一条抑制猪病毒性腹泻病毒的多肽及其序列

1.本发明涉及与猪病毒性腹泻病毒nsp5特异性结合的多肽序列及其应用，属于多肽设计、病毒抑制、药物筛选开发领域。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(ped)在20世纪70年代初首次在欧洲发现，1978年在比利时首次分离到该病毒。据报道，pedv已经在许多猪的生产地区爆发，包括中国、美国、加拿大和欧洲，它引起严重的肠道疾病，给全世界的养猪业带来了巨大的经济损失。它编码四个主要的结构蛋白：穗状体(s)、核衣壳(n)、膜(m)和包膜(e)。其中非结构蛋白nsp5被称为3c样蛋白酶(3cpro)，主要参与冠状病毒蛋白的切割，与病毒各个阶段的复制有关并在病毒的生活周期中发挥作用。因此，nsp5是冠状病毒抗病毒药物的重要靶标蛋白。然而，现有的ped疫苗不能对流行的pedv感染提供适当的保护。考虑到这一因素，针对新的pedv菌株或靶向位点的研究对于预防和控制新出现或重新出现的传染病是必要的。
3.猪流行性腹泻病毒(pedv)基因组的三分之二(orf1a和1b)编码一个大的复制酶多聚蛋白，而基因组的其余部分则编码结构蛋白和附属蛋白。pedv病毒进入宿主细胞后，orf1a编码大的多聚蛋白1a(pp1a)，而orf1b通过核糖体变框表达为pp1ab融合蛋白。通过nsp3和nsp5的蛋白酶活性，这些多聚蛋白被蛋白酶加工成16种非结构蛋白(nsp1至16)，介导病毒rna基因组的复制和一组嵌套的亚基因组mrna的合成。pedv nsp5的半胱氨酸蛋白酶活性有助于nemo的蛋白分解，是一种ifn拮抗剂，编码谷氨酰胺231(q231)的3c类蛋白酶，对病毒和宿主之间的战略互动产生根本性影响，这对pedv感染的机制是决定性因素。因此，靶向nsp5的多肽设计，将为pedv的防治提供新的途径。
4.肽的结构相对简单，分子量小，因此易于合成和修饰，具有较高的细胞膜穿透性，无细胞毒性，免疫原性小。筛选多肽的常用方法有噬菌体展示技术、mrna展示技术、组合化学技术、基于计算机的虚拟筛选技术等。然而，这些方法高度依赖高通量的实验筛选，容易增加工作量。而基于结构的分子对接技术可以克服这个问题。分子对接是计算虚拟筛选的关键技术之一，它试图预测配体与蛋白质活性部位的结合方式和亲和力。它具有很多优点，如操作简单、快速，减少了多肽筛选的工作量，缩短了开发周期，提高了筛选成功率等。


技术实现要素：

5.本发明借助于机器学习模型，针对pedv nsp5蛋白晶体结构的解析，通过多肽虚拟筛选技术，筛选到与靶标蛋白具备潜，其多肽序列为kyrrqh(177080)。人工固相合成177080序列，并利用人工表达的pedv nsp5蛋白，借助elisa实验对多肽进行筛选；借助表面等离子共振实验(spr)鉴定多肽与靶蛋白的亲和力常数；通过cck-8试剂盒检验多肽177080对细胞毒性；借助荧光定量pcr和间接免疫荧光实验试验其抑制病毒感染的活性，结果表明177080可显著抑制pedv的感染。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.与猪病毒性腹泻病毒nsp5蛋白特异性结合的多肽序列，所述的多肽序列为kyrrqh。
8.所述的多肽序列，其特征在于，包括以上所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的修饰和以此为基础的改造；修饰材料包括但不限制在纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质上；改造材料包括但不限制在天然氨基酸、非天然氨基酸。
9.所述的多肽序列在针对猪病毒性腹泻病毒检测和抑制猪病毒性腹泻病毒领域的应用。
10.本发明的有益效果：
11.1、本发明基于pedv nsp5蛋白晶体结构，通过分子对接虚拟筛选技术和机器学习模型，获得一条与pedv nsp5特异性结合的多肽序列177080，其多肽序列为kyrrqh。通过表面等离子共振检测，多肽与pedv nsp5蛋白的平衡解离常数kd为5.372
×
10-6
m，即5.37μm，说明具备较高的亲和力。
12.2、本发明设计多肽在细胞水平进行病毒抑制实验，其有效抑制病毒复制的多肽浓度达3.125μm，病毒抑制效果出众。
