一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶、制备方法及其在制备体外药物控释药物中的应用

1.本发明涉及一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶、制备方法及其在制备体外药物控释药物中的应用，属于药物输送领域。


背景技术：

2.癌症是当今社会造成人类死亡的元凶之一，其病发率与死亡率和人类的生活水平息息相关。egen等人在2017年报道，贫困城市居民的患癌率和癌症死亡率要比富人高的多，这很可能是因为疾病的诊断处于癌症的最后阶段且获得及时有效治疗机会有限。尽管目前已有多种癌症治疗方式，局部的手术治疗/辐射治疗和全身性的化疗，病人仍会遭受如肠道问题、神经系统损伤或疲劳等副作用。纳米医学的发展对于癌症医疗是非常有效的，为靶向性的全身疗法开创了一个新的阶段。
3.高渗透长滞留效应(enhanced permeability and retention effect，epr效应)是纳米药物递送体将药物分子带到肿瘤处的有效途径。肿瘤组织需要血液为其过度的细胞生长提供营养和血液，因而新的血管会随着肿瘤的增大而形成，但是这些血管往往成形不良，因而导致“渗漏”。肿瘤处渗透的管脉系统和较差的淋巴引流使得尺寸相对较大的纳米粒子能够进入癌细胞但是却不能被有效的带走，从而增加了肿瘤处的累积。这种效应使得大量纳米材料能够用于药物运载体。
4.具有良好的稳定性和水溶性的纳米粒子能够改善药物的药代动力学，减少药物的毒副作用，对活性药物分子具有良好的保护作用，因而在药物传递系统中发挥着重要的作用。其中，聚多巴胺(polydopamine，pda)是一种具有良好的生物相容性的真黑色素的主要色素，由多巴胺(dopamine，da)在碱性条件下氧化聚合自聚而成。pda表面含有大量的氨基、羟基和羰基等官能团，可以提供多种活性位点与其他功能性生物分子或抗肿瘤药物结合。zhang等人设计了一种硫化铜@聚多巴胺-叶酸/阿霉素纳米复合物用于癌细胞的化疗和光热医疗。阿霉素(dox)通过静电力和π-π堆积相互作用装载在材料表面，因而纳米复合物能够响应ph的变化释放药物分子【非专利文献1】。此外，pda是一种杰出的光敏试剂，能够吸收近红外光(near infrared，ir)并将其转换为热量。如li等人设计一种由二氢卟吩共轭和pda包覆的纳米金星多功能纳米复合物(aunss@pda-ce6)同时用于光声成像、光热医疗和光动力医疗。在808nm激光的辐射下，4t1肿瘤细胞可被完全清除且有效抑制了肺转移【非专利文献2】。尽管pda具有优异的性能，但在生物医学应用中仍然存在化学不稳定性的缺点。为了提高其生理稳定性，往往在其表面修饰如聚乙二醇等能使其在体内保持稳定的物质【非专利文献3】。
5.对于药物运载体而言，研究人员趋向于开发多重刺激响应性来满足人体内复杂的生理环境的要求。刺激响应性聚合物能够提高药物的生物可获得性，外层包覆刺激响应性的聚合物壳层，不仅能够解决pda的生理稳定性，还能够赋予其更加智能的药物释放机制【非专利文献4和5】。
6.非专利文献1：li j,huang s,shi w,etal.pt nanoparticle decorated carbon nanotubes nanocomposite based sensing platform for the monitoring of cell-secreted dopamine[j].sensors and actuators b:chemical,2021,330(1):129311-129344；
[0007]
非专利文献2：grze
′
skowiak b f,maziukiewicz d,a,etal.polyamidoamine dendrimers decorated multifunctional polydopamine nanoparticles for targeted chemo-and photothermal therapy of liver cancer model[j].international journal of molecular sciences,2021,22(2):738-754；
[0008]
非专利文献3：li z w,yang f,wu d,et al.ce6-conjugated and polydopamine-coated gold nanostars with enhanced photoacoustic imaging and photothermal/photodynamic therapy to inhibit lung metastasis of breast cancer[j].nanoscale,2020,12(43):22173-22184；
[0009]
非专利文献4：zhang s,liu x,sun q,etal.cus@pda-fa nanocomposites:a dual stimuli-responsive dox delivery vehicle with ultrahigh loading level for synergistic photothermal-chemotherapies on breast cancer[j].journal of materials chemistry b,2020,8(7):1396-1407；
[0010]
非专利文献5：liu l,wang s,qi p,etal.dopamine-modified poly(ε-caprolactone)micelles for ph controlled delivery of bortezomib[j].international journal of pharmaceutics,2020,590:119885-119895。


技术实现要素：

[0011]
