H3K4me3在毛细胞再生中的应用及其相关小鼠模型的构建方法

h3k4me3在毛细胞再生中的应用及其相关小鼠模型的构建方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术中的听觉领域，具体涉及h3k4me3在毛细胞再生中的应用及其相关小鼠模型的构建方法。


背景技术：

2.听觉作为一种重要的感官，是人类交流的基础。目前，约有4.66亿人遭受严重听力损失，耳蜗毛细胞(hair cells，hcs)的损伤是听觉障碍的主要原因。hcs作为听觉系统中最关键的机械感受器，可以将声波产生的机械刺激转化为耳蜗中的电信号。成年哺乳动物耳蜗hcs普遍缺乏再生能力，因此hcs损伤导致的听力损失是不可修复的。
3.hcs周围的支持细胞(scs)可能是损伤后hcs再生的一个可能来源。耳蜗hc损伤后，某些类型的干细胞可以通过有丝分裂再生或直接转分化的方式增殖分化产生新的hc。此外，已发现这些干细胞在体外有助于hcs的再生。特别是在出生后早期，表达lgr5的干细胞亚群具有一定的再生能力，可以作为hc的祖细胞。众所周知，lgr5在胃、肠、肝等多种组织中都可以被认为是一种重要的干细胞标记物。在耳蜗中，lgr5在内柱、边缘等细胞中的表达水平也明显上调。值得注意的是，新生小鼠耳蜗hc损伤可显著促进lgr5+祖细胞进行hc的自发再生过程。
4.作为表观遗传修饰之一，组蛋白修饰可以调节基因的表达，以响应各种发育和环境变化。近年来，组蛋白修饰被报道参与听觉系统和干细胞系的细胞再生、细胞增殖以及细胞周期过程。尤其是组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化(h3k4me3)，是一种被广泛认可的活性的、动态的组蛋白甲基化标记，通常标记转录基因的启动子，与转录激活相关。然而，关于组蛋白甲基化/去甲基化修饰在lgr5+祖细胞再生hcs中的作用的报道很少。探索h3k4me3对lgr5+祖细胞再生的调控机制，对hcs的损伤修复和再生，以及听力损失的治疗有重要意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提出了h3k4me3在毛细胞再生中的应用及其相关小鼠模型的构建方法。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.一种小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
8.取若干出生后0-3天的lgr5-egfp-creert2小鼠，取出耳蜗放入培养基中培养，消化，加入大豆胰蛋白酶抑制剂；分选出新霉素损伤的耳蜗细胞与对照耳蜗细胞；
9.通过rna-seq分析新霉素损伤的耳蜗细胞中的lgr5阳性的细胞与对照耳蜗细胞存在差异表达的基因；
10.取小鼠耳蜗培养，抗h3k4me3抗体对剪切后的染色质进行免疫沉淀，chip-seq分析新霉素损伤的耳蜗细胞以及对照细胞的全基因组图谱和峰值图谱；
11.构建蛋白质与蛋白质的相互作用网络；
12.转录因子富集分析h3k4me3组蛋白修饰位点显著改变。
13.可选地，所述的分选出新霉素损伤的耳蜗细胞与对照耳蜗细胞的步骤通过流式细胞仪完成，并通过流式细胞分选仪上用gfp通道精确筛选得到耳蜗中的lgr5阳性细胞。
14.可选地，所述的抗h3k4me3抗体为ab8580、abcam。
15.可选地，所述的培养基为dmem/f12培养基。
16.可选地，所述的培养基还包括：b27、n2、igf-1、硫酸肝素以及bfgf。
17.上述的小鼠模型在研究毛细胞损伤后的再生机制中的应用。
18.本发明的有益效果：
19.利用流式分选得到lgr5+祖细胞，使测序样本纯净单一，不含有其他杂质干扰，使数据更加保真。分别进行rna-seq和chip-seq，对得到的样本测序结果进行转录水平和h3k4me3表观修饰的基因的富集分析和新霉素处理的差异表达基因分析，并构建了蛋白质互作网络。为进一步揭示lgr5+祖细胞在新霉素损伤后再生hcs的分子机制，实现听力损失恢复奠定了理论和实验基础。
附图说明
20.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
21.图1.新霉素处理后的差异表达基因和功能分析。a：对照组和新霉素治疗组之间差异表达基因的火山图谱。b：这些上调的差异表达基因参与的生物过程。c：这些下调的差异表达基因参与的生物过程。显示了与听觉系统和hcs再生有关的生物学过程，p值小于0.01
22.图2.对照组和新霉素治疗组h3k4me3组蛋白修饰的chip-seq。a：chip-seq测序生物复制样本在对照组和实验组的聚类分析。b：chip-seq从四个生物样本中检测到的染色体结合位点分布图。c：用chip-seq法测定4个生物样本转录起始点上下游3kb范围内的染色体结合位点密度图。d：四个生物样本的全基因组chip-seq概述。
23.图3.h3k4me3组蛋白修饰信号在对照组和新霉素处理组中的差异分布。a：h3k4me3 chip-seq测序在转录起始点对四个生物样本检测到的信号值的分布情况。b：对照组和实验组h3k4me3组蛋白修饰位点的比例。c：对照组与实验组h3k4me3组蛋白修饰位点有显著变化的百分比。d：从显著不同的h3k4me3组蛋白修饰位点注释的基因生物学过程的功能富集图。
24.图4.由显著改变的h3k4me3组蛋白修饰位点注释的基因的go功能富集分析。a：条形图显示了由显著变化的h3k4me3组蛋白修饰位点注释的基因显著富集的前20个生物过程。b：网络图显示了前7个显着富集的生物过程条目和这些途径中的基因；
25.图5.显著改变h3k4me3组蛋白修饰位点和差异表达基因的交集和功能。a：韦恩图显示了注释到h3k4me3组蛋白修饰位点的基因和差异表达基因的交集。将这些上调基因、下调基因和h3k4me3组蛋白修饰位点分别取为交叉点。b：从显着改变的h3k4me3组蛋白修饰位点和差异表达基因的交集衍生的生物学过程的功能富集分析。显示了与听觉系统和hc再生有关的生物学过程，p值小于0.01。c：基因表达和h3k4me3组蛋白修饰信号分布图显示了对照组和新霉素组特征交叉点基因的变化。显示piod2、eef1a1、pkn2和id3基因。