附图说明
13.图1为177080序列与pedv nsp5蛋白的对接结果展示。
14.图2为177080序列与pedv nsp5蛋白的spr亲和力鉴定结果。图中，曲线自上至下依次为25μm，12.5μm，6.25μm，3.125μm，1.5625μm。其中，纵坐标代表传感器所检测到的信号值；横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。
15.图3为177080与人工表达pedv nsp5蛋白的elisa鉴定结果。
16.图4为177080对vero细胞毒性的鉴定结果。
17.图5为177080抑制pedv感染vero细胞的qrt-pcr鉴定结果。
18.图6为177080多肽抑制pedv感染vero细胞的间接免疫荧光鉴定结果。
具体实施方式
19.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
20.实施例1分子对接及虚拟肽库的筛选
21.在蛋白质结构库中下载pedv nsp5结构数据(pdb id:4xfq)，删除水分子和其它无关分子，并对侧链完整性进行评估，补充完整侧链基团，并将整个蛋白质结构能量最小化。借助计算机虚拟生成的肽库，与蛋白质结构进行虚拟对接，并计算分子间相互作用的力学参数。以已测定的多肽与蛋白质亲和力常数和相互作用力学为训练集，采用随机森林机器学习方法，建立评估多肽亲和力预测模型。通过预测结果的好坏来进行多肽优劣的筛选，以评估值为最佳(e评分)的多肽为候选多肽，进行下一步多肽合成和功能验证。多肽与蛋白相互作用模型预测结果(见图1)。
22.实施例2 177080与人工表达nsp5蛋白的亲和力鉴定(spr)
23.1、在把蛋白固定到芯片上之前，需要筛选合适的缓冲液ph，使配体通过静电吸附作用富集到芯片表面附近，达到较好的偶联效果。使用ph 5.5、5.0、4.5、4.0的醋酸钠溶液稀释pedv nsp5样品为40μg/ml。上样时间180s，50mm的naoh作为清洗溶液，根据结果确定使
用ph5.0作为偶联条件。
24.2、使用直接偶联法固定pedv nsp5至cm5芯片表面。选择通道，将flow cell 1作为参照通道，flow cell 2作为样品通道。选择偶联方法为氨基偶联amine。选择偶联方式为specify contact time:以固定的接触时间为偶联标准。点击next，选load sample，取出样品盘，按照表格中的示意图，一一对应放入所需试剂。将样品盘放回托架，点击next；检查缓冲液等，保存方法和结果文件；点击run，开始正式偶联。偶联完成后会显示最终偶联水平。
25.3、选择run kinetics/affinity assay点击kinetics/affinity设定相关实验参数，选择flow cell为1，2和芯片种类为cm5。startup的solution为hbs-ep缓冲液，结合时间120s，解离时间120s，再生溶液为0.25％的sds，稳定时间30s.填写样品名称，分子量，浓度。将样品溶解于hbs-ep，稀释成不同浓度，并设置一个零浓度和一个最低浓度重复的样品，按照要求放置样品，检查缓冲液，保存文件，点击run开始实验。
26.4、实验结束后，使用evaluation软件对结果进行分析，使用flow cell2扣除1的背景信号为实验结果，使用1:1binding拟合方式进行拟合。
27.结果表明，177080与人工表达pedv nsp5蛋白具有较好的亲和性结合，两者之间相互作用的平衡解离常数kd为5.372
×
10-6
m，即5.37μm(见图2)。
28.实施例3 177080与人工表达nsp5蛋白的elisa鉴定
29.1、将人工表达纯化的pedv nsp5蛋白以2μg/ml(蛋白量计)进行酶标板包被，其中包被抗原均采用碳酸盐(cbs)缓冲液进行稀释，每孔100μl加入96孔酶标板中，置于4℃条件下过夜，用pbst缓冲液洗涤5次后，再用5％的脱脂奶进行封闭。
30.2、将人工合成并在氨基端添加有his标签修饰的177080干粉使用pbs缓冲液(ph7.4)稀释成1μg/ml的浓度，以每孔100μl的体积加入到上述酶标板中，混匀后，置于37℃条件下，避光温育30min。
