微生物运输介质的制作方法

微生物运输介质
【技术领域】
1.本技术涉及一种微生物运输介质(transport medium)，尤指一种细菌及病毒的运输介质。


背景技术：

2.新兴的传染性呼吸道疾病显现了全世界持续的公共卫生威胁。在过去十多年中，2009年h1n1猪流感及2019年covid-19两大流行病席卷各大洲，造成数百万感染病例。这些病毒在世界传播的速度主要归因于世界各地持续增加的人口流动和城市地区的高人口密度。
3.为了阻止这些新兴疾病的传播，便需要更快且更明确的病原体检测及表征技术，而随着分子诊断学的出现，诊断的时效性与准确性也得到了改善。然而，阻碍分子诊断效率和速度的瓶颈之一出现在第一步，即样本采集。目前的生物样本采集试剂盒存在一些缺点，限制了分子诊断的优势。首先，生物样本中的核酸，例如dna和rna，在室温下会迅速降解，为了确保分析成功，必须维持核酸的完整性，故在采集样本后，样本便在冷藏/冷冻状态储藏及运输。其次，对温度敏感的样本需要冷链物流，这意味着需要更多的设备或基础设施，导致成本更高。再者，生物样本通常具有传染性(含有存活的细菌、病毒或其他病原体)，而样本采集试剂盒可能无法灭活传染原(有些样本采集试剂盒是刻意配制来保持病原体的活力)。因此，采集的样本对于参与采集、转移及测试的人员来说是不安全的。此外，测试必须在更高生物安全级别的环境中进行，这会导致设备和基础设施的高成本。又，传染性样本的运输是物流方面的难题，尤其是跨境运输，也会造成费用和工作量的增加。
4.据此，针对分子诊断流程所设计的新一代样本采集试剂盒/试剂被开发，这些试剂盒宣称能够：(1)在采集时灭活病原体，(2)稳定及保存核酸，例如dna和rna，以及(3)在室温下运输的同时保存核酸。有了这些优势，前述缺陷将不复存在。然而，大多数样本采集介质都含有乙醇，由于许多国家都有酒精运输的限制，此点也需进一步考量。
5.因此，实有必要提供一种微生物运输介质，以解决前述现有技术所遇到的问题。


技术实现要素：

6.本技术实施例的目的在于提供一种微生物运输介质，用以灭活及裂解微生物，从而释放微生物的核酸，并储藏及保存释放的核酸。
7.为达上述目的，本技术实施例提供一种微生物运输介质，包括至少一离液物质、至少一酸、至少一缓冲液、至少一螯合剂、以及至少一表面活性剂。
8.为达上述目的，本技术实施例更提供一种微生物运输介质，包括至少一离液物质、至少一酸、至少一缓冲液、至少一螯合剂、至少一表面活性剂、以及至少一沉淀剂。
9.在一实施例中，微生物运输介质包括1m至4m的硫氰酸胍(guscn)；1mm至100mm的三羟甲基氨基甲烷(tris)；10mm至50mm的乙二胺四乙酸(edta)；10mm至50mm的柠檬酸钠；以及0.1％至2％的乙基苯基聚乙二醇(np-40)，其中微生物运输介质为无酒精运输介质。
10.在一实施例中，微生物运输介质更包括一酸，用以调整微生物运输介质的ph值至介于4至7之间。
11.在一实施例中，酸包括盐酸。
12.在一实施例中，微生物运输介质更包括一沉淀剂。
13.在一实施例中，沉淀剂包括聚乙二醇(peg)，且微生物运输介质包括1％至15％的聚乙二醇(peg)。
14.在一实施例中，微生物包括细菌及病毒。
15.在一实施例中，微生物运输介质用于一拭子样本。
【附图说明】
16.图1显示绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)的培养结果。图2显示金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的培养结果。图3显示偶然分枝杆菌(mycobacterium fortuitum)的培养结果。图4显示在运输介质中储藏及保存的hcov 229e、hcov oc43、flua h3n2及sars-cov-2病毒rna的稳定性分析。图5显示在运输介质中储藏及保存的金黄色葡萄球菌dna的稳定性分析。图6a及图6b分别显示flua h1n1及hcov oc43的tcid50分析结果。图7显示a型流感病毒检测的pcr测试结果及pcr测试的平均ct值。图8a及图8b显示运输介质的保质期研究。
【具体实施方式】
17.体现本技术特征与优点的一些实施例将在下文详细叙述。应理解的是本技术能够在不同方面具有各种的变化，其皆不脱离本技术的范围，且其中的说明及附图在本质上为说明之用，而非用以限制本技术。
18.本技术实施例是提供一种运输介质，其能在样本采集时灭活细菌及病毒，在室温下长时间稳定及保存微生物的核酸，并具有可与市售样本采集试剂盒/试剂相媲美的性能。
19.在一方面，本技术实施例提供的运输介质是可将核酸及微生物从拭子样本释放到运输介质中。“核酸”一词包括核糖核酸(ribonucleic acid，rna)及脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，dna)，且进一步包括线性或分支、单链或双链、或其片段的rna及/或dna。“微生物”一词是指细菌及病毒。
20.另一方面，本技术实施例提供的运输介质是可用于保存及稳定从拭子样本释放到运输介质中的核酸和从微生物释放到运输介质中的核酸。“保存”一词是指保护核酸免于降解，且随后核酸可成功地使用分子生物学方法分离和分析。
