一种水稻抗白叶枯病负调控蛋白ERB1及其编码基因与应用

一种水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1及其编码基因与应用。


背景技术：

2.由革兰氏阴性菌黄单孢菌稻致病变种(xanthomonas oryzaepv.oryza,xoo)引起的稻白叶枯病是水稻生产中危害最严重、范围最广泛的细菌性病害。白叶枯病的主要特征是突发性强和传播侵染的速度非常快，世界各地水稻产区均有发生，常年可导致减产20％-50％，严重时绝产。培育和种植抗病品种是防治白叶枯病最经济、最有效和最环保的措施。
3.目前经国际注册确认和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因已延续到47个，其中30个为显性基因，17个为隐性基因。然而，已经成功分离克隆到的抗白叶枯病基因仅有17个，其中仅有4个是隐性基因：xa5、xa13、xa25和xa41(t)，其余12个为显性基因：xa1及其等位基因xa2/xa31(t)、xa14、xa45(t)，xa3/xa26，xa4，xa7，xa10，xa21，xa23，xa27和xa47。这些抗病基因大多数抗谱比较狭窄表现出专一抗性，或抗性不足表现出抗性不强，或由隐性基因控制不利于育种等，种种原因导致在实际育种生产过程中利用的有效抗病基因并不多。
4.因此不断发掘和寻找新的抗白叶枯病基因是持续控制水稻白叶枯病的有效手段。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻抗白叶枯病有关的负调控蛋白erb1及其编码基因与应用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.本发明提供一种水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1，如(a)或(b)所示的序列：(a)seq id no：3所示的氨基酸序列；(b)在(a)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。
8.seq id no：3的序列如下：
9.[0010][0011]
本发明提供一种编码上述蛋白的基因。
[0012]
进一步地，编码所述水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1的基因组基因如(a)或(b)所示的序列：(a)seq id no：1所示的核苷酸序列；(b)在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有相同功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。
[0013]
seq id no：1的序列如下：
[0014]
[0015]
[0016]
[0017][0018]
进一步地，编码所述水稻免疫负调控蛋白erb1的cdna基因如(a)或(b)所示的序列：(a)seq id no：2所示的核苷酸序列；(b)在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有相同功能的蛋白质的cdna。
[0019]
seq id no：2的序列如下：
[0020]
[0021][0022]
本发明相应提供上述蛋白、基因可应用在水稻抗白叶枯病分子改良中。
[0023]
本发明要解决的另外一个技术问题在于提供一种提高水稻抗白叶枯病的负调控蛋白erb1的突变蛋白、其编码基因、表达载体、转化体及应用。
[0024]
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:
[0025]
本发明提供一种水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1的突变蛋白，如seq id no：4所示的氨基酸序列。
[0026]
seq id no：4的序列如下：
[0027][0028]
本发明提供一种编码上述蛋白的基因，以及含有上述基因的表达载体或转化体。
[0029]
本发明相应提供上述蛋白、基因或表达载体、转化体在提高水稻抗白叶枯病中的应用。
[0030]
本发明通过ems诱变获得水稻抗白叶枯病突变体erb1，在分蘖期利用31种白叶枯病菌小种进行多菌系鉴定抗性水平，之后构建定位分离群体，通过图位克隆控制水稻抗白叶枯病的基因，然后通过基因互补和基因编辑技术验证基因的功能，最终成功分离一个水稻抗白叶枯病负调控基因：erb1。实验结果表明：在通过ems诱变获得的erb1功能缺失突变体中，相较于野生型，其对水稻细菌性病害白叶枯病抗性均有极显著提高，能有效应用于水稻抗病性分子改良工作，具有很大开发应用前景。
[0031]
由此，本发明提供一种提高水稻对水稻细菌性病害白叶枯病抗性的方法，其通过基因工程手段将水稻内的水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1编码基因进行敲除、失活或降低其表达，或降低其活性，以得到对水稻细菌性病害白叶枯病抗性提高的基因重组水稻植株，所述水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1的氨基酸序列如seq id no：3所示。具体地，所述基因工程手段是基因编辑，具体是crispr/cas9编辑方法。
[0032]
相应的，本发明也提供上述相应的对水稻细菌性病害白叶枯病抗性提高的水稻品种的方法。
[0033]