本发明基于当前主流的ph响应性pda药物输送体系，结合温敏性聚合物设计一种基于pda的温度、ph、nir三重响应性核壳微凝胶，用于靶向输送抗肿瘤药物dox。本发明提供了一种以pda为核，p(nipam-aam-gma)为壳层的核壳微凝胶，并接枝靶向分子fa用于多模式化疗和光热医疗；该材料通过装载dox，并进行以hep g2肝癌细胞为模型细胞系的mtt实验以及细胞摄取实验，证实了材料的生物相容性以及fa的靶向作用。
[0012]
本发明所采用的技术方案为：
[0013]
一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶，包括聚多巴胺；
[0014]
聚多巴胺上包覆有由含c＝c双键的硅烷偶联剂、n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚得到的聚合物，且聚合物通过硅烷偶联剂的-si-o键接枝于聚多巴胺表面；
[0015]
以及通过酰胺键与甲基丙烯酸缩水甘油酯连接的叶酸。
[0016]
上述叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0017]
s1：pda微球的合成：将多巴胺盐酸盐在碱性条件下氧化自聚，待反应结束后提纯pda微球；
[0018]
s2：pda-sio2微球的合成及改性：将pda微球通过溶液-凝胶反应水解缩合teos，待反应结束后离心洗涤、真空干燥得pda-sio2微球；然后将pda-sio2微球分散在甲苯中后滴加硅烷偶联剂，待反应结束后洗涤、真空干燥得改性pda-sio2微球即pda-sio
2-ene微球；
[0019]
s3：pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶的合成：将pda-sio
2-ene，nipam，aam，gma，mba以及sds分散在去离子水中，在氮气环境下升温，然后滴加aps和sps至体系中，待反应结束后透析除杂得pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶；
[0020]
s4：fa接枝的pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶合成：将
[0021]
pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶在一溶液中氨基功能化处理后，再将fa在另一溶液中活化处理，然后将活化后的fa通过酰胺化反应接枝在氨基功能化的pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶上，制得fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶；
[0022]
s5：fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶的合成：将
[0023]
fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶分散在去离子水中溶胀，再加入hf水溶液，搅拌，待反应结束后透析除杂、冷冻干燥得fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶。
[0024]
优选地，
[0025]
步骤s1中，pda微球合成的具体方法为：
[0026]
将40ml无水乙醇、3ml氨水以及90ml超纯水注入烧杯中混合均匀，快速加入10ml，浓度为50mg ml-1
的多巴胺盐酸盐水溶液，室温下敞口磁力搅拌24小时，反应过程中，溶液颜色由无色变为褐色最终稳定为黑色；待反应结束后分别用离心和丙酮沉淀法提纯pda微球，反复6次，获得pda微球，冷冻干燥，其中，每次离心处理的时间为5分钟，离心转速为12000rpm；每次丙酮提纯时，丙酮的用量为pda溶液体积的2倍。
[0027]
优选地，
[0028]
步骤s2中，pda-sio2微球合成的具体方法为：
[0029]
将pda微球超声分散在80ml无水乙醇中，分散均匀后缓慢滴加0.5ml的teos并磁力搅拌6小时，反应结束后，离心、洗涤、真空干燥即可获得pda-sio2微球，其中，离心处理到时间为5分钟，离心转速为9000rpm；
[0030]
pda-sio2微球改性的具体方法为：
[0031]
取0.13g pda-sio2微球超声分散在25ml甲苯中，缓慢滴加3ml kh570，然后在45℃下超声30分钟，后转移至油浴锅，在45℃下磁力搅拌4小时；反应结束，将混合物离心，并依次用甲苯、无水乙醇洗涤去除多余的kh570，然后将沉淀在45℃下真空干燥过夜，即得pda-sio
2-ene，其中，离心处理到时间为5分钟，离心转速为9000rpm。
[0032]
优选地，
[0033]
步骤s3中，pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶合成的具体方法为：
[0034]
将研磨粉碎后的pda-sio
2-ene，nipam，aam，gma，mba以及1mg sds超声分散在去离子水中，待分散均匀后注入保持氮气环境的三颈烧瓶中，将温度升至60℃，待温度稳定后依次连续滴加1ml，浓度为3mg ml-1
的aps和1ml，浓度为2.5mg ml-1
的sps，反应持续6小时后移除热源，冷却至室温后将混合物封装入透析袋中，每隔6小时换一次水，连续3天，将透析袋内残留物去除，得pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶。
[0035]
优选地，
[0036]
步骤s4中，pda-sio2@p(nipam-aam-gma)氨基功能化处理的具体方法为：
[0037]
将30mg研磨粉碎后的pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶粉在20ml，ph为6.0的pbs缓冲液中超声分散均匀，加入1ml ea，将混合物在室温下磁力搅拌24小时即得氨基功能化的微凝胶；
