一种拉莫三嗪中基因毒性杂质硫酸二正丙酯的含量检测方法与流程

1.本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种基因毒性杂质的检测方法。


背景技术：

2.拉莫三嗪（lamotrigine）是电压门控钠通道的功能依赖性和电压依赖性阻滞剂，可单独用药也可联合用药用于治疗癫痫和双相情感障碍，疗效显著，孕期妇女可用，安全性较好，2021年《柳叶刀》的一项多中心rct研究显示拉莫三嗪是局灶性癫痫患者的一线治疗药物，并应成为未来试验的标准治疗药物。然而，临床上拉莫三嗪可能导致高死亡率的严重超敏反应（如中毒性表皮坏死松解症，ten，死亡率高达50%）即使及时停药其病情仍然会加剧甚至死亡，因此，基于拉莫三嗪药物安全性与风险防范考虑，从源头控制拉莫三嗪潜在的基因毒性杂质，在一定程度上可减少或避免某些不良反应的发生，保障癫痫患者的用药安全，具有重大社会意义。
3.黄诺哲[黄诺哲, 黄莹, 严全鸿. hplc法测定拉莫三嗪中的有关物质[j]. 药物分析杂志, 2020,40(03):495-501]、姜金生[姜金生, 石笑弋, 刘轶等. 高效液相色谱法测定拉莫三嗪片中的有关物质[j].中南药学, 2021,19(08):1637-1643]对拉莫三嗪相关的特定杂质、降解杂质和工艺杂质进行了研究报道，但没有结合拉莫三嗪原料药合成工艺对潜在的、痕量的基因毒性杂质进行研究报道。拉莫三嗪原料药以2,3-二氯苯甲酸为起始物料，工艺合成路线中使用的正丙醇和硫酸根会反应生成硫酸正二丙酯（dipropyl sulfate），由于硫酸正二丙酯的硫酸酯基团为警示结构，因此应按照基因毒性杂质的要求进行质量控制研究。
[0004]
文献报道了采用顶空气相色谱法测定塞来昔布中硫酸二乙酯[汪生, 倪悦泠, 陆宇婷, 等. 顶空气相色谱法测定塞来昔布中硫酸二乙酯基因毒性杂质[j].中国新药杂志, 2018,27(20):2437-2441]，采用气相色谱法测定依折麦布中硫酸二异丙酯[杨琪, 刘延新, 杨海霞, 等. 气相色谱法测定依折麦布中硫酸二异丙酯的含量[j].中国药师, 2016,19(04):774-776]，然而，对于痕量的基因毒性杂质的检测，常规气相色谱法采用的电子捕获监测器或氢火焰离子化检测器的灵敏度显得不够。朱长友等[朱长友, 罗文. gc-ms法测定塞来昔布中硫酸酯类基因毒性杂质[j]. 海峡药学, 2022,34(10):26-30]采用gc-ms方法检测塞来昔布中硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二异丙酯，鲍美玲等[鲍美玲, 陈海霞, 秦琴, 等. gc-ms法同时测定9-氨基米诺环素盐酸盐中的硫酸二甲酯和硫酸二异丙酯[j]. 海峡药学, 2018,30(09):51-53]采用gc-ms方法检测9-氨基米诺环素盐酸盐中的硫酸二甲酯和硫酸二异丙酯，刘瑞等[刘瑞, 曾瑜, 赖华杰, 等. 液相色谱-串联质谱法测定百里酚中硫酸二异丙酯残留量[j]. 广州化学, 2019,44(03):51-54]采用液相色谱-串联质谱法测定百里酚中硫酸二异丙酯残留量。
[0005]
然而，目前还没有文献报道对拉莫三嗪中痕量的基因毒性杂质硫酸二正丙酯的含量测定，也没有文献报道对其他药物中的基因毒性杂质硫酸正二丙酯的检测方法。由于各种药物基质的不同，以及各种基因毒性杂质的理化性质的不同，现有的检测方法不能简单
借鉴与套用，需要深入地进行检测方法的摸索开发，并验证所开发的检测方法的可行性。


