml体积的tris hcl缓冲液重悬，加入1％triton x-100，1
×
cokitail蛋白酶抑制剂和1mm pmsf后混匀，超声破碎30min。全菌裂解样品12000rpm于4℃离心20min，上清、沉淀分离。取40μl体积的上清，加入10μl体积的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存。将沉淀用1ml体积的pbs重悬后取其中40μl加入10μl体积5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存。
[0160]
将破碎上清用亲和层析柱获得纯化的融合蛋白，取40ul洗脱液，加入10μl体积的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存，通过strep tag ii亲和层析柱纯化得到目的蛋白，取40ul洗脱液，加入10μl体积的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴10min，-20℃保存，作为目的蛋白样品。上述各种样品在电泳检测中的稀释度相同，其蛋白含量具有直接可比性。
[0161]
(3)蛋白电泳(sds-page)及western印迹
[0162]
sds-page凝胶按常规方法配制。对已制备好的蛋白样品等体积上样，进行10％ sds-page检测。先恒压80v电泳30min，再恒压125v。电泳结束后进行考马斯亮蓝r-250染色，经脱色后得电泳结果。
[0163]
将胶上的蛋白湿转到pvdf膜，用5％脱脂奶粉封闭2h，一抗4℃孵育过夜，与hrp标记的二抗孵育室温孵育1h，利用化学发光试剂盒和gelview 6000plus设备进行曝光。目的条带如图6b的st所示。
[0164]
(4)结果分析
[0165]
图6a和b图的泳道st为采用本发明方法融合表达sacid-tevp，分子量约39kda，箭头指示位置在破碎上清样品中有明显的目的蛋白条带且western印迹结果与其一致。
[0166]
从图6可以看出采用本发明融合表达后目的蛋白表达量得到了大幅度提高；与其他标签相比，本发明sacid标签明显提高了融合蛋白的可溶性。
[0167]
实施例9：纯化蛋白活性测试
[0168]
将得到的蛋白洗脱液进行超滤置换缓冲液，将蛋白保存在tris hcl缓冲液中(20mm tris hcl，20mm nacl，50％甘油)，通过酶切质粒验证蛋白活性。
[0169]
使用含单个nsii酶切位点和单个hindiii酶切位点的质粒做底物，进行双酶切反应，对提纯的nsii酶进行梯度(101～108倍)稀释后进行双酶切反应，每个稀释度作为一个样品，37℃，酶切1小时，进行琼脂糖凝胶电泳。酶及质粒用量均相同，具有可比性。
[0170]
表1双酶切反应体系
[0171][0172]
结果如图7所示，使用含单个nsii酶切位点和单个hindiii酶切位点的质粒做底物，进行双酶切反应后，得到3392bp和1987bp的目标条带。a图为单独表达的nsii蛋白和neongreen-nsii蛋白的双酶切鉴定；b图为已发表的正电荷助溶标签(zbasic)表达的nsii蛋白和本发明sacid-nsii蛋白的双酶切鉴定。从图中可以看出，单独表达的nsii蛋白几乎
val-ser-thr-arg-asp-gly-phe-ile-val-gly-ile-his-ser-ala-ser-asn-phe-thr-asn-thr-asn-asn-tyr-phe-thr-ser-val-pro-lys-asn-phe-met-glu-leu-leu-thr-asn-gln-glu-ala-gln-gln-trp-val-ser-gly-trp-arg-leu-asn-ala-asp-ser-val-leu-trp-gly-gly-his-lys-val-phe-met-val-lys-pro-glu-glu-pro-phe-gln-pro-val-lys-glu-ala-thr-gln-leu-met-asn-glu-gly。