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0034]
本发明公开了水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1的氨基酸序列，以及其编码基因的序列和编码区序列，并通过基因互补和基因编辑技术验证了基因的功能。实验结果证明，erb1的互补转基因植株对白叶枯病的抗性显著降低，erb1基因的敲除转基因植株对白叶枯病的抗性显著提高。本发明提供的水稻erb1基因有负调控水稻的抗病性的功能，可以用于改良水稻对白叶枯病的抗性，对于培育抗白叶枯病水稻新品种具有重要意义。
附图说明
[0035]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0036]
图1是野生型金刚30(jg30)和突变体erb1的多菌系接种鉴定。其中，a：分蘖期接种白叶枯菌的叶片病斑表型对比图；b：接种白叶枯菌的叶片病斑长度对比图。
[0037]
图2是erb1的定位图。其中，a：erb1基因的初定位；b：erb1基因的精细定位；c：erb1基因的结构示意图；d：erb1基因的突变位点测序结果示意图；e：jg30和erb1在基因erb1缺失处的电泳谱带图；f：jg30和erb1编码的氨基酸长度示意图。
[0038]
图3是转基因互补材料t1代白叶枯病接种表型对比图。其中，a：接种白叶枯菌pxo99的叶片病斑表型对比图；b：接种白叶枯菌pxo99的叶片病斑长度对比图。
[0039]
图4是crispr/cas9基因编辑转基因材料t1代白叶枯病接种表型对比图。其中，a：crispr/cas9敲除的靶点和erb1基因敲除株系ko的编辑类型；b：接种白叶枯菌pxo99的叶片病斑表型对比图；c：接种白叶枯菌pxo99的叶片病斑长度对比图。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0041]
为了更充分的解释本发明的实施，下面提供了水稻抗白叶枯病负调控基因erb1的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042]
实施例1、突变体erb1材料的获得及白叶枯病接种鉴定
[0043]
通过ems(甲基磺酸乙酯)化学诱变籼稻品种金刚30，对诱变群体进行接种白叶枯病pxo99后筛选到一份抗病突变体erb1。该突变体的性状经过多代自交已稳定遗传，在分蘖期利用31种白叶枯病菌小种接种鉴定，发现突变体erb1对所有测试菌株都表现出抗性，其病斑长度与野生型jg30相比显著变短(图1,其中a显示分蘖期接种白叶枯菌的叶片病斑表型对比图；b显示接种白叶枯菌的叶片病斑长度对比图)。
[0044]
实施例2、erb1基因的遗传分析和精细定位
[0045]
将突变体erb1和对白叶枯病表现易感籼稻品种吉粳88(jg88)、jg30进行杂交配组，f1植株对白叶枯病pxo99均表现出感病，说明erb1受隐性核基因控制。统计f2分离群体分离比(表1)，结果表明，抗病植株和感病植株的分离比经过卡方检验接近3:1分离，这表明erb1的抗病表型是由单隐性核基因控制。
[0046]
表1抗白叶枯病突变体erb1的遗传分析
[0047][0048]
利用本实验室保存的均匀分布于水稻12条染色体的indel标记引物对突变体erb1与jg88进行多态性筛选，筛选两亲本间有多态的分子标记共131对。然后随机选取21个jg88/erb1中f2极端抗病单株进行连锁分析，初步确认目标基因所在的染色体位置。基因组dna采用ctab法提取。
[0049]
具体步骤如下：
[0050]
①
称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入600μl的ctab溶液(2％(m/v)ctab，100mmol/l tris-cl，20mmol/l edta，1.4mol/l nacl；ph8.0)配制的dna提取缓冲液，65℃水浴40分钟。再加600μl的氯仿，并混匀。12,000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。
[0051]
②
在上述步骤
①
离心后所得的上清液中加2/3～1倍体积预冷(至-20℃)的异丙醇，轻轻混匀至dna沉淀。12,000rpm离心8分钟，倒出上清液。
[0052]
③
再用70％(体积浓度)的已醇600μl洗涤上述步骤
②
所得的dna沉淀物。
[0053]
④
将上述洗涤后的dna晾干并溶于100μl te缓冲液或纯水中。
[0054]
⑤
紫外分光光度法检测上述步骤
④
所得的dna样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。完整合适的dna用于pcr扩增，不完整的dna则重新提取，直至获得完整的dna。
[0055]
pcr反应体系采用10μl体系：dna模板1μl，10
×
pcr缓冲液1μl，正反向引物(10μmol/l)各0.5μl，dntps 1μl，rtaq酶0.2μl，加ddh2o补足10μl。pcr扩增程序如下：94℃下预变性3min；94℃下变性30s，55℃～60℃下退火30s(温度因引物不同而异)，72℃下延伸30s，40个循环；最后72℃下延伸10min。pcr产物用4％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪拍照并读胶。利用上述筛选的131对多态分子标记引物进行erb1基因连锁分析发现在第3号染色体的标记id3-16处表现出连锁现象，随后在该标记的上下游附件选择标记进行区间确定，结果将目的基因锁定在标记id3-16和id3-19之间(如图2中a)。在此区间再次设计新的多态性分子标记，用567个f2单株最终将该基因定位在id3-75和id3-79这两个分子标记之间(如图2中b)。引物序列见表2。