26.图6.蛋白质相互作用网络分析。a：差异表达基因的蛋白质相互作用网络分析。不同的生物过程网络用不同的颜色标记。红色代表rna-seq和h3k4me3chip-seq共有的差异表
达基因。b：top 3子网络及其核心蛋白。
27.图7.转录因子富集分析h3k4me3组蛋白修饰位点显著改变。a：根据对显著改变的h3k4me3组蛋白修饰位点的富集分析，序列徽标显示了最显著富含的三个转录因子基序。b：网络图显示，三个最显着丰富的转录因子可能调节靶基因。符合以下条件的被定义为转录因子的靶基因。1.该基因可以通过显著改变的h3k4me3组蛋白修饰位点进行注释。2.该基因注释的h3k4me3组蛋白修饰位点具有潜在的转录因子基序。3.该基因显著差异表达。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
29.在本发明的一些实施例中，公开了小鼠模型的构建方法与试验方法，以探索h3k4me3对lgr5+祖细胞再生的调控机制，具体可以包括以下步骤。
30.(1)新霉素损伤的耳蜗lgr5+细胞样本采集
31.取20-30只出生后0-3天的lgr5-egfp-creert2小鼠，雌雄各半，取出耳蜗，放入添加b27(1：50稀释，invitrogen)、n2(1：100稀释度，invitrogen)、igf-1(50ng/ml，sigma)、硫酸肝素(50ng/ml，sigma)、bfgf(10ng/ml，sigma)的dmem/f12培养基中培养。然后洗涤耳蜗，在完全培养基中继续培养24h。收集的耳蜗用预热的0.125％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(invitrogen)，37℃消化8min。然后加入等量的大豆胰蛋白酶抑制剂(10mg/ml，worthington biochem)阻止胰蛋白酶反应。耳蜗用钝针尖上下移液80～10 0次进一步细分为单细胞，并通过40μm细胞过滤器(bd biosciences)过滤。在流式细胞分选仪通过gfp通道将新霉素损伤耳蜗和对照组耳蜗细胞分离。
32.(2)rna-seq数据分析
33.rna-seq数据有6个样本(每组有3个样本)。在新霉素损伤的lgr5+祖细胞组和对照组之间存在130个差异显著的基因(p值《0.05)，这些基因在新霉素损伤的lgr5+祖细胞组和对照组之间存在明显的差异(p值《0.05)。
34.(3)chip sequencing
35.chip数据来源于80只雄性或雌性小鼠(新霉素损伤组和对照组分别有40只小鼠)。每组平行进行两个实验，每个重复包括20只小鼠(每组有两个样本)。首先，在核酸提取缓冲液(10mm tris-hcl(ph8.5)，140mm nacl，5mm mgcl2，0.6％np40，1mm pmsf，1x pic)和mnase master mix(1x mnase主缓冲液，2mm dtt，5％peg6000，6u/ul mnase)中室温下培养7min。加入100mm edta的mnase停止液终止反应。然后，用1％triton，1％doc溶液裂解细胞，得到剪切后的染色质，准备chiped。第三，用抗h3k4me3抗体(ab8580，abcam)对剪切后的染色质进行免疫沉淀。以40rpm的速度孵育样品，在4℃的旋转器上持续旋转一夜，洗涤珠子，洗脱捕获的ip-复合物。最后，在illumina-hiseq 2500平台上对免疫沉淀(ip)和非免疫沉淀对照(input)样品进行测序。
36.(4)chip-seq数据分析
37.使用fastx工具包用初始qc来移除重复读取和低质量读取。然后，这些高质量的读
数被bowtie2进一步贴回到小鼠的参考基因组(mm10)上。用macs2鉴定h3k4me3在背景输入下的富集峰。用chipseqer、chippeakanno和deeptools进行峰注解和富集分析。全基因组图谱和峰值图谱分别用基因组集成查看器(igv)和deeptools可视化。
38.(5)kegg富集分析
39.使用r软件包clusterprofiler进行go和kegg分析。所有go和kegg注释分析的统计学意义阈值水平为p《0.05。
40.(6)构建蛋白质与蛋白质的相互作用网络
41.这些基因对应于chip-seq中不同的调控峰，在rna-seq中差异表达，可作为蛋白质与蛋白质相互作用(ppi)网络的组成部分。这些蛋白质和蛋白质相互作用信息来自数据库https://string-db.org。采用cytoscape 3.8软件构建ppi网络。然后在cytoscape中使用这个mcode 2.0.0(http://apps.cytoscape.org/apps/mcode)插件来提取ppi网络的子网，使用mcode默认参数。
42.(7)转录因子结合位点分析
43.用自制python脚本提取差异结合h3k4me3峰的染色体序列。这些序列被提交到meme数据库的centrimo模块进行motif enrichment analysis，以识别重要的转录因子。该centrimo可以区分实验验证或用户给定的motif，该motif对提供的序列中的特定位置具有强烈的偏倚(https://meme-suite.org/meme//tools/centrimo)。此外，这些在对照组和新霉素组中发生显著变化的h3k4me3峰被提交给模因数据库的fimo模块，以识别已知转录因子motif可以结合的目标序列(https://meme-suite.org/meme//tools/fimo)。
44.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
45.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