[0038]
fa活化的具体方法为：
[0039]
将5mg fa超声分散在ph为6.0的pbs缓冲液中，然后依次加入edc，nhs活化15分钟；
[0040]
接枝的具体方法为：
[0041]
用浓度为0.1m的naoh溶液将活化溶液ph调至7.2-7.4，然后快速加入至氨基功能化溶液中，在避光条件下持续反应24小时；反应结束后，将溶液封装入透析袋中浸泡2天，每隔6小时换水，将透析袋内残留物冷冻干燥即得fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶。
[0042]
优选地，
[0043]
步骤s5中，fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶合成的具体方法为：
[0044]
将50mg研磨粉碎后的fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶粉超声均匀分散在20ml去离子水中，溶胀一夜后在通风橱处加入1ml，含量为5wt.％的hf水溶液，室温下敞口磁力搅拌24小时后透析除杂，冷冻干燥即得fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶。
[0045]
上述叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶在制备体外药物控释药物中的应用。
[0046]
优选地，上述叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶上装载有抗肿瘤药物阿霉素dox。
[0047]
优选地，
[0048]
叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶上装载有抗肿瘤药物阿霉素dox的具体方法为：
[0049]
将15mgfa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶超声分散在20ml ，ph为8.0的pbs缓冲液中，然后加入5ml，浓度为1mg ml-1的dox溶液，然后在黑暗条件下搅拌24小时，再透析除去游离的药物分子。
[0050]
本发明的有益效果在于：
[0051]
1、pda-sio2微球通过羟基水解缩合引入c＝c双键官能团，使核表面能够包覆上均匀的p(nipam-aam-gma)壳层，弥补了pda表面缺乏足够的活性官能团引发聚合反应的缺陷；
[0052]
2、p(nipam-aam-gma)壳层有着亲水性的聚合物网络和大量的孔隙，不仅能够增强pda的生理稳定性，还能够赋予其温度敏感性药物释放的特性，优化了pda的药物控释性能；
[0053]
3、fa接枝在p(nipam-aam-gma)壳层上，使其能够识别叶酸受体过度表达的肿瘤细胞，提高其抗肿瘤效果。
附图说明
[0054]
图1为fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶的合成示意图；
[0055]
图2为pda(a)，pda-sio2(b)，pda-sio
2-ene(c)，pda-sio2@p(nipam-aam-gma(d)，pda@p(nipam-aam-gma)(e)的红外图谱；
[0056]
图3为fa(a)，fa-pda@p(nipam-aam-gma)(b)和pda(c)的紫外光谱图；
[0057]
图4为pda(a)、pda-sio2(b)、pda-sio
2-ene(c)、fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)(d)和fa-pda@p(nipam-aam-gma)(e)微凝胶的热重曲线；
[0058]
图5为pda(a)、pda-sio2(b)、pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶(c)和pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶(d)的扫描电镜图；(e)pda@p(nipam-aam-gma)微凝胶的eds图以及元素分布图；
[0059]
图6为pda(a)、pda-sio2(b)、pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶(c、d)和pda@p(nipam-aam-gma)微凝胶(e)的透射电镜图；
[0060]
图7为(a)微凝胶溶液在500nm波长下透过率随温度变化图；(b)pnag-3在25℃和39℃下透过率变化图；(c)微凝胶的粒径随温度变化图；(d)pnag-3在室温(左图)和39℃(右图)下的物理外观；
[0061]
图8为(a)808nm激光(5.12w，cm-2
)辐射下，pda(a)、pda-sio2(b)、fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶(c)、fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶(d)微凝胶分散液的温度曲线和pbs缓冲液的温度曲线(e)，(样品均为1mg ml-1
，2ml)；
[0062]
(b)fa-p(nipam-aam-gma)微凝胶(0.5mg ml-1
，2ml)暴露在808nm激光下开关5次循环的温度曲线；
[0063]
图9为(a)pda的电位图；(b)pda的ph依赖性dox释放；(c)fa-pnag-3在不同条件下的dox释放率；(d)分散在pbs(ph 5.5或7.4)中的fa-pnag-3在激光开/关下的dox累积释放率；以标准误差作误差棒(n＝3)；
[0064]
图10为(a)fa-pnag-3的生物相容性。(b)dox或dox-fa-pnag-3处理后hep g2细胞的存活率；
[0065]