[0056]
表2精细定位所用分子标记
[0057]
引物名称正向引物(5
′→3′
)反向引物(5
′→3′
)id3-16tccctcccttccttcttccgcgtcgtcgcgtagtacaacaid3-19tcaccgttcagactagcatcttgcagatctccatccagaaagtid3-56atttgatggccttcttccgcccggcatcatggattcgaaaid3-57ccatctaaatccttgtctccgcaatggctccgtcgaaattggid3-59cggctcaacgtttacttgctccaatccgacgtactcccttid3-61cacatcctaaagtgtatgcccatgcatgcatcctctcgtttgid3-64gttgtaaccgctcaagtacgtgagcgctgccaaggattattid3-75tagggtgtgcgtgtgtgtatggaggtgtgctcagaagtg
id3-79acggttgtttccacctgttgactgagggttttagttttggct
[0058]
实施例3、候选基因的确定
[0059]
根据精细定位的128.8kb的区间内，在水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)进行候选基因预测，发现共有16个开放阅读框(orf)。利用pcr的方法，将突变体erb1和野生型jg30中这16个基因所在的基因组序列扩增出来，经测序分析，发现只有一个基因loc_os03g54780出现突变，该基因的第一个外显子出现38个碱基的缺失(如图2中c-e)，导致编码的氨基酸发生了移码突变，并最终造成突变体蛋白翻译的提前终止，野生型jg30编码839个氨基酸，而突变体erb1只有182个氨基酸(如图2中f)。
[0060]
该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表的seq id no：3所示。该基因的gdna全长如seq id no：1所示，cdna全长如seq id no：2所示。
[0061]
水稻抗白叶枯病突变体erb1所编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no：4所述。
[0062]
实施例4、erb1基因互补载体和基因crispr/cas9编辑载体的构建
[0063]
1、erb1基因的互补载体构建
[0064]
为验证erb1能否引起突变体的抗病性丧失，以野生型jg30基因组dna为模板，1300-erb1-cf：gagctcggtacccggggatcccgcacgagctgctcccgatgcaccttct，1300-erb1-cr：caggtcgactctagaggatccggtcgcattcgcacaacttcatcacagg为引物，通过pcr扩增成功获得包含启动子、表达框以及终止子在内的erb1 dna全长序列。随后应用诺唯赞公司的clonexpress ii one step cloning kit试剂盒(货号：c112-01)通过重组将erb1 pcr产物片段连接上经bamhi单酶切线性化后的载体pcambia1300(具体使用参照说明书)。将此重组产物热激转化大肠杆菌top10后涂布于含50mg/l卡那霉素的lb平板上生长16小时，挑选阳性克隆小提质粒送北京生工有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pcambia1300-erb1。
[0065]
2、erb1基因的crispr/cas9编辑载体构建
[0066]
利用crispr/cas9技术构建编辑erb1基因的重组载体，所用靶序列为靶序列1和靶序列2。
[0067]
靶序列1：ccaaggacttcggcggcggagcc(即序列表中seq id no.1的第426-448位)；靶序列2：ccgcgggaatctgcctccggcac(即序列表中seq id no.1的第665-687位)；
[0068]
sgrna表达盒构建，具体操作方法参考ma et al.(2015)的方法(ma x l,zhang q y,zhu q l,et al.a robust crispr/cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[j].mol plant,2015，8(8),274-1284)：
[0069]
以pylsgrna-osu6a载体为模板，使用引物：
[0070]
erb1-grt1：5
’‑
gctccgccgccgaagtcctgttttagagctagaaat-3’，erb1-osu6at1：5
’‑
aggacttcggcggcggagccggcagccaagccagca-3’；
[0071]
将该序列与u6a-grna表达盒相融合构建u6a-sgrna-erb1；
[0072]
以pylsgrna-osu6b载体为模板，使用引物：
[0073]
erb1-grt2：5
’‑
tgccggaggcagattcccggttttagagctagaaat-3’，erb1-osu6bt2：5
’‑
cgggaatctgcctccggcacaacacaagcggcagc-3’；
[0074]
将该序列与u6b-grna表达盒相融合构建u6b-sgrna-erb1；