21.当拭子样本用本技术实施例的运输介质处理时，从拭子样本释放到运输介质中的核酸和从微生物释放到运输介质中的核酸可被保存及稳定，使核酸受保护免于降解，且随后可从样本中分离出来，并使用分子生物学方法进行分析。保存在本技术实施例的运输介质中的释放核酸，可在一定温度范围内长期储藏后再进行分离及用于分子诊断应用。
22.利用本技术实施例的运输介质，核酸可在室温下保存一年以上。
23.本技术实施例的运输介质也可配制用于裂解可能存在于拭子样本中的微生物，藉
此降低拭子样本处理、运输与测试相关的健康和安全风险。
24.本技术实施例的运输介质是不含酒精的运输介质，使得运输介质可通过许多国家的酒精运输限制。
25.本技术实施例的运输介质将进一步详细说明如下。
26.根据本技术的第一示范实例，运输介质包括至少一离液物质、至少一酸、至少一缓冲液、至少一螯合剂、至少一表面活性剂、以及至少一沉淀剂。
27.在一实施例中，离液物质可为但不限于硫氰酸胍(guanidine thiocyanate，简称guscn)，且运输介质可包括约1m至约4m的guscn。
28.在一实施例中，酸可为但不限于盐酸(hcl)，是加入运输介质以调整ph值至介于4至7之间。
29.在一实施例中，缓冲液可为但不限于三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane，简称tris)，且运输介质可包括约1mm至约100mm的tris。
30.在一实施例中，螯合剂可为但不限于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，简称edta)，且运输介质可包括约10mm至约50mm的edta。
31.在一实施例中，螯合剂可为但不限于柠檬酸钠(sodium citrate)，且运输介质可包括约10mm至约50mm的柠檬酸钠。
32.在一实施例中，表面活性剂可为但不限于乙基苯基聚乙二醇(np-40)，且运输介质可包括约0.1％至约2％的np-40。
33.在一实施例中，沉淀剂可为但不限于聚乙二醇(polyethylene glycol，简称peg)，例如peg 8000，且运输介质可包括约1％至约15％的peg。
34.举例来说，实例1的运输介质包括2-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于5至7之间、50-100mm tris作为缓冲液、20-30mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、1-2％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及5-15％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
35.举例来说，实例2的运输介质包括2-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于5至7之间、1-10mm tris作为缓冲液、20-30mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、1-2％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及5-15％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
36.举例来说，实例3的运输介质包括2-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及5-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
37.举例来说，实例4的运输介质包括2-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及5-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
38.举例来说，实例5的运输介质包括2-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及5-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
39.举例来说，实例6的运输介质包括2-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及5-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
40.举例来说，实例7的运输介质包括1-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及1-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
41.举例来说，实例8的运输介质包括1-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及1-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