技术实现要素：

[0006]
现有技术尚未见基因毒性杂质硫酸正二丙酯的检测方法的报道，也未见拉莫三嗪中痕量的基因毒性杂质硫酸正二丙酯的检测方法的报道，本发明提供一种操作简单、准确度和灵敏度高、专属性强的 gc-ms 检测方法对拉莫三嗪中痕量的基因毒性杂质硫酸二正丙酯进行含量测定。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明提供一种拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的含量测定方法，使用气相色谱-质谱联用仪来测定拉莫三嗪供试品溶液中的硫酸正二丙酯，采用选择离子监测的扫描模式，硫酸正二丙酯的定量离子为m/z 43，定性离子为m/z 73和m/z 42。
[0008]
载气为氦气，载气流速为2.0 ml/min，采用程序升温的方式进行分离，离子源温度为230℃，离子化能量为70 ev，四极杆温度为150℃，色谱柱为agilent db-624柱（30 m
×
320
ꢀµm×
1.8
ꢀµ
m）。
[0009]
进一步地，程序升温为：初始柱温为70 ℃，以10 ℃/min升温至120 ℃，再以25 ℃/min升温至230 ℃，保持8 min。
[0010]
进一步地，进样模式为不分流进样，进样量为1μl。
[0011]
拉莫三嗪供试品溶液的制备方法为称取拉莫三嗪样品约0.2666 g，置15 ml离心管中，准确加入10.0 ml正己烷，涡旋提取2 min，8000 r/min离心5 min，取上清即得。
[0012]
硫酸二正丙酯在25.0 ~ 400.0
ꢀµ
g/l质量浓度范围内呈线性关系，相关系数r大于0.998，检测限为0.38 mg/kg定量限为0.94 mg/kg，硫酸二正丙酯的精密度、重复性、24 h内稳定性均良好，采用拉莫三嗪样品加硫酸二正丙酯对照品溶液的回收率在93.71% ～ 114.04%之间，满足回收率在80.0% ～ 115.0%之间的要求，rsd为7.37%。本发明的含量测定分析方法准确、灵敏度高、专属性强、操作简单实用，可用于拉莫三嗪中基因毒性杂质硫酸二正丙酯的定量分析。
附图说明
[0013]
图1为gc-ms法专属性考察图谱。
[0014]
a-空白溶液；b-供试品溶液；c-硫酸二正丙酯对照品中间使用液iii；d-供试品加标溶液。
实施方式
[0015]
参考ich《m7：评估和控制药物中dna反应性（致突变）杂质以限制潜在的致癌风险行业指南》及《中国药典》2020年版（四部）《9306遗传毒性杂质控制指导原则》，采用毒理学关注阈值（threshold of toxicological concern，ttc）计算杂质的控制限度，硫酸正二丙酯杂质的ttc为1.5μg﹒day-1
，根据拉莫三嗪片说明书
[13]
用法用量，本品用于成人或12岁以上儿童治疗时，每日剂量可达到200 mg，计算得到硫酸二正丙酯杂质不得过7.5 ppm，即其质量浓度不得过7.5 mg﹒kg-1
，其含量远低于常规有机杂质0 .05％或 0 .10％的指标限度，使用常规的电子捕获检测器或氢火焰离子化检测器的灵敏度和抗干扰能力很难达到要求，因此需要使用灵敏度更高的检测方法进行分析。由于目前尚未见拉莫三嗪中硫酸二正丙酯
定量分析方法的报道，本试验选择了灵敏度高、抗干扰能力强、容易普及的gc-ms方法对拉莫三嗪中硫酸二正丙酯进行含量测定分析方法开发与验证。
[0016]
1.1.仪器7890b-5977b型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；bp211d型和bsa224s型电子天平（德国赛多利斯公司）；xw-80a型涡旋混合仪（上海驰唐电子有限公司）；eppendorf 5810r型高速冷冻离心机（德国艾本德公司）。
[0017]
1.2.试药正己烷（色谱级，sigma-aldrich公司）；乙腈（色谱级，sigma-aldrich公司）；硫酸二正丙酯（硫酸二丙酯）对照品（tci，批号mrnya-iq；纯度99.4%）；拉莫三嗪原料药3批（某公司，批号210303、210304、210305）。
[0018]
2.1.1.色谱条件色谱柱：agilent db-624柱（30 m
×
320
ꢀµm×
1.8
ꢀµ
m）；进样口温度：230 ℃；初始柱温为70 ℃，以10 ℃﹒min-1
升温至120 ℃，再以25 ℃﹒min-1
升温至230 ℃，保持8 min；载气：氦气；载气流速：2.0 ml﹒min-1 ；进样模式：不分流进样；进样量：1 μl。
[0019]
2.1.2.质谱条件离子源温度：230 ℃；离子化能量：70 ev；ms温度：150 ℃；四极杆温度: 150 ℃；gc-ms接口温度：230 ℃；扫描方式：选择离子监测（sim）模式；emv模式：使用增益因子（增益因子1）；硫酸二正丙酯的保留时间为8.546 min，定量离子为m/z 43，定性离子为m/z 73和m/z 42。
[0020]
3.1 对照品溶液3.1.1 对照品储备液：精密称取硫酸二正丙酯对照品适量，置10 ml量瓶中，正己烷定容至刻度，得质量浓度为1805 mg﹒l-1
的硫酸二正丙酯储备液，保存于4 ℃冰箱中备用。
[0021]
3.1.2 对照品中间使用液：精密移取111.5
ꢀµ
l 硫酸二正丙酯储备液，置10 ml量瓶中，正己烷定量稀释至刻度，配制成硫酸二正丙酯质量浓度为20.0 mg﹒l-1
的对照品中间使用液ⅰ，保存于4 ℃冰箱中备用；精密移取2.0 ml对照品中间使用液ⅰ，置10 ml量瓶中，正己烷定量稀释至刻度，配制成硫酸二正丙酯质量浓度为4.0 mg﹒l-1
的对照品中间使用液ⅱ，保存于4 ℃冰箱中备用；精密移取1.0 ml对照品中间使用液ⅱ，置10 ml量瓶中，正己烷定量稀释至刻度，配制成硫酸二正丙酯质量浓度为400.0
