一种液相色谱法检测甲钴胺注射液中有关物质的方法与流程

1.本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种液相色谱法检测甲钴胺注射液中有关物质的方法。


背景技术：

2.甲钴胺注射液，适应症为用于周围神经病和因缺乏维生素b
12
引起的巨红细胞性贫血的治疗，其主要成分为甲钴胺，其药理作用如下：
①
甲钴胺是一种内源性的辅酶b
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，在由同型半胱氨酸合成蛋氨酸的转甲基反应过程中，作为蛋氨酸合成酶的辅酶，起重要作用。
②
甲钴胺通过转移至神经细胞的细胞器促进核酸和蛋白质的合成。
③
甲钴胺可促进轴索内的输送和轴索再生。
④
甲钴胺可促进髓鞘形成。
⑤
甲钴胺可恢复神经键的传达，包括传达延迟和神经传达物质的减少。
⑥
甲钴胺促进正红血母细胞的成熟和分裂，进而改善贫血血像。
3.我国于1998年进口甲钴胺片剂及针剂，商品名分别为弥可保糖衣片和弥可保注射液。
4.甲钴胺注射液在生产以及放置的过程中，会产生降解杂质，而影响产品的质量，这个杂质即药物质量控制中的有关物质，对于甲钴胺控制的杂质主要为光降解杂质羟钴胺。
5.甲钴胺的结构式：
[0006][0007]
羟钴胺的结构式：
[0008][0009]
对于降解杂质，在成品中需要进行质量控制的，甲钴胺注射液目前在bp、jp及usp药典均未收载，只有chp收载，但是采用chp2020标准有关物质方法，羟钴胺出峰位置比较靠
前，且在两溶剂峰之间，主峰与相邻杂质分离较差，羟钴胺相对保留时间约为0.17-0.20，不满足药典要求(0.25)。


