一种调控乙烯受体RhETR3降解的基因及应用

一种调控乙烯受体rhetr3降解的基因及应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种调控乙烯受体rhetr3降解的基因及应用。


背景技术：

2.植物开花是高等植物由营养生长向生殖生长转变的过程，是个体发育和后代繁衍的中心环节。这一发育的转变是植物体自身的发育条件和外部环境因素共同决定的。在对模式植物特定基因人工突变研究的同时，人们对天然早花突变体也进行了大量的研究。对天然早花突变体的研究丰富了人们研究植物春化作用机理和成花过程的手段和内容，同时对于完善和推进植物春化作用机理的研究有着重要的意义。对模式植物拟南芥开花的生理学和遗传学研究表明，影响植物开花的因素主要分为四个途径：光周期途径、激素途径、自主途径和春化作用途径。
3.月季是花卉产业中最重要的作物之一，被广泛用做切花、盆花和庭院花卉，是花卉产业中举足轻重的作物。月季的经济价值往往从其花朵的品质上体现出，而在运输途中出现异常开花、早花等问题会使月季失去价值，从而造成经济损失。
4.在采后流通环节中，环境中的乙烯和运输过程中花朵自身产生的乙烯往往是造成月季花朵开放异常的主要原因，造成严重的采后损耗。据统计，因乙烯所导致的品质劣变约占采后生理性损耗的70％以上。
5.影响植物开花的激素途径中，乙烯具有重要的作用。不同于如赤霉素等激素参与到植物生长调节中，乙烯不会直接参与调控花朵的开放，而是通过让花朵感知乙烯后开放。现有研究结果显示，月季中调控花朵开放的基因存在：两个乙烯受体(rhetr1、rhetr3)和两个ctr基因(rhctr1、rhctr2)。
6.由于月季中涉及乙烯调控路径的研究较少，因此首先根据拟南芥中乙烯突变体的筛选，结合遗传上位分析构建乙烯信号转导的基本途径。乙烯受体是乙烯信号通路的首要环节，是乙烯信号通路的负调控因子。拟南芥中研究发现，家族ii乙烯受体atetr2受乙烯诱导表达，但是在100ppm下，etr2蛋白被降解；番茄6个受体基因中，leetr3/nr、leetr4和leetr6基因的表达量在果实成熟过程中升高，并且高浓度乙烯处理促进其表达。但leetr3/nr、leetr4和leetr6蛋白的含量在成熟过程中持续下降，乙烯处理导致这3种受体蛋白的进一步降解；烟草中200μm chx处理，促进nthk1蛋白降解，且这种降解能够被mg132抑制。由此推测，泛素-蛋白酶体降解系统在依赖于乙烯的乙烯受体稳定性调节中发挥了关键的作用。
7.家族ii乙烯受体rhetr3是花朵开放过程中响应乙烯的主要受体，随着花朵开放，rhetr3表达量逐渐升高，但其蛋白水平逐渐降低，且乙烯诱导rhetr3表达的同时，加速了其蛋白的降解，且这种降解能够被mg132抑制，这表明rhetr3通过26s蛋白酶体途径，但是关于其如何被泛素化修饰降解，进而影响月季花朵的乙烯敏感性尚不清楚。
8.由于我国幅员辽阔，而且切花月季进口和出口量大，使得从生产地产生的鲜切花月季往消费地运输时需要冷链远距离运输，影响了切花月季尤其是离开母体的月季切花的
正常开放，经常发生“僵花”现象。因此，研究乙烯调节的花朵开放机理，进而用于保持切花月季的观赏价值具有重要意义。基于此，本发明提供一种调控乙烯受体rhetr3降解的基因rhubc32，该基因能够影响植物感知乙烯的通路从而改变植物对乙烯的敏感度。通过降低植物对乙烯的敏感度而增加植物在运输途中受到乙烯的影响，避免植物在离开母体后受自身激素或外界激素的影响而发生早开花或异常开花的情况。
9.此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。