[0075]
将上述u6a-sgrna-erb1和u6b-sgrna-erb1与pylcrispr/cas9pubih载体进行酶
切-连接反应，得到erb1基因敲除载体pylcrispr/cas9pubi-erb1。
[0076]
酶切-连接反应体系：u6a-sgrna-erb1(10-15ng)，u6b-sgrna-erb1(10-15ng)，pylcrispr/cas9pubi-h载体(60-80ng)，10
×
cutsmart buffer 1.5μl，10mm atp1.5μl，bsai-hf10u，t4 dna ligase 35u，加ddh2o补充至15μl。
[0077]
酶切-连接反应体程序：37℃10min，10℃5min，20℃5min，进行3个循环；37℃3min，10℃5min，20℃5min，进行10个循环。
[0078]
取反应产物转化大肠杆菌top10，筛选阳性克隆，将得到的序列正确的重组载体命名为pylcrispr/cas9pubi-erb1。
[0079]
实施例5、水稻遗传转化
[0080]
分别将实施例2中的pcambia1300-erb1与pylcrispr/cas9pubi-erb1的质粒通过冻融法转入农杆菌菌株eha105中。含有双元质粒载体pcambia1300-erb1的eha105菌株采用农杆菌侵染法侵染突变体erb1的愈伤组织，经潮霉素筛选后，阳性愈伤再依次通过分化、生根获得互补转基因植株：cp；含有编辑载体pylcrispr/cas9pubi-erb1的eha105菌株采用农杆菌侵染法侵染野生型jg30的愈伤组织，经潮霉素筛选后，阳性愈伤再依次通过分化、生根获得敲除转基因植株：ko。
[0081]
实施例6、转基因植株的白叶枯病抗性检测
[0082]
对互补转基因阳性株系t1代和erb1编辑的敲除转基因植株株系t1代ko接种白叶枯病菌pxo99，在接种后14d测量叶片病斑长度。由图3(其中，a展示接种白叶枯菌pxo99的叶片病斑表型对比图；b为接种白叶枯菌pxo99的叶片病斑长度对比图)可以看出，野生型jg30的病斑长度为18.7cm，阳性erb1基因互补转基因植株cp2和cp5株系的病斑长度分别为19cm和19.3cm，均显著长于突变体erb1的病斑长度。由图4可以看出，erb1基因敲除植株ko的病斑长度为5.1cm，显著短于jg30的病斑长度，表明erb1负调控水稻的白叶枯抗性。其中图4中，其中，a显示crispr/cas9敲除的靶点和erb1基因敲除株系ko的编辑类型；b显示接种白叶枯菌pxo99的叶片病斑表型对比图；c显示接种白叶枯菌pxo99的叶片病斑长度对比图。
[0083]
以上结果充分说明erb1为一个抗性相关蛋白，在水稻抗病反应过程中主要起负调控作用。随着crispr基因组定点编辑技术的发展以及其它分子生物学技术手段的日趋成熟，未来该基因将可有效应用于水稻抗性分子改良工作中，具有极大开发利用价值和意义。
[0084]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1在水稻抗病性分子改良中的应用，所述蛋白如seq id no：3所示的氨基酸序列。2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因在水稻抗白叶枯病分子改良中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，编码所述水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1的基因组基因如seq id no：1所示的核苷酸序列。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，编码所述水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1的cdna基因如seq id no：2所示的核苷酸序列。5.一种水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1的突变蛋白，其特征在于，如seq id no：4所示的氨基酸序列。6.一种编码权利要求5所述蛋白的基因。7.含有权利要求6所述基因的表达载体或转化体。8.权利要求5所述蛋白、权利要求6所述基因或权利要求7所述表达载体、转化体在提高水稻抗白叶枯病中的应用。9.一种提高水稻对水稻细菌性病害白叶枯病抗性的方法，其特征在于，通过基因工程手段将水稻内的水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1编码基因进行敲除、失活或降低其表达，或降低其活性，以得到对水稻细菌性病害白叶枯病抗性提高的基因重组水稻植株，所述水稻抗白叶枯病负调控蛋白erb1的氨基酸序列如seq id no：3所示。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述基因工程手段是基因编辑，具体是crispr/cas9编辑方法。

技术总结
本发明属于植物基因工程领域，公开了一种水稻抗白叶枯病负调控蛋白ERB1及其编码基因，和其在水稻抗病性分子改良应用。本发明研究发现在通过EMS诱变获得的ERB1功能缺失突变体中，相较于野生型，其对水稻细菌性病害白叶枯病抗性均有极显著提高，因此所述蛋白能有效应用于水稻抗病性分子改良工作，具有很大开发应用前景。用前景。


技术研发人员：纪志远 王春连 徐江民 赵开军
受保护的技术使用者：中国农业科学院作物科学研究所
技术研发日：2023.01.20
技术公布日：2023/8/1