31.3、用pbst缓冲液洗涤5次，并甩干酶标板孔中的液体；使用5％脱脂奶将鼠源his标签抗体以1:1000进行稀释，每孔100μl的体积加入甩干的酶标板中，混匀后，置于37℃条件下，避光温育45min。
32.4、用pbst缓冲液洗涤5次，并甩干酶标板孔中的液体；使用5％脱脂奶将hrp标记羊抗鼠二抗以1:1000进行稀释，每孔100μl的体积加入甩干的酶标板中，混匀后，置于37℃条件下，避光温育30min。
33.5、根据试验所需量，将tmb显色液以每孔100μl的体积加入到上述酶标板中，充分混匀30s之后，室温条件下，显色10min。
34.6、将2m的硫酸液终止液以每孔50μl的体积加入上述酶标板中，充分混匀30s之后，在酶标仪器上，读取各孔在450nm处的吸光值，判定结果。
35.结果表明，177080与人工表达pedv nsp5蛋白具有较好的亲和性与特异性(见图3a-b)。
36.实施例4 177080对vero细胞毒性的鉴定
37.1、选择生长状态良好的vero细胞，待细胞铺满单层或长至80％-90％时，弃去培养基，用无菌pbs液洗涤3次后，加入1ml 0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞。待细胞消化完全后，加入适量含10％fbs的dmem培养基，吹散细胞，在细胞计数的基础上，将其密度调整至1
×
105细胞/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100μl；放置在37℃5％co2细胞培养箱中培养24h，
待细胞长至80％-90％时，弃去培养基，无菌pbs液洗涤3次(为避免边缘效应，细胞培养板最外面一圈的培养孔不用于实验)，并设置空白组、对照组、实验组。其中空白组仅加入100μl完全培养基，不加细胞悬浮液；对照组和实验组每孔加入100μl细胞悬浮液，每组设置至少三个平行孔。
38.2、将多肽粉末先用灭菌超纯水稀释至4mg/ml，根据多肽177080的分子量(m.w.:1978.30)，用无血清的dmem依次对其进行倍比稀释，即400μm,200μm,100μm,50μm,25μm,12.5μm,6.25μm,3.125μm,1.5625μm,0.78125μm。
39.3、细胞培养24h后观察细胞并换入新的培养基：空白组和对照组换成完全培养基；实验组换成含0.78125μm,1.5625μm,3.125μm,6.25μm,12.5μm,25μm,50μm,100μm,200μm,400μm。
40.4、细胞继续培养24h后，往每孔换入含10μlcck-8溶液的100μl完全培养基，然后继续培养1h，最后用酶标仪测定细胞培养板的吸光值，波长为450nm。根据公式细胞活性(100％)＝实验组od450-空白od450/对照组od450-空白od450来评估177080肽段的细胞毒性。
41.结果表明，177080在一定程度上对vero细胞没有毒性(见图4)。
42.实施例5 177080抑制pedv感染vero细胞的qrt-pcr鉴定
43.1、选择生长状态良好的vero细胞，待细胞铺满单层或长至80％-90％时，弃去培养基，用无菌pbs液洗涤3次后，加入1ml 0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞。待细胞消化完全后，加入适量含10％fbs的dmem培养基，吹散细胞，在细胞计数的基础上，将其密度调整至5
×
105细胞/ml，加入24孔细胞培养板中，每孔300μl；放置在37℃5％co2细胞培养箱中培养24h，待细胞长至80％-90％时，弃去培养基，无菌pbs液洗涤3次。
44.2、将0.01moi pedv病毒液接种于24孔细胞板中，每孔150μl，并放置于37℃孵育1h，然后将前期梯度稀释的多肽177080依次加入细胞板中，每孔150μl，终体积为300μl，且每个稀释度做3孔重复，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养34h，同时设不加多肽的病毒接种对照组及vero细胞对照组。