42.举例来说，实例9的运输介质包括1-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及1-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
43.举例来说，实例10的运输介质包括1-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及1-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
44.举例来说，实例11的运输介质包括3-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及10-15％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
45.举例来说，实例12的运输介质包括3-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及10-15％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
46.举例来说，实例13的运输介质包括3-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及5-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
47.举例来说，实例14的运输介质包括3-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及5-10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
48.在一实施例中(实施例一)，运输介质包括3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间(例如ph 6.7)、10mm tris作为缓冲液、20mm edta及25mm柠檬酸钠作为螯合剂、1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂、以及10％(wt/vol)peg 8000作为沉淀剂。
49.值得注意的是，上述实例1至14及实施例一中的运输介质可不包括酒精。换言之，一些本技术实施例的运输介质为无酒精运输介质，使得运输介质可通过许多国家的酒精运输限制。
50.根据本技术的第二示范实例，运输介质包括至少一离液物质、至少一酸、至少一缓冲液、至少一螯合剂、以及至少一表面活性剂。
51.在一实施例中，离液物质可为但不限于guscn，且运输介质可包括约1m至约4m的guscn。
52.在一实施例中，酸可为但不限于hcl，加入运输介质以调整ph值至介于4至7之间。
53.在一实施例中，缓冲液可为但不限于tris，且运输介质可包括约1mm至约100mm的tris。
54.在一实施例中，螯合剂可为但不限于edta，且运输介质可包括约10mm至约50mm的
edta。
55.在一实施例中，螯合剂可为但不限于柠檬酸钠，且运输介质可包括约10mm至约50mm的柠檬酸钠。
56.在一实施例中，表面活性剂可为但不限于np-40，且运输介质可包括约0.1％至约2％的np-40。
57.举例来说，实例15的运输介质包括2-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于5至7之间、50-100mm tris作为缓冲液、20-30mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及1-2％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
58.举例来说，实例16的运输介质包括2-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于5至7之间、1-10mm tris作为缓冲液、20-30mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及1-2％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
59.举例来说，实例17的运输介质包括2-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
60.举例来说，实例18的运输介质包括2-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
61.举例来说，实例19的运输介质包括2-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
62.举例来说，实例20的运输介质包括2-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
63.举例来说，实例21的运输介质包括1-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
64.举例来说，实例22的运输介质包括1-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