图11为dox-fa-pnag-3和dox-pnag-3孵育hep g2肝癌细胞的荧光显微镜图像。
具体实施方式
[0066]
下面结合附图和实施例对本发明做具体的介绍。
[0067]
实施例
[0068]
本实施例是叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶的制备方法，具体过程如下：
[0069]
1、pda微球的合成与纯化
[0070]
将40ml无水乙醇、3ml氨水以及90ml超纯水注入烧杯中混合均匀，快速加入10ml，浓度为50mg ml-1
的多巴胺盐酸盐水溶液，室温下敞口磁力搅拌24小时，反应过程中，溶液颜色由无色变为褐色最终稳定为黑色；待反应结束后分别用离心和丙酮沉淀法提纯pda微球，反复6次，获得pda微球，冷冻干燥，其中，每次离心处理的时间为5分钟，离心转速为12000rpm；每次丙酮提纯时，丙酮的用量为pda溶液体积的2倍。
[0071]
2、pda表面硅壳修饰及kh570改性
[0072]
将pda微球超声分散在80ml无水乙醇中，分散均匀后缓慢滴加0.5ml的teos并磁力搅拌6小时，反应结束后，离心、洗涤、真空干燥即可获得pda-sio2微球，其中，离心处理到时间为5分钟，离心转速为9000rpm。
[0073]
取0.13g pda-sio2微球超声分散在25ml甲苯中，缓慢滴加3ml kh570，然后在45℃下超声30分钟，后转移至油浴锅，在45℃下磁力搅拌4小时；反应结束，将混合物离心，并依次用甲苯、无水乙醇洗涤去除多余的kh570，然后将沉淀在45℃下真空干燥过夜，即得pda-sio
2-ene，其中，离心处理到时间为5分钟，离心转速为9000rpm。
[0074]
3、合成pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶
[0075]
通过乳液聚合法合成以pda-sio
2-ene为核的核壳微凝胶。具体的说，将pda-sio
2-ene，nipam，aam，gma，mba以及1mg sds超声分散在去离子水中，待分散均匀后注入保持氮气
环境的三颈烧瓶中(装配冷凝管，保持恒温)。将温度升至60℃，待温度稳定后依次连续滴加1ml aps(3mg ml-1
)和1ml sps(2.5mg ml-1
)。反应持续6小时后移除热源，冷却至室温后将混合物封装入透析袋中(molecular weight cutoff，mwco＝8000-14000)，每隔6小时换一次水，连续3天，除去游离的单体、引发剂等杂质，即得pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶。
[0076]
为了调控核壳微凝胶的低临界溶解温度(low critical solution temperature，lcst),在保持其他试剂用量一定的条件下调整aam的用量，反复进行上述实验，具体的投料比如表1所示。
[0077]
表1：合成核壳微凝胶的投料比
[0078][0079]
4、fa接枝的pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶
[0080]
pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶中微量的gma仅用于接枝靶向分子fa。取30mg pda-sio2@p(nipam-aam-gma)在20ml pbs缓冲液(ph＝6.0)中超声分散均匀，加入1ml ea(过量)，混合物在室温下磁力搅拌24小时获得氨基功能化的核壳微凝胶。
[0081]
实验中通过edc/nhs活化fa的羧基，再通过酰胺化反应接枝在核壳微凝胶表面。具体的说，5mg fa超声分散在pbs缓冲液中(ph＝6.0)，然后依次加入edc，nhs活化15分钟，用浓度0.1m的氢氧化钠溶液将ph调到7.2-7.4之间后，快速加入至上述微凝胶溶液中，反应在避光条件下持续24小时。反应结束后，将fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶溶液封装入mwco＝3500的透析袋中浸泡2天，每隔6小时换水，最后经冷冻干燥后备用。
[0082]
sio2中间层是为了方便包覆温敏性聚合物网络，为了不影响pda在后续载药、释药实验中的作用，因而用hf将其消除。具体的说，取50mg fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶冻干粉超声均匀分散在20ml去离子水中，溶胀一夜后在通风橱处加入1ml稀释的hf水溶液(5wt.％)，室温下敞口磁力搅拌24小时后透析除杂，冷冻干燥得fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶。
[0083]
光热性能检测
[0084]
为了研究材料的光热转换性能，分别配置1mg ml-1
的pda、pda-sio2、fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶、fa-pda@p(nipam-aam-gma)微凝胶分散液，并分别取2ml移至石英比色皿中，将光源(808nm，5.12w cm-2)与比色皿间隔2cm，记录3分钟内各材料分散液随时间的升温变化。3分钟后关闭激光器，记录材料的降温变化。作为对比，取pbs缓冲液为空白对照组，进行上述相同操作。
[0085]
为了研究fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶的热稳定性能，取2ml微凝胶溶液(0.5mg ml-1
)超声分散均匀后移至比色皿中，在激光辐射下记录在三十秒，第一分钟后的温度，随后关闭热源，记录第二分钟，第三分钟的温度。重复操作5次。
[0086]
药物装载与控制释放
[0087]
15mg fa接枝的pnag-3(命名为fa-pnag-3)超声分散在20ml pbs缓冲液中(ph 8.0)，然后加入5ml dox溶液(1mg ml-1