ꢀµ
g﹒l-1
的对照品中间使用液ⅲ。
[0022]
3.1.3 系列对照品标准工作溶液：准确移取对照品中间使用液ⅲ，用正己烷稀释成质量浓度为25.0
ꢀµ
g﹒l-1
、100.0
ꢀµ
g﹒l-1
、160.0
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g﹒l-1
、200.0
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g﹒l-1
、240.0
ꢀµ
g﹒l-1
、300.0
ꢀµ
g﹒l-1
、400.0
ꢀµ
g﹒l-1
的系列对照品标准工作液，供gc-ms测定。
[0023]
3.2 供试品溶液3.2.1 供试品溶液：称取拉莫三嗪样品约0.2666 g(精确至0.0001g) ，置15 ml离心管中，准确加入10.0 ml正己烷，涡旋提取2 min，20 ℃，8000 r﹒min-1
离心5 min，取上清液过0.22
ꢀµ
m有机相滤膜后作为供试品溶液（约26.66 mg﹒ml-1
），待gc-ms分析。
[0024]
3.2.2. 供试品加标溶液配制：称取拉莫三嗪样品约0.2666 g(精确至0.0001 g) ，置15 ml离心管中，准确加入对照品中间使用液
ⅱꢀ
0.5 ml，再准确加入9.5 ml正己烷，涡旋提取2 min，20℃，8000 r﹒min-1
离心5 min，取上清液过0.22
ꢀµ
m有机相滤膜，即为供试品加标溶液。
[0025]
3.3 空白溶液参照3.2.1项下的供试品溶液制备方法，同时做空白试验，即不加入拉莫三嗪样品，按上述步骤处理，即为空白溶液。
[0026]
4.1 专属性将空白溶液、供试品溶液、硫酸二正丙酯对照品中间使用液iii、供试品加标溶液依次注入gc-ms分析（见图1）。空白溶液和供试品溶液中其它物质均不干扰硫酸二正丙酯的测定，且硫酸二正丙酯对照品溶液与供试品加标溶液中硫酸二正丙酯的保留时间均为8.546 min，定量离子和定性离子的丰度比例一致，表明本方法的专属性符合要求。
[0027]
4.2 检测限和定量限将硫酸二正丙酯对照品中间使用液ⅲ用正己烷稀释成系列浓度工作液，注入gc-ms分析，本方法测定拉莫三嗪中硫酸二正丙酯检测限为0.38 mg﹒kg-1
，定量限为0.94 mg﹒kg-1
，低于拉莫三嗪中硫酸二正丙酯限度的30%（质量浓度不得过7.5 mg﹒kg-1
），硫酸二正丙酯定量限对照品溶液连续进样6针，峰面积rsd为1.01%，满足拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的定量测定要求。
[0028]
4.3 线性与范围将3.1.3项下的系列对照品标准工作溶液注入gc-ms分析，以浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，进行线性回归，并计算相关系数r。硫酸二正丙酯在25.0 ~ 400.0
ꢀµ
g﹒l-1
质量浓度范围内线性关系良好，线性方程为y=65.458111x-372.967370，相关系数r为0.9991，表明本方法能满足拉莫三嗪中硫酸二正丙酯测定的线性和范围要求4.4 重复性试验将3.1.3项下的系列对照品标准工作溶液和参照3.2.2项下方法制备的供试品加标溶液6份，注入gc-ms分析。硫酸二正丙酯在25.0 ~ 400.0
ꢀµ
g﹒l-1
质量浓度范围内线性关系良好，线性方程为y=52.293862x-324.514690，相关系数r为0.9997。经测定，硫酸二正丙酯质量浓度rsd为3.25%，峰面积rsd为3.35%，均小于6%，符合要求。由于3.1.3项下的系列对照品标准工作溶液是在4℃冰箱中存放4天后再次检测，且符合要求，说明硫酸二正丙酯对照品溶液在4℃冰箱中存放4天无明显变化，稳定性较好。
[0029]
4.5 准确度与回收率试验参考3.2.2项下的供试品加标溶液配制方法精密称量拉莫三嗪试样9份分别加入对照品中间使用液
ⅱꢀ
0.4 ml 、0.5 ml、0.6 ml，配置成80%、100%、120%限度的供试品加标溶液。取参照3.2.1项下制备的供试品溶液，以及80%、100%、120%限度的供试品加标溶液，依次注入gc-ms分析，计算加标回收率，检测结果见表1。拉莫三嗪样品中未检出硫酸二正丙酯，硫酸二正丙酯在80%、100%、120%限度的供试品加标溶液中的回收率结果在93.71% ～ 114.04%之间，满足准确度和回收率的要求。
[0030]
表1 硫酸二正丙酯加标回收率测试结果
[0031][0032]
参照3.2.1项下的供试品溶液配置方法，精密称取拉莫三嗪样品（批号分别为210303、210304和210305，每批次称取两份）配制成供试品溶液，注入gc-ms分析，3批次拉莫三嗪样品经测定，均未检出硫酸二正丙酯，硫酸二正丙酯的定量限为0.94 mg﹒kg-1
。
[0033]
本发明采用 gc-ms 法对拉莫三嗪中潜在的基因毒性杂质硫酸二正丙酯进行检测，硫酸二正丙酯在25.0 ~ 400.0
ꢀµ
g﹒l-1
质量浓度范围内线性关系良好，相关系数r大于0.998，检测限和定量限分别为0.38 mg﹒kg-1
和0.94 mg﹒kg-1
，方法定量限低于拉莫三嗪中硫酸二正丙酯限度（不得过7.5 mg﹒kg-1
）的30%，硫酸二正丙酯的重复性、24 h内稳定性均良好，采用拉莫三嗪样品加硫酸二正丙酯对照品溶液的回收率在93.71% ～ 114.04%之间，满足回收率在80.0% ～ 115.0%之间的要求，rsd为7.37%。经方法学验证，本发明提供的分析方法准确，灵敏度高，专属性强，操作简单实用，该检测方法可用于拉莫三嗪中基因毒性杂质硫酸二正丙酯的定量分析。