45.3、将24孔板取出后，弃去各孔培养基，每孔加入300μltrizol后，静置10min,分别收集各孔的样品，12000rpm，4℃离心10min，取细胞裂解上清，用于qrt-pcr的检测。
46.结果表明，177080能够较好的抑制pedv感染vero细胞，在加入浓度为200μm(最高终浓度)时，177080对病毒感染的抑制活性最好(见图5)。
47.实施例6 177080多肽抑制pedv感染vero细胞的间接免疫荧光鉴定
48.1、选择生长状态良好的vero细胞，待细胞铺满单层或长至80％-90％时，弃去培养基，用无菌pbs液洗涤3次后，加入1ml 0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞。待细胞消化完全后，加入适量含10％fbs的dmem培养基，吹散细胞，在细胞计数的基础上，将其密度调整至5
×
105细胞/ml，加入24孔细胞培养板中，每孔300μl；放置在37℃5％co2细胞培养箱中培养24h，待细胞长至80％-90％时，弃去培养基，无菌pbs液洗涤3次。
49.2、将0.01moi pedv病毒液接种于24孔细胞板中，每孔150μl，并放置于37℃孵育1h，然后将前期梯度稀释的多肽177080依次加入细胞板中，每孔150μl，终体积为300μl，且每个稀释度做3孔重复，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养34h，同时设不加多肽的病毒接种对照组及vero细胞对照组。
50.3、将24孔板取出后，弃去各孔培养基，pbst缓冲液轻轻清洗3次，利用4％的多聚甲醛溶液4℃固定细胞30min。
51.4、结束后，用0.2％tritonx-100室温通透15min，促进膜蛋白变性，从而使通透性增加。
52.5、pbst洗涤3次后，加入5％的脱脂奶封闭液37℃封闭2h。
53.6、pbst洗涤3次后，加入1:1000稀释的鼠抗pedv n蛋白抗体37℃温箱孵育1h。
54.7、pbst洗涤3次后，加入1:1000稀释的fitc标记的羊抗鼠二抗于37℃温箱孵育45min。
55.8、pbst洗涤3次后，加入dapi染色液室温作用15min。
56.9、pbst洗涤3次后，荧光倒置显微镜观察结果。
57.结果表明，177080能够较好的抑制pedv感染vero细胞，当加入浓度降至3.125μm时，177080对病毒感染的抑制效果依然显著(见图6)。
58.序列表
59.《110》河南省农业科学院
60.《120》一条抑制猪病毒性腹泻病毒的多肽及其序列《160》1
61.《170》siposequencelisting 1.0
62.《210》1
63.《211》6
64.《213》人工序列()
65.《400》1
66.lys tyr arg arg gln his

技术特征：
1.与猪病毒性腹泻病毒nsp5蛋白特异性结合的多肽序列，其特征在于，所述的多肽序列为kyrrqh。2.根据权利要求1所述的多肽序列，其特征在于，包括以上所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的修饰和以此为基础的改造；修饰材料包括但不限制在纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质上；改造材料包括但不限制在天然氨基酸、非天然氨基酸。3.根据权利要求1-2任一项所述的多肽序列在针对猪病毒性腹泻病毒检测和抑制猪病毒性腹泻病毒领域的应用。

技术总结
本发明借助于机器学习模型，针对PEDV Nsp5蛋白晶体结构的解析，通过多肽虚拟筛选技术，筛选到与靶标蛋白具备潜，其多肽序列为KYRRQH（177080）。人工固相合成177080序列，并利用人工表达的PEDV Nsp5蛋白，借助ELISA实验对多肽进行筛选；借助表面等离子共振实验（SPR）鉴定多肽与靶蛋白的亲和力常数；通过CCK-8试剂盒检验多肽177080对细胞毒性；借助荧光定量PCR和间接免疫荧光实验试验其抑制病毒感染的活性，结果表明177080可显著抑制PEDV的感染。的感染。的感染。


技术研发人员：张改平 王方雨 孙雪峰 冯华 邢广旭 徐倩
受保护的技术使用者：河南省农业科学院
技术研发日：2023.01.13
技术公布日：2023/8/1