技术特征：
1.一种分离的肽，其包含氨基酸序列vdnkfnkeqqx1afyeilhlpnlne eqrnafiqx2lkddpx3x4sx5x6x7lx8eax9x
10
lndaqpk(seq id no：9)其中：x
1-x
10
均是带负电荷氨基酸，优选为e或d，优选地，所述肽的等电点pi等于或小于5.0。2.权利要求1的肽，其包含seq id no：1所示的氨基酸序列或由seq idno：1所示的氨基酸序列组成。3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1或2的肽。4.一种分离的融合蛋白，其包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽是权利要求1或2的肽，所述第二肽是目的多肽，任选所述第二肽通过间隔物连接于所述第一肽。5.权利要求4的融合蛋白，其中：所述间隔物包含切割位点，优选选自化学切割位点、酶法切割位点和自切割位点，和/或，所述融合蛋白还包含与所述第二肽连接的用于分离纯化的部分，例如6组氨酸标签、gst标签、strep标签、twin-strep标签或mbp标签，和/或，所述第二肽具有低于、等于或略大于7.0例如等于或低于8.0、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5或4.0的酸性或中性或弱碱性等电点，更优选所述第二肽的长度为20-500个氨基酸残基，例如包含seq id no：5所示氨基酸序列的nsii蛋白或包含seq id no：8所示氨基酸序列的tevp蛋白。6.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求4或5的融合蛋白的核苷酸序列。7.一种构建体、优选表达构建体，其包含权利要求6的多核苷酸。8.一种宿主细胞，其包含权利要求6的多核苷酸或权利要求7的构建体优选表达构建体，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白，优选地，所述宿主细胞选自原核生物、酵母和真核细胞例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，更优选选自埃希氏菌属(escherichia)、芽孢杆菌属(bacillus)、沙门氏菌属(salmonella)、假单胞菌属(pseudomonas)和链霉菌属(streptomyces)，更优选选自埃希氏菌属，更优选是大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽抱杆菌(bacillus subtilis)或巨大芽抱杆菌(bacillus megaterium)，更优选大肠杆菌rosetta(de3)。9.一种生产权利要求4或5的融合蛋白的方法，包括：(a)在适合融合蛋白表达的条件下培养权利要求8的宿主细胞；和(b)回收融合蛋白，任选地，(c)切割融合蛋白，释放目的多肽；和(d)回收所述目的多肽，优选地，所述目的多肽具有低于、等于或略大于7.0例如等于或低于8.0、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5或4.0的酸性或中性或弱碱性等电点，更优选是包含seq id no：5所示氨基酸序列的nsii蛋白或包含seq id no：8所示氨基酸序列的tevp蛋白。10.一种生产目的多肽的方法，包括：(a)在宿主细胞中表达目的多肽与权利要求1或2的肽融合形成的融合蛋白，优选权利要求1或2的肽位于目的多肽的上游；(b)回收并切割融合蛋白，释放目的多肽；和
(c)任选地，分离纯化所述目的多肽，优选地，所述目的多肽具有低于、等于或略大于7.0例如等于或低于8.0、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5或4.0的酸性或中性或弱碱性等电点，更优选所述目的多肽的长度为20-500个氨基酸残基，更优选是包含seq id no：5所示氨基酸序列的nsii蛋白或包含seq id no：8所示氨基酸序列的tevp蛋白。11.权利要求10的方法，其中：所述目的多肽通过间隔物连接于所述权利要求1或2的肽，优选所述间隔物包含切割位点，优选选自化学切割位点、酶法切割位点和自切割位点，和/或所述融合蛋白还包含与所述目的多肽连接的用于分离纯化的部分，例如6组氨酸标签、gst标签、strep标签、twin-strep标签或mbp标签。12.权利要求9-11任一项的方法，其中所述宿主细胞选自原核生物、酵母和真核细胞例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，更优选选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和链霉菌属，更优选选自埃希氏菌属，更优选是大肠杆菌、枯草芽抱杆菌或巨大芽抱杆菌，更优选大肠杆菌rosetta(de3)。13.权利要求1或2的肽或权利要求3的多核苷酸用于在宿主细胞中制备目的蛋白的用途，其中所述宿主细胞优选选自原核生物、酵母和真核细胞例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，更优选选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和链霉菌属，更优选选自埃希氏菌属，更优选是大肠杆菌、枯草芽抱杆菌或巨大芽抱杆菌，更优选大肠杆菌rosetta(de3)，优选地，所述目的蛋白具有低于、等于或略大于7.0例如等于或低于8.0、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5或4.0的酸性或中性或弱碱性等电点，更优选所述目的蛋白的长度为20-500个氨基酸残基，更优选是包含seq id no：5所示氨基酸序列的nsii蛋白或包含seq id no：8所示氨基酸序列的tevp蛋白。

技术总结
本发明为一种提高重组蛋白表达效率的酸性表面助溶短肽标签，涉及一种分离的肽，其包含氨基酸序列VDNKFNKEQQX1AFYEILH LPNLNEEQRNAFIQX2LKDDPX3X4SX5X6X7LX8EAX9X


技术研发人员：赵晟 李鹏 孙秀莲 仲明 王志民
受保护的技术使用者：济南宜明医疗科技有限公司
技术研发日：2022.12.08
技术公布日：2023/8/1