技术特征：
1.一种小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：取若干出生后0-3天的lgr5-egfp-creert2小鼠，取出耳蜗放入培养基中培养，消化，加入大豆胰蛋白酶抑制剂；分选出新霉素损伤的耳蜗细胞与对照耳蜗细胞；通过rna-seq分析新霉素损伤的耳蜗细胞中的lgr5阳性的细胞与对照耳蜗细胞存在差异表达的基因；取小鼠耳蜗培养，抗h3k4me3抗体对剪切后的染色质进行免疫沉淀，chip-seq分析新霉素损伤的耳蜗细胞以及对照细胞的全基因组图谱和峰值图谱；构建蛋白质与蛋白质的相互作用网络；转录因子富集分析h3k4me3组蛋白修饰位点显著改变。2.根据权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的分选出新霉素损伤的耳蜗细胞与对照耳蜗细胞的步骤通过流式细胞仪完成，并通过流式细胞分选仪上用gfp通道精确筛选得到耳蜗中的lgr5阳性细胞。3.根据权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的抗h3k4me3抗体为ab8580、abcam。4.根据权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的培养基为dmem/f12培养基。5.根据权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的培养基还包括：b27、n2、igf-1、硫酸肝素以及bfgf。6.权利要求1～5任一所述的小鼠模型在研究毛细胞损伤后的再生机制中的应用。

技术总结
本发明公开了H3K4ME3在毛细胞再生中的应用及其相关小鼠模型的构建方法，属于生物技术中的听觉领域。一种小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：取若干出生后0-3天的Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，取出耳蜗放入培养基中培养，消化，加入大豆胰蛋白酶抑制剂；分选出新霉素损伤的耳蜗细胞与对照耳蜗细胞；通过RNA-seq分析新霉素损伤的耳蜗细胞中的Lgr5阳性的细胞与对照耳蜗细胞存在差异表达的基因；取小鼠耳蜗培养，抗H3K4me3抗体对剪切后的染色质进行免疫沉淀，ChIP-Seq分析新霉素损伤的耳蜗细胞以及对照细胞的全基因组图谱和峰值图谱；构建蛋白质与蛋白质的相互作用网络。蛋白质与蛋白质的相互作用网络。蛋白质与蛋白质的相互作用网络。


技术研发人员：柴人杰 郭佳敏
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2023.03.02
技术公布日：2023/8/1