)，混合物在黑暗中搅拌24小时后透析除去游离的药物分子。透析液为100ml pbs缓冲液(ph 8.0)，紫外光谱测得480nm处的吸光度后，经dox标准工作曲线获得未负载的dox含量，并依此计算材料的载药率和包封率，公式如下：
[0088][0089][0090]
式中，m0和m1分别是初始所用dox质量和透析除去的dox质量，w0是载体质量。
[0091]
作为对比，称取15mg pda超声分散在ph＝8.0的pbs缓冲液中，并加入5ml dox水溶液(1mg ml-1
)，黑暗条件下搅拌24小时。反应结束后，通过pbs缓冲液离心洗涤，除去游离的药物分子，按上述相同操作计算pda的载药率和包封率。
[0092]
dox的控制释放实验在下述不同的温度、ph环境下进行：25℃，ph 5.5和ph 7.4；39℃，ph 5.5和ph 7.4。具体的说，将6ml装载dox的核壳微凝胶(0.5mg ml-1
)封装入透析袋中，并在25℃或39℃下浸没于30ml pbs缓冲液中，在规定的时间间隔内，取出3ml透析液，通过标准曲线计算释药量，并补充3ml新鲜的pbs缓冲液。作为对比，取相同药物含量的pda在25℃下进行相同的操作。此外，为了探究808nm激光辐射对药物释放的影响，分别在25℃，ph 5.5或7.4的条件下进行药物释放实验，在第60分钟，180分钟，420分钟，660分钟和780分钟时用激光器照射5分钟，取3ml透析液检测dox浓度，并补充3ml新鲜的pbs缓冲液。
[0093]
体外细胞实验
[0094]
实验所选细胞为叶酸受体高表达的hep g2肝癌细胞购自美国典型微生物菌种保藏中心(atcc)，细胞培养、细胞毒性研究以及摄取研究如下所述。
[0095]
细胞培养
[0096]
hep g2肝癌细胞购自美国典型微生物菌种保藏中心(atcc)，在加湿培养箱(37℃和5％co2)中置于含1％青霉素-链霉素和10％胎牛血清rpmi 1640培养基中生长。
[0097]
细胞毒性研究
[0098]
以hep g2肝癌细胞为模型细胞系进行mtt分析，探究游离dox和装载dox的fa-pnag-3的细胞毒性。将细胞以每孔2
×
105的密度接种在96孔板，并在37℃，5％ co2条件下温育过夜。将不同浓度的游离的dox和装载dox的fa-pnag添加到细胞中(经过计算的载药率，使得上述两组材料阿霉素的浓度相同：0.5、1、2、4、8μg ml-1
)培养24小时。将mtt(20μl，5mg ml-1
)添加到每孔中继续培养4小时，然后丢弃。加入100μl dmso溶解生成的mtt-formazan晶体，用微孔板读取器记录所得溶液在570nm处的吸光度。为了减少实验误差，实验重复三次。此外，为了证实fa-pnag-3的生物相容性，同样使用浓度为15，30，60，120和240μg ml-1
的fa-pnag-3进行上述实验。由下式计算细胞存活率(细胞培养液中未处理的hep g2肝癌细胞作为对照组)。
[0099][0100]
细胞摄取研究
[0101]
将hep g2肝癌细胞接种在6孔板(每孔密度为3
×
105)中培养16小时，用装载dox的fa-pnag-3或者pnag-3(2μg ml-1)处理细胞。hep g2肝癌细胞经过4％的多聚甲醛固定15分钟后用pbs缓冲液冲洗，并加入1ml 2μg ml-1的鬼笔环肽-fitc，经dpai染色后(1mg ml-1
，10分钟)再次用pbs缓冲液冲洗，细胞图像以荧光显微镜观察。
[0102]
结果与讨论
[0103]
红外光谱分析
[0104]
核壳微凝胶的合成过程如图1所示，多巴胺盐酸盐在碱性条件下氧化自聚为pda微球，然后利用其表面丰富的羟基官能团通过溶液-凝胶反应水解缩合正硅酸乙酯，形成sio2壳层。pda表面缺乏足够的活性官能团引发聚合反应，很难包覆上均匀的聚合物壳层，而sio2中间层可以通过羟基水解缩合引入c＝c双键官能团弥补这一缺陷。在包覆上温敏性聚合物壳层p(nipam-aam-gma)后，接枝fa，消除硅壳，获得最终产物。整个合成过程，可以通过红外光谱验证核实(图1)。图2中，pda的红外图谱显示3400cm-1
处为n-h/o-h伸缩振动峰，1620cm-1
和1508cm-1
处分别对应芳香环的伸缩振动和n-h剪切振动峰。包覆硅壳后，在1099cm-1
处的特征峰对应于pda-sio2微球的不对称si-o-si拉伸振动峰。由于pda-sio2表面含有丰富的羟基官能团，利用kh570可以在pda-sio2表面引入可聚合基团碳碳双键。在有机改性pda-sio
2-ene的红外光谱中，2940cm-1
和2881cm-1
处的吸收峰归因于c-h伸缩振动，1329cm-1
处的峰为来源于甲基丙烯酰基的-c-co-c骨架振动峰。此外，si-o-si吸收峰的减弱也证实了kh570与硅壳之间的水解缩合反应。pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶在2983cm-1
和2975cm-1
处代表c-h键的拉伸振动，吸收峰在1537cm-1
(n-h键的拉伸振动峰)、1650cm-1
(c＝o键的拉伸振动峰)和1099cm-1
(si-o-si键的拉伸振动峰)，证实了p(nipam-gma-aam)温敏层在pda-sio
2-ene表面聚合。此外，si-o-si拉伸振动峰在p(nipam-aam-gma)光谱中消失，表明sio2壳层被hf消除。
[0105]
紫外光谱分析
[0106]
如图3所示，fa在285nm处显示出特征吸收峰，pda在近红外范围内显示出较宽的等离子体吸收峰，而fa-p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶则整合了二者的特点，证实了fa接枝在经过氨基化的p(nipam-aam-gma)微凝胶表面。
[0107]
热重分析
[0108]
如图4所示，pda的重量损失约为47％，这主要是因为热解过程中的高残留率造成的。pda-sio2的质量损失则减至31％，因为硅壳具有较高的耐热性。该变化也能证实pda表面包覆了硅壳，阻碍了其热分解。硅壳表面有机改性后的pda-sio