65.举例来说，实例23的运输介质包括1-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
66.举例来说，实例24的运输介质包括1-3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及25-50mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
67.举例来说，实例25的运输介质包括3-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
68.举例来说，实例26的运输介质包括3-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph
值至介于6至7之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
69.举例来说，实例27的运输介质包括3-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、1-10mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
70.举例来说，实例28的运输介质包括3-4m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于4至6之间、50-100mm tris作为缓冲液、10-20mm edta及20-30mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及0.5-1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
71.在另一实施例中(实施例二)，运输介质包括3m guscn作为离液物质、hcl作为酸以调整ph值至介于6至7之间(例如ph 6.7)、10mm tris作为缓冲液、20mm edta及25mm柠檬酸钠作为螯合剂、以及1％(wt/vol)np-40作为表面活性剂。
72.值得注意的是，上述实例15至28及实施例二中的运输介质不包括酒精。换言之，运输介质为无酒精运输介质，使得运输介质可通过许多国家的酒精运输限制。
73.本技术上述的运输介质提供了独特的采集与保存配方来作为运输介质，其可将核酸和微生物从拭子样本释放到运输介质中。
74.本技术上述的运输介质可用于保存及稳定从拭子样本释放到运输介质中的核酸，以及从微生物释放到运输介质中的核酸。
75.本技术上述的运输介质提供了采集与保存配方，以灭活及裂解存在于生物拭子样本中的微生物，藉此释放微生物的核酸，并将释放的核酸保存在生物拭子样本中，且全部容置在单一个反应容器中。释放的核酸可被稳定，从而保护核酸免于降解，且随后可从样本中分离出来并可用于分子诊断分析。此外，所公开的运输介质配方可使释放的核酸在室温下至少保持基本稳定，而不需要一致和恒定的较低温度来储藏，例如冷藏或冷冻储藏。
76.本技术上述的运输介质对于临床、实地及部署使用，或者对于大量样本采集/萃取是理想的。用上述实施例所述组成物所采集的拭子样本是生物灭活的，且可安全地运输，甚至不需要冷藏或干冰。
77.以下将以实验进一步说明本技术运输介质的使用。
78.在第一个实验中，本技术运输介质是用于灭活革兰氏阴性菌中的绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)。鼻咽拭子模拟基质(nasopharyngeal swab simulated matrix，简称npssm)制备如下。npssm配方包括1x pbs、2.5％(w/v)猪粘蛋白、1％(v/v)人类全血、0.85％(w/v)氯化钠、15％(v/v)甘油。将1x106绿脓杆菌掺入100μl的npssm中，再将1.2ml的运输介质(例如依实施例二的配方制备)加入掺菌的npssm中，并在eppendorf管中混匀。在室温(25℃)下10分钟后，取出10μl经前述处理过的npssm，用90μl胰蛋白酶大豆缓冲液(tryptic soy buffer，简称tsb)稀释(1:10稀释)，然后接种在胰蛋白酶大豆琼脂培养基(tryptic soy agar plate，简称tsap)上。在对照组中，则是将1.2ml的pbs代替运输介质添加到掺菌的npssm中，混合并静置10分钟，然后同前述进行接种。培养基于37℃下培育96小时以上，并观察菌落。图1显示绿脓杆菌的培养结果。对于掺菌的npssm，在用拭子样本运输介质(swab specimen transport medium，标记为“sstm”)处理过的培养基上没有观察到细菌生长，表示细菌细胞已裂解。这也证实了利用本技术运输介质处理过的拭子样本中已不含具传染性的革兰氏阴性菌。