技术特征：
1.一种拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的含量测定方法，其特征在于：使用气相色谱-质谱联用仪来测定拉莫三嗪供试品溶液中的硫酸正二丙酯，采用选择离子监测的扫描模式，硫酸正二丙酯的定量离子为m/z 43，定性离子为m/z 73和m/z 42。2.根据权利要求1所述的一种拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的含量测定方法，其特征在于：采用程序升温的方式进行分离，离子源温度为230℃，离子化能量为70 ev，四极杆温度为150℃。3.根据权利要求1所述的一种拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的含量测定方法，其特征在于：载气为氦气，载气流速为2.0 ml/min。4.根据权利要求1所述的一种拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的含量测定方法，其特征在于：色谱柱为agilent db-624柱（30 m
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m
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m）。5.根据权利要求2所述的一种拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的含量测定方法，其特征在于：程序升温的初始柱温为70 ℃，以10 ℃/min升温至120 ℃，再以25 ℃/min升温至230 ℃，保持8 min。6.根据权利要求1所述的一种拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的含量测定方法，其特征在于：进样模式为不分流进样，进样量为1μl。7.根据权利要求1所述的一种拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的含量测定方法，其特征在于：供试品溶液的制备方法为称取拉莫三嗪样品适量，置15 ml离心管中，准确加入10.0 ml正己烷，涡旋提取2 min，8000 r/min离心5 min，取上清即得。8.根据权利要求1-7任一项所述的一种拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的含量测定方法，其特征在于：硫酸二正丙酯在25.0 ~ 400.0
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g/l质量浓度范围内呈线性关系，检测限为0.38 mg/kg定量限为0.94 mg/kg。

技术总结
拉莫三嗪生产过程使用的正丙醇和硫酸根会反应生成具有警示结构的硫酸正二丙酯，目前还未见拉莫三嗪中硫酸二正丙酯的测定方法报道。本发明使用气相色谱-质谱联用仪来测定拉莫三嗪供试品溶液中的硫酸正二丙酯，采用选择离子监测的扫描模式，硫酸正二丙酯的定量离子为m/z 43，定性离子为m/z 73和m/z 42，载气为氦气，载气流速为2.0 mL/min，程序升温，离子源温度为230℃，离子化能量为70 eV，四极杆温度为150℃，色谱柱为Agilent DB-624柱（30 m


技术研发人员：陈俊 姜金生 陈开义
受保护的技术使用者：三金集团湖南三金制药有限责任公司
技术研发日：2023.03.01
技术公布日：2023/8/1