2-ene，质量损失达到45％，说明kh570接枝率约为14％。对于核壳微凝胶fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)而言，其热重损失主要分为三阶段，250℃之前为水分的解吸脱水过程，再到450℃主要为聚合物链的分解，随后与pda-sio
2-ene几乎一致的微量损失为纳米粒子的脱羟基作用，最终质量残余12％，证实了硅壳表面存在着大量的聚合物。对于fa-pda@p(nipam-aam-gma)而言，其质量残余3.88％，不仅证实了其表面聚合物的存在，也说明了sio2壳层已被hf消除。
[0109]
形貌分析
[0110]
扫描电子显微镜和透射电子显微镜图像能够用于分析所制备材料的形貌特征，也能够进一步证实材料的合成状况。图5中a区域和图6中a区域分别为pda的扫描电镜和透射电镜图，直观显示了球形的pda具有单分散性，粒径约为156nm。当包覆上sio2壳层后，其表
面变得粗糙，尺寸约为166nm(图5中b区域、图6中b区域)。作为中间层的sio2，能够使得pda表面均匀的包覆聚合物层，如图5中c区域、d区域所示，pda-sio2@p(nipam-aam-gma)和pda@p(nipam-aam-gma)均呈现为均匀的球形，聚合物层的包覆使得材料表面变得光滑。透射电镜更能验证聚合物层的存在，如图6中c区域、d区域所示，核壳微凝胶显示出明显的核壳结构，凝胶层厚度约为35nm，当使用hf消除sio2壳层后，材料的结构未发生明显的变化，如图6中e区域所示。eds光谱可用于分析试样的元素组成和含量，如图5中e区域所示，pda@p(nipam-aam-gma)的c、n、o元素分别占41.03、23.4和35.57wt％，未能检测到si元素的存在，证实了硅壳已被hf消除。
[0111]
温敏性能分析
[0112]
温度敏感性能是核壳微凝胶进行药物控制释放的关键，通过浊点检测法和动态光散射均能检测核壳微凝胶的lcst。通过浊点检测法检测样品的lcst如图7中a区域所示，pnag-1的lcst约为31.5℃，pnag-2的lcst约为41℃，pnag-3的lcst约为38.5℃，pnag-4的lcst约为36℃，pnag-5的lcst约为34℃。如图7中的c区域所示，动态光散射能够依据样品粒径随温度的变化趋势也能得到近似的结论，证实了样品的lcst与亲水性共单体aam的含量有关。由于核壳微凝胶溶液与水分子的相互作用，聚合物壳层充分舒展，故其所测颗粒大小大于干燥条件下的tem图。pnipam依靠酰胺基团与水分子形成氢键，其lcst在32℃左右，aam的加入能够提供更多的酰胺基团，含量越高越能提高与水分子之间的氢键作用，故而lcst随aam含量增大而增大。为了验证材料能够连续进行溶胀/收缩行为，我们将透析后的pnag-3连续进行升温(高于其lcst)-降温(室温)循环，如图7中b区域所示，样品具有良好的热稳定性能。图7中d区域为透析后的pnag-3在室温和39℃下的实物图，通过肉眼也能看出材料的温敏性能。总的来说，pda@p(nipam-aam-gma)的lcst可通过aam调节，且材料具有良好的热稳定性，能够用于药物输送载体，稳定的控制释放药物。
[0113]
光热性能研究
[0114]
为了研究材料的光热转换性能，用功率为5.12w cm-2
的808nm近红外激光器照射浓度为1mg ml-1
的pda、pda-sio2、fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶和fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶分散液，记录材料暴露在激光下(激光开)和自然冷却时(激光关)温度随时间的变化，如图8中a区域所示，空白对照组pbs缓冲液在激光辐射3分钟后温度大约上升了11℃，而pda则上升了60℃，具有极强的光热转换性能。sio2壳层导热系数较低，均匀包覆在pda表面后会影响材料的热传导性能，如图8中a区域里曲线b所示，pda-sio2温度上升至72℃(温差51℃)。当温敏性聚合物壳层包覆后，热传导性能进一步降低，如图8中a区域里曲线c所示，fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶在激光辐射下，3分钟内温度从20℃上升至57℃，并在12分钟后降回至23℃。当硅壳清除后，fa-p(nipam-aam-gma)微凝胶在3分钟内温度提高了44℃，证实其是一种杰出的光热材料。
[0115]
此外，我们还研究了fa-p(nipam-aam-gma)微凝胶(0.5mgml-1
)的光热转换稳定性，如图8中b区域所示，连续五次激光开-关操作的时间-温度曲线未发生衰减现象，材料具有很好的热稳定性能，能够应用于光热治疗。
[0116]
药物装载与控释研究
[0117]
pda表面含有丰富的氨基、苯基和羟基等官能团，为键合目标分子提供了大量的活性位点。将pda分散在不同ph的pbs缓冲液中检测其zeta电位，结果如图9中a区域所示，pda
的等电点约为2.9，当溶液ph高于2.9时，pda因其表面的酚基官能团去质子化而带有负电荷。据文献报道，dox的pka值约为8.3，其在ph＝8.5的pbs缓冲液中因胺基而带正电荷。在ph 8.5的pbs缓冲液中，pda通过静电相互作用、π-π堆积和疏水相互作用装载dox，其载药率为25.8％，包封率为77.5％。交联的聚合物壳层也能够提供大量的孔隙来储存药物分子，选择fa-pnag-3进行相同的载药过程，其最终载药率和包封率分别为31.6％和94.9％。
[0118]