79.在第二个实验中，本技术运输介质用于灭活革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)。鼻咽拭子模拟基质(nasopharyngeal swab simulated matrix，简称npssm)制备如下。npssm配方包括1x pbs、2.5％(w/v)猪粘蛋白、1％(v/v)人类全血、0.85％(w/v)氯化钠、15％(v/v)甘油。将1x106金黄色葡萄球菌掺入100μl的npssm中，再将1.2ml的运输介质加入掺菌的npssm中，并在eppendorf管中混匀。在室温(25℃)下10分钟后，取出10μl经前述处理过的npssm，用90μl胰蛋白酶大豆缓冲液(tryptic soy buffer，简称tsb)稀释(1:10稀释)，然后接种在胰蛋白酶大豆琼脂培养基(tryptic soy agar plate，简称tsap)上。在对照组中，则是将1.2ml的pbs代替运输介质添加到掺菌的npssm中，混合并静置10分钟，然后同前述进行接种。培养基于37℃下培育96小时以上，并观察菌落。图2显示金黄色葡萄球菌的培养结果。对于掺菌的npssm，在用拭子样本运输介质(swab specimen transport medium，标记为“sstm”)处理过的培养基上没有观察到细菌生长，表示细菌细胞已裂解。这也证实了利用本技术运输介质处理过的拭子样本中已不含具传染性的革兰氏阳性菌。
80.在第三个实验中，本技术运输介质用于灭活分枝杆菌中的偶然分枝杆菌(mycobacterium fortuitum)。鼻咽拭子模拟基质(nasopharyngeal swab simulated matrix，简称npssm)制备如下。npssm配方包括1x pbs、2.5％(w/v)猪粘蛋白、1％(v/v)人类全血、0.85％(w/v)氯化钠、15％(v/v)甘油。将1x106偶然分枝杆菌掺入100μl的npssm中，再将1.2ml的运输介质加入掺菌的npssm中，并在eppendorf管中混匀。在室温(25℃)下10分钟后，取出10μl经前述处理过的npssm，用90μl胰蛋白酶大豆缓冲液(tryptic soy buffer，简称tsb)稀释(1:10稀释)，然后接种在middlebrook 7h9培养基上。在对照组中，则是将1.2ml的pbs代替运输介质添加到掺菌的npssm中，混合静置10分钟，然后同前述进行接种。培养基于33℃下培育4天以上，并观察菌落。图3显示偶然分枝杆菌的培养结果。对于掺菌的npssm，在用拭子样本运输介质(swab specimen transport medium，标记为“sstm”)处理过的培养基上没有观察到细菌生长，表示细菌细胞已裂解。这也证实了利用本技术运输介质处理过的拭子样本中已不含具传染性的分枝杆菌。
81.根据前述三个实验可知，本技术运输介质具有在10分钟内灭活革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及分枝杆菌的能力，这强烈意味着本技术运输介质也能够在相同的时间(即10分钟)内灭活病毒。因此，利用本技术运输介质处理的拭子样本将不含具传染性的细菌及病毒。
82.在第四个实验中，本技术运输介质用于病毒rna的储藏与保存，所测试的病毒rna包括来自人类冠状病毒(human coronavirus，hcov)229e、hcov oc43、a型流感病毒(influenza a virus，flua)h3n2、以及sars-cov-2的病毒rna。将活病毒掺入100μl的npssm中至终浓度为10000pfu/ml，再立即加入900μl的运输介质，并于eppendorf管中混匀，接着在室温(27℃)下储藏。于以下时间点：0周、4周、6周、8周、10周、及12周分别取出200μl经前述处理过的npssm，并在每个时间点，利用市售试剂盒(例如qiagen viral rna kit，cat#52906)从处理过的npssm中分离出rna。再从60μl提取的纯化rna中取5μl rna，利用市售试剂盒(例如kapafast one-step qrt-pcr master mix(2x)kit，cat#kr0393)进行总体积为20μl的qrt-pcr反应。反应设置如下：
83.rt-pcr反应程式如下：
84.图4显示在运输介质中储藏及保存的hcov 229e、hcov oc43、flua h3n2及sars-cov-2病毒rna的稳定性分析。在运输介质中于室温下储藏0周、4周、6周、8周、10周及12周后，可观察到病毒rna的成功扩增与检测。由于仍可检测到rna，表示病毒rna在采集后于室温下储藏12周后仍然完好无损。换言之，在12周的培育过程中，病毒rna在运输介质中于室温下仍能保持稳定。
85.在第五个实验中，本技术运输介质用于细菌dna的储藏与保存。将1x105cfu的金黄色葡萄球菌活菌掺入100μl的npssm中，再立即加入900μl的运输介质，并于eppendorf管中混匀，接着在室温(27℃)下储藏。于一个月间隔的时间点分别取出200μl经前述处理过的npssm，并在每个时间点，利用市售试剂盒(例如qiagen qiaamp dna mini kit，cat#51306)从处理过的npssm中分离出dna。再从60μl提取的纯化dna中取5μl dna，利用市售试剂盒(例如kapafast qpcr kit master mix(2x)universal，cat#kk4602)进行总体积为20μl的qpcr反应。反应设置如下：
86.pcr反应程式如下：
87.图5显示在运输介质中储藏及保存的金黄色葡萄球菌dna的稳定性分析。在运输介质中于室温下储藏19个月后，可观察到细菌dna的成功扩增与检测。由于仍可检测到dna，表示细菌dna在采集后于室温下储藏19个月后仍然完好无损。换言之，在19个月的培育过程中，细菌dna在运输介质中于室温下仍能保持稳定。