技术实现要素：

[0010]
本发明的目的在于提供一种液相色谱法检测甲钴胺注射液中有关物质的方法，实现甲钴胺与其有关物质的分离与测定，实现其质量控制。
[0011]
所述的液相色谱法检测甲钴胺注射液中有关物质的方法为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为300-350nm；柱温为25-40℃；流速为0.5-3ml/min；进样量为5-20μl；
[0012]
流动相a：用0.2mol/l氢氧化钠溶液或磷酸调节ph值至4.5的0.03mol/l磷酸二氢钾溶液；流动相b：乙腈；用梯度流动相洗脱，以流动相体积比为100％计，流动相的梯度设置如下：
[0013][0014]
甲钴胺注射液为供试品溶液，用水配制对照品溶液，然后分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0015]
本发明的液相色谱法检测甲钴胺注射液中有关物质的方法专属性强、分离度好、灵敏度高、精密度及准确度高、耐用性良好，对于甲钴胺注射液的质量控制具有重要的现实意义。
附图说明
[0016]
图1为羟钴胺的线性关系图。
[0017]
图2为甲钴胺的线性关系图。
[0018]
图3为供试品溶液(甲钴胺注射液)色谱图。
具体实施方式
[0019]
以下将通过实施例形式，对本发明的甲钴胺注射液质量控制方法作详细说明，但不应将此理解为本发明的权利要求范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0020]
(1)专属性与系统适用性：
[0021]
溶液配制：
[0022][0023]
结果：
[0024]
专属性及系统适用性结果-1
[0025][0026]
专属性及系统适用性结果-2
[0027]
检测结果123456平均值rsd(％)保留时间(分钟)18.19018.07818.05218.03818.01317.93218.0500.47峰面积31.58731.61231.37631.28831.62731.46831.4930.45
[0028]
结论：
[0029]
①
空白溶液和空白辅料溶液对有关物质的检测无干扰；
[0030]
②
系统适用性溶液中，甲钴胺峰与相对保留时间约为1.13杂质峰之间的分离度为4.80(＞3.0)；
[0031]
③
对照溶液连续测定6次，主成分峰面积的rsd为0.45％，保留时间的rsd为0.47％。该方法专属性和系统适用性良好。
[0032]
(2)破坏实验：
[0033]
溶液配制：
[0034][0035][0036]
结果：
[0037]
破坏实验物料平衡及峰纯度结果
[0038][0039]
结论：
[0040]
1.空白溶液及空白辅料溶液对样品检测无干扰；
[0041]
2.在各破坏条件下，主成分峰的峰纯度因子均为1000(》980)，物料平衡均在91.1％～103.2％(90％～110％)范围内；该方法专属性较强。
[0042]
(3)检测限
[0043]
取杂质对照品和甲钴胺对照品适量，根据定位试验的信噪比，逐步稀释，直至信噪比(s/n)约为3～10对应的浓度为检测限。结果见下表。
[0044]
检测限-羟钴胺结果
[0045][0046][0047]
检测限-甲钴胺结果
[0048][0049]
结论：该方法灵敏度较高。
[0050]
(4)定量限
[0051]
取杂质对照品和甲钴胺对照品适量，根据定位试验的信噪比，逐步稀释，直至信噪比(s/n)约为10～30对应的浓度为定量限。结果见下表。
[0052]
定量限-羟钴胺结果
[0053][0054]
定量限-甲钴胺结果
[0055][0056]
结论：该方法灵敏度较高。
[0057]
(5)线性和范围
[0058]
溶液配制：
[0059][0060]
结果：
[0061]
羟钴胺线性关系
[0062][0063]
甲钴胺线性关系
[0064][0065]
结论：该方法下甲钴胺和羟钴胺线性关系良好。
[0066]
(6)准确度
[0067]
溶液配制：
[0068][0069][0070]
结果：
[0071]
准确度结果
[0072][0073]
结论：
[0074]
羟钴胺的平均回收率(n＝9)为99％；rsd为2.7％，该方法准确度较高。
[0075]
(7)重复性和中间精密度
[0076]
溶液配制：
[0077][0078][0079]
结果：
[0080]
重复性：6份供试品溶液中杂质含量在0.05％～0.1％范围内rsd最大为11％；杂质含量在0.1％以上的rsd最大为4.9％；中间精密度：6份供试品溶液中杂质含量在0.05％～0.1％范围内的rsd最大为6.2％；杂质含量在0.1％以上的rsd最大为3.8％；12份供试品溶液中，杂质含量在0.05％～0.1％范围内的rsd为8.9％；杂质含量在0.1％以上的rsd最大为7.3％。
[0081]
结论：该方法精密度良好。
[0082]
(8)耐用性
[0083]
耐用性微调色谱条件
[0084][0085]
结果：
[0086]
耐用性分离度结果及羟钴胺相对保留时间结果(系统适用性溶液)
[0087][0088][0089]
耐用性灵敏度结果(灵敏度溶液)
[0090][0091]
耐用性试验结果(供试品溶液)
[0092][0093][0094]
结论：
[0095]
①
微调色谱柱条件后，空白溶液、空白辅料溶液对本品有关物质的检测无干扰；
[0096]
②
系统适用性溶液中，羟钴胺相对保留时间在0.28～0.30之间，主峰与相对保留时间约为1.13杂质峰之间的分离度在4.71～5.24之间；
[0097]
③
灵敏度溶液中，主成分峰高的信噪比在13.2～27.0之间；
[0098]
④
供试品溶液中，微调色谱条件后与标准条件下相比，当0.05％≤x《0.10％，杂质含量绝对差值在0～0.02％之间(《0.05％)；当0.10％≤x《0.50％，杂质含量绝对差值在0～0.05％之间(《0.10％)；无0.50％以上的杂质，故不进行比较。
[0099]
微小改变色谱条件(更换不同批号色谱柱，改变流速
±
0.1ml/min、ph值
±
0.2、柱温
±
2℃)后，该方法耐用性良好。
[0100]
综上所述，本发明所建立的甲钴胺注射液有关物质检测方法灵敏快速、专属性强、灵敏度高、结果准确可靠，可作为甲钴胺注射液的有关物质检查方法。
[0101]
由图3供试品溶液的图谱可知，
①
空白溶液及空白辅料溶液均不干扰本品有关物质的检测；
②
供试品溶液色谱图中，主峰与相邻杂质间最小分离度为4.95，羟钴胺(相对保留时间为0.30)与相邻杂质间的最小分离度为19.76，各杂质均可有效检出，分离情况良好。

技术特征：
1.一种液相色谱法检测甲钴胺注射液中有关物质的方法，其特征在于，所述方法的色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为300-350nm；柱温为25-40℃；流速为0.5-3ml/min；进样量为5-20μl；流动相a：用0.2mol/l氢氧化钠溶液或磷酸调节ph值至4.5的0.03mol/l磷酸二氢钾溶液；流动相b：乙腈；用梯度流动相洗脱，以流动相体积比为100％计，流动相的梯度设置如下：2.根据权利要求1所述的液相色谱法检测甲钴胺注射液中有关物质的方法，其特征在于，甲钴胺注射液为供试品溶液，用水配制对照品溶液，然后分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

技术总结
本发明公开了一种液相色谱法检测甲钴胺注射液中有关物质的方法。该方法的色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为300-350nm；柱温为25-40℃；流速为0.5-3mL/min；进样量为5-20μl；流动相A：用0.2mol/L氢氧化钠溶液或磷酸调节pH值至4.5的0.03mol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B：乙腈；用梯度流动相洗脱。甲钴胺注射液为供试品溶液，用水配制对照品溶液，然后分别注入液相色谱仪，记录色谱图。本发明的液相色谱法检测甲钴胺注射液中有关物质的方法专属性强、分离度好、灵敏度高、精密度及准确度高、耐用性良好，对于甲钴胺注射液的质量控制具有重要的现实意义。钴胺注射液的质量控制具有重要的现实意义。钴胺注射液的质量控制具有重要的现实意义。


技术研发人员：王玉节
受保护的技术使用者：辰欣药业股份有限公司
技术研发日：2022.12.31
技术公布日：2023/8/1