将装载dox的pda分散在pbs缓冲液中(ph＝5.5或7.4)中测定其释放性能，如图9中b区域所示，在ph 5.5，25℃条件下，其在30小时内的累计药物释放率为36％，而在ph 7.4，25℃的条件下仅为22％，证实了pda良好的ph敏感性药物控释性能。聚合物壳层p(nipam-aam-gma)既能够提高pda的稳定性，还能赋予其温度敏感性药物控释性能。如图9中c区域所示，fa-pnag-3在ph 5.5，25℃下累计药物释放率仅为24.1％，而当温度为39℃时，其累计药物释放率则增至75.6％。温度敏感性聚合物壳层类似于开关，当温度低于其lcst时，聚合物层充分溶胀，阻碍了药物分子的传递，fa-pnag-3的药物释放仅依靠pda本身和聚合物层外围的浓差扩散，当温度升至其lcst以上时，聚合物层收缩，不仅缩短了pda释放药物的距离，且凝胶层本身装载的药物也能大量释放，大幅度提升了释药效率。在ph 7.4，25℃下以及39℃下累计释药率分别为13.6％和51.1％，与上述对比的差异主要是pda的ph敏感性所致。总的来说，fa-pnag-3具有良好的温度、ph敏感性药物控释性能。
[0119]
基于上述对材料的光热性能研究，我们进一步探讨了808nm近红外激光辐射对药物释放的影响，如图9中d区域所示，无论是在ph 5.5还是7.4的条件下，808nm激光辐射均可短时间内促进dox的快速释放。如在ph 5.5，25℃的条件下，60分钟后dox的释放率仅为6.8％，而经过激光辐射5分钟后，dox释放率提升至20.8％。这证实了材料在具有药物缓释性能的同时，可通过外部808nm激光辐射，短时间内促进药物的释放，实现按需给药，是一种杰出的药物释放载体。
[0120]
体外毒性研究
[0121]
mtt分析选用叶酸受体高度表达的hep g2肝癌细胞为研究对象，如图10中a区域所示，fa-pnag-3具有良好的生物相容性，即使浓度升至240μg ml-1
，细胞存活率仍在90％以上。在实验浓度范围内的高细胞存活率证实了载体本身的细胞毒性可忽略不计，后续毒性实验的细胞存活率仅与抗肿瘤药物dox相关。如图10中b区域所示，dox对hep g2细胞具有较高的细胞毒性，而装载dox的fa-pnag-3(根据载药率计算，使其与游离dox浓度相同)的细胞毒性明显高于游离的dox，证实了fa主动靶向性能，fa-pnag-3能够运输dox至肿瘤细胞内，使得靶向区域dox浓度较高，致使明显高于游离dox的抗肿瘤效率。
[0122]
细胞摄取研究
[0123]
因为dox本身具有红色荧光，因此通过激光共聚焦显微镜直接观察装载dox的fa-pnag-3的肿瘤选择性。图11展现了dox-fa-pnag-3和dox-pnag-3的荧光显微镜图像，分别对hep g2细胞培养3小时和6小时，dox浓度均为2μg ml-1
。对于dox-pnag-3而言，其红色荧光强度微弱，即使孵育6小时仍低于dox-fa-pnag-3的3小时，主要归因于材料无主动靶向作用。dox-fa-pnag-3的红色荧光强度较高。孵育3小时时仅有小部分被hep g2细胞摄取，随着孵育时间的增长，红色荧光信号进一步增强，因为载体能够逐渐穿过细胞膜，释放dox至细胞质内，不仅证实了fa的靶向作用，还体现了包封药物dox的累积释放。
[0124]
结论
[0125]
在该项工作中，我们设计了一种温度、ph、nir三重响应性药物运载体fa-pda@p(nipam-aam-gma)用于结合靶向化疗和热疗。pda微球具有ph响应性药物释放特性和光热转换性能，制备简单且可通过丙酮沉淀法大量提纯。动态光散射和浊点检测证实了壳层p(nipam-aam-gma)的lcst在38.5℃。相对于pda载药体的载药率25.8％、包封率77.5％而言，温敏性聚合物壳层的添加使得载药率提升至31.6％，包封率提升至94.9％。fa-pda@p(nipam-aam-gma)在ph 5.5，25℃下累积药物释放率仅为24.1％，而在ph 5.5，39℃下高达75.9％。在外部808nm激光辐射下，核壳微凝胶能够在3分钟内提高44℃，不仅满足热消融癌细胞的条件，又能短时间内促使dox大量释放。此外，mtt分析证实了载体的生物相容性，摄取实验证实了载体的靶向性。总的来说，三重响应性
[0126]
fa-pda@p(nipam-aam-gma)在药物运载领域具有广泛的应用前景。
[0127]
以上所述仅是本发明专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明专利原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明专利的保护范围。

技术特征：
1.一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶，其特征在于，包括聚多巴胺；聚多巴胺上包覆有由含c＝c双键的硅烷偶联剂、n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚得到的聚合物，且聚合物通过硅烷偶联剂的-si-o键接枝于聚多巴胺表面；以及通过酰胺键与甲基丙烯酸缩水甘油酯连接的叶酸。2.权利要求1所述的叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：将多巴胺盐酸盐在碱性条件下氧化自聚，待反应结束后提纯得pda微球；s2：将pda微球通过溶液-凝胶反应水解缩合teos，待反应结束后离心洗涤、真空干燥得pda-sio2微球；然后将pda-sio2微球分散在甲苯中后滴加硅烷偶联剂，待反应结束后洗涤、真空干燥得改性pda-sio2微球即pda-sio
2-ene微球；s3：将pda-sio