88.在第六个实验中，本技术运输介质用于灭活rna病毒，包括a型流感病毒及人类冠状病毒。将100μl 105tcid50/ml的活病毒flua h1n1及hcov oc43分别掺入300μl的运输介质中。在室温(25℃)下培育10秒后，将溶液用洗涤剂去除离心柱处理，以去除细胞毒性作用。在对照组中，则是将300μl pbs代替运输介质加入病毒，混合并静置10秒，然后同前述进行处理。tcid50分析是透过将处理过的洗提液用细胞培养基从100到10-5
的连续稀释来进行。处理过的洗提液用于感染活细胞培养物，在37℃下培育6天以上，并观察细胞病变效应(cytopathic effect，简称cpe)
89.图6a及图6b分别显示flua h1n1及hcov oc43的tcid50分析结果，其中受病毒感染的孔是无色的，而具有活细胞的孔则被染成蓝色。对于含有运输介质(标记为“sstm”)和活病毒的溶液，连续稀释栏中的细胞是活的，这表示运输介质成功灭活了病毒。根据结果显示，对于flua h1n1及hcov oc43，病毒浓度均降低了104tcid50/ml，证实运输介质具有杀病毒活性。
90.在第七个实验中，测定了从本技术运输介质的低浓度生物体中回收rna的效果。将武汉a型流感病毒株掺入鼻咽拭子模拟基质(npssm)中至终浓度为102至104pfu/ml。制备掺入病毒的npssm等分试样并添加到运输介质中，然后利用市售试剂盒(例如tiangen dp315-t8)进行核酸萃取。反应设置及rt-pcr反应程式与第四个实验相同。
91.图7显示a型流感病毒检测的pcr测试结果及pcr测试的平均ct值。用市售核酸萃取试剂盒萃取出运输介质中不同低浓度的a型流感病毒，接着以pcr进行a型流感检测。更具体地说，运输介质中浓度为1x104pfu/ml至1x102pfu/ml的a型流感病毒先进行核酸萃取，并将萃取出的rna进一步扩增并以标准实时rt-pcr进行检测。包括低浓度100pfu/ml的所有浓度
皆可一致地被检测到，表示运输介质能够维持下游pcr测定的灵敏度。根据数据显示，运输介质为下游pcr应用维持了良好的检测灵敏度(100pfu/ml)。
92.在第八个实验中，测定了本技术运输介质的保质期(shelflife)。在测试中，运输介质被保存在聚丙烯塑胶管中并在室温(27℃)下储藏，且在每个时间点取出等分试样进行测定。将100cfu/ml的活菌或1000pfu/ml的活病毒掺入50μl npssm中，再立即添加到450μl运输介质中，并在eppendorf管中混匀。根据第五个实验来分离并分析来自细菌的dna，以及根据第四个实验来分离并分析来自病毒的rna。
93.图8a及图8b显示运输介质的保质期研究。根据结果可清楚得知，本技术运输介质的保质期至少为13个月，且本技术运输介质能够保持其对dna和rna的灭活特性达13个月的时间。
94.综上所述，本技术提供了一种运输介质，用于灭活及裂解存在于生物拭子样本中的微生物，藉此释放微生物的核酸，并将释放的核酸储藏及保存在生物拭子样本中，且全部容置在单一个反应容器中。释放的核酸可被稳定，从而保护核酸免于降解，且随后可从样本中分离出来并可用于分子诊断分析。此外，本技术运输介质可使释放的核酸在室温下至少保持基本稳定，而不需要一致和恒定的较低温度来储藏，例如冷藏或冷冻储藏。本技术运输介质也可媲美市售核酸萃取试剂盒，为下游应用维持良好的灵敏度(100pfu/ml)。此外，本技术运输介质为无酒精运输介质，使得运输介质可通过许多国家的酒精运输限制。因此，本技术运输介质在临床、实地及部署使用上，是理想的运输介质。
95.纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由本领域技术人员任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附权利要求所欲保护者。

技术特征：
1.一种微生物运输介质，包括：1m至4m的硫氰酸胍(guscn)；1mm至100mm的三羟甲基氨基甲烷(tris)；10mm至50mm的乙二胺四乙酸(edta)；10mm至50mm的柠檬酸钠；以及0.1％至2％的乙基苯基聚乙二醇(np-40)，其中该微生物运输介质为无酒精运输介质。2.如权利要求1所述的微生物运输介质，更包括一酸，用以调整该微生物运输介质的ph值至介于4至7之间。3.如权利要求2所述的微生物运输介质，其中该酸包括盐酸。4.如权利要求1所述的微生物运输介质，更包括一沉淀剂。5.如权利要求4所述的微生物运输介质，其中该沉淀剂包括聚乙二醇(peg)。6.如权利要求5所述的微生物运输介质，其中该微生物运输介质包括1％至15％的聚乙二醇(peg)。7.如权利要求1所述的微生物运输介质，其中该微生物包括细菌及病毒。8.如权利要求1所述的微生物运输介质，其中该微生物运输介质用于一拭子样本。

技术总结
本申请提供一种微生物运输介质，包括至少一离液物质、至少一酸、至少一缓冲液、至少一螯合剂、以及至少一表面活性剂。此运输介质能够在样本收集时灭活细菌和病毒，并在室温下长时间稳定及保存微生物的核酸。间稳定及保存微生物的核酸。间稳定及保存微生物的核酸。


技术研发人员：林猷斌 李家俊 张微石
受保护的技术使用者：台达电子国际（新加坡）私人有限公司
技术研发日：2023.01.19
技术公布日：2023/8/1