技术实现要素：

10.针对现有技术之不足，本发明提供一种调控乙烯受体rhetr3降解的基因rhubc32。所述基因序列为seq id no.1。乙烯受体是感受乙烯的关键蛋白，在植物乙烯敏感性决定和乙烯信号调节中起到了关键作用。月季切花是一种对乙烯非常敏感的观赏作物，其生长发育和采后花朵开放衰老均受到乙烯的显著影响。本发明提供一种改变植物对乙烯敏感性的基因，并探明其于植物中的作用。通过对植物的该基因的分子调节，发现被调节后的植物对乙烯的敏感度显著提高或降低，从而延长或缩短其开花时间。通过对该基因的微观调节或观察，发现该基因能够通过降低植物的乙烯敏感度或筛选植物的乙烯敏感度而降低异常开花植物的存在。
11.本发明提供一种调控乙烯受体rhetr3降解的蛋白rhubc32。所述蛋白的氨基酸序列为seq id no.2。
12.本发明提供一种培育具有乙烯高敏感表型的植株的方法。方法包含：
13.在包含所述基因的编码区选取500bp片段，将所述靶标片段插入到pfgc1008载体，获得沉默载体；使用所述沉默载体转化农杆菌，获得含所述沉默载体的农杆菌基因工程菌；将所述农杆菌基因工程菌侵染月季胚性愈伤组织，获得所述基因低表达的突变体株系。
14.根据一种优选实施方式，用于克隆正向所述靶标片段的引物的核苷酸序列为seq id no.37和seq id no.38。
15.根据一种优选实施方式，用于克隆反向所述靶标片段的引物的核苷酸序列为seq id no.39和seq id no.40。
16.本发明提供一种具有乙烯高敏感表型的蔷薇科植物。所述基因于所述蔷薇科植物中低表达。
17.本发明提供一种具有乙烯高敏感表型的蔷薇科植物。所述基因编码的蛋白于所述蔷薇科植物中低表达。
18.本发明提供含有所述基因的生物材料。优选地，所述生物材料为表达载体。优选地，所述生物材料为菌株。
19.根据一种优选实施方式，所述表达载体能够为ptrv2载体。
20.根据一种优选实施方式，所述菌株能够为农杆菌。
21.根据一种优选实施方式，所述蔷薇科植物能够为月季、玫瑰、苹果或梨。
22.本发明提供所述的调控乙烯受体rhetr3降解的基因rhubc32于如下方面的应用：
23.(1)调控植物花朵开放、衰老进程；
24.(2)调控乙烯促进的植物花朵开放；
25.植物激素乙烯调控多种植物生长和发育进程，参与了植物的衰老，如加速叶片和花朵衰老、果实成熟及器官脱落。根据一种优选实施方式，由于本发明提供的基因能够参与调控植物对乙烯的敏感度，因此，受乙烯影响而产生的植物生长状态则同样会因为本发明提供的基因的表达量的不同而发生改变。
26.根据一种优选实施方式，具体应用时，将含有所述调控乙烯受体rhetr3降解的基因rhubc32的植物的表达载体导入月季细胞或种子，使所述基因在月季中超表达，从而获得具有明显的花朵花期延长的转基因植株。
27.rhetr3是月季花朵感受乙烯的关键受体。本发明以pbt-ste-rhetr3为诱饵进行分裂泛素化文库筛选，得到一个泛素结合酶rhubc32。酵母双杂交分析、荧光双分子互补分析(bifc)、荧光共定位分析和免疫共沉淀(co-ip)分析表明rhubc32与rhetr3共定位于脂膜，结合域为跨膜域。烟草叶片中瞬时过表达rhubc32与rhetr3基因，加速了rhetr3蛋白的降解，乙烯促进其降解且这种降解过程能够被mg132抑制。将rhubc32 ubc结构域中推定的活性位点突变后(rhubc32
c92-a
)则失去了对rhetr3的降解能力。蛋白结构分析表明，rhubc32具有典型的ubc结构域。体外泛素活性分析表明，rhubc32具有泛素结合酶活性。rhubc32基因受乙烯显著诱导表达，且随着花朵的开放，表达量逐渐升高，在5级花中表达量达到最高。在月季中沉默rhubc32基因的表达，乙烯处理后，沉默植株中出现花瓣脱落和畸形外翻等乙烯超敏感表型的花朵占95％，明显高于trv2对照组的39％，月季花朵乙烯敏感性显著增加。rhubc32 rnai稳定转基因的月季中，分枝数显著高于野生型，2级花朵中乙烯响应基因rhebf2的表达显著高于对照组，月季花朵乙烯处理，rhetr3蛋白表现出积累，花瓣脱落，表现出乙烯超敏感的表型。在本技术中，5级花指代完全开放的花朵。
28.上述研究揭示了rhubc32基因在乙烯调控的花朵开放中的作用，为调控植物花朵开放尤其是月季鲜切花的花朵开放提供了新的思路和技术手段，具有重大的学术价值和重要的生产应用前景。本发明提供的所述基因和所述基因的应用能够为月季异常开花的研究提供分子生物学的依据。
附图说明
29.图1a为rhubc32蛋白序列分析图；
30.图1b为rhubc32进化树示意图；
31.图2a为分裂泛素化文库结果图；
32.图2b为rhubc32亚细胞定位结果图；
33.图2c为bifc分析rhetr3与rhubc32互作的结果图；
34.图2d为mh2y分析rhetr3与rhubc32互作的结果图；
35.图2e为co-ip方法分析rhubc32与rhetr3互作的结果图；
36.图3a为rhubc32表达模式分析图；
37.图3b为rhubc32泛素结合酶活性体外分析图；
38.图3c为rhubc32泛素结合酶活性半体外分析图；
39.图4a为rhubc32与rhetr3共表达结果图；
universal qrt-pcr试剂盒(kapa biosystems)进行qrt-pcr反应(含有1μl cdna模板的20μl体积)，其中，月季rhubi基因(genbank登录号jk622648)作内参基因；
71.每个反应进行三次生物学重复，并通过熔解曲线分析验证；
72.所有反应用至少进行三次生物学重复。
73.pcr引物列于表1中。qrt-rhubc32基因引物序列为seq id no.9和seq id no.10。qrt-rhubi2基因引物序列为seq id no.11和seq id no.12。
74.4、烟草注射
75.将携带目的基因的农杆菌，用侵染液重悬，调od
600
＝1.5，沉默抑制子p19调浓度od
600
＝1.0；
76.根据实验需要，等体积混匀，室温静置3h；
77.选择长势良好、深绿、肥厚的叶片，用1ml注射器进行注射，直至整个叶片充满菌液；
78.注射3d后取样，提取总蛋白或存放在-80℃，用于后期实验。
79.5、rhubc32体内促进rhetr3蛋白降解
80.rhetr3-flag分别与rhubc32-gfp、rhubc32
c93a-gfp、super1300-gfp以不同比例共注射烟草，表达3d；
81.取样，提取总蛋白，检测rhetr3-flag蛋白水平。
82.6、共定位实验方法
83.rhubc32-gfp分别与rhetr3-mcherry，pm-mcherry等体