2-ene，nipam，aam，gma，mba以及sds分散在去离子水中，在氮气环境下升温，然后滴加aps和sps至体系中，待反应结束后透析除杂得pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶；s4：将pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶在一溶液中氨基功能化处理后，再将fa在另一溶液中活化处理，然后将活化后的fa通过酰胺化反应接枝在氨基功能化的pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶上，制得fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶；s5：将fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶分散在去离子水中溶胀，再加入hf水溶液，搅拌，待反应结束后透析除杂、冷冻干燥得fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶。3.根据权利要求2所述的一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶的制备方，其特征在于，步骤s1中，pda微球合成的具体方法为：将无水乙醇、氨水以及超纯水混合均匀，再加入多巴胺盐酸盐水溶液，搅拌反应，结束后提纯pda微球，冷冻干燥获得pda微球。4.根据权利要求2所述的一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶的制备方，其特征在于，步骤s2中，pda-sio2微球合成的具体方法为：将pda微球超声分散在无水乙醇中，分散均匀后滴加teos并磁力搅拌，反应结束后，离心、洗涤、真空干燥即可获得pda-sio2微球；pda-sio2微球改性的具体方法为：取pda-sio2微球超声分散在甲苯中，滴加kh570后加热、超声处理，后转移至油浴锅，磁力搅拌至反应结束，将混合物离心，并洗涤去除多余的kh570，然后将沉淀真空干燥，即得pda-sio
2-ene；pda-sio2微球改性过程中，温度控制在40-50℃。5.根据权利要求2所述的一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶的制备方，其特征在于，步骤s3中，pda-sio2@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶合成的具体方法为：将研磨粉碎后的pda-sio
2-ene，nipam，aam，gma，mba以及sds超声分散在去离子水中，氮气环境下升温至50-70℃，再依次滴加aps和sps，反应结束后冷却至室温再透析除杂，得pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶。6.根据权利要求2所述的一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶的制备方，其特征在于，步骤s4中，
pda-sio2@p(nipam-aam-gma)氨基功能化处理的具体方法为：将研磨粉碎后的pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶粉在pbs缓冲液中超声分散均匀，加入ea，将混合物在室温下磁力搅拌即得氨基功能化的微凝胶；fa活化的具体方法为：将fa超声分散在pbs缓冲液中，然后依次加入edc，nhs活化10-20分钟；接枝的具体方法为：用naoh溶液将活化溶液ph调至7.2-7.4，然后快速加入至氨基功能化溶液中反应；反应结束后，透析除杂，冷冻干燥即得fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶。7.根据权利要求2所述的一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶的制备方，其特征在于，步骤s5中，fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶合成的具体方法为：将研磨粉碎后的fa-pda-sio2@p(nipam-aam-gma)微凝胶粉超声均匀分散在去离子水中，溶胀后加入hf水溶液，磁力搅拌反应，然后透析除杂，冷冻干燥即得fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶。8.权利要求1所述的叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶在制备体外药物控释药物中的应用。9.根据权利要求8所述的叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶在制备体外药物控释药物中的应用，其特征在于，所述叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶上装载有抗肿瘤药物阿霉素dox。10.根据权利要求9所述的叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶在制备体外药物控释药物中的应用，其特征在于，所述叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶上装载有抗肿瘤药物阿霉素dox的具体方法为：将fa-pda@p(nipam-aam-gma)核壳微凝胶超声分散在pbs缓冲液中，然后加入dox溶液并搅拌反应，结束后透析除去游离的药物分子。

技术总结
本发明公开了一种叶酸接枝的聚多巴胺@温敏性聚合物核-壳微凝胶、制备方法及其在制备体外药物控释药物中的应用。所述的核壳微凝胶用于靶向输送抗肿瘤药物DOX，包括PDA核层、P(NIPAM-AAm-GMA)壳层和接枝于壳层表面的靶向分子FA。P(NIPAM-AAm-GMA)壳层有着亲水性的聚合物网络和大量的孔隙，不仅能够增强PDA的生理稳定性，还能够赋予其温度敏感性药物释放的特性，优化了PDA的药物控释性能；FA接枝在P(NIPAM-AAm-GMA)壳层上，使其能够识别叶酸受体过度表达的肿瘤细胞，提高其抗肿瘤效果。提高其抗肿瘤效果。提高其抗肿瘤效果。


技术研发人员：李小荣 仲慧 刘易鑫 丁涟沭 程志鹏 刘磊 张晨晖 邱膑莹
受保护的技术使用者：淮阴师范学院
技术研发日：2023.03.20
技术公布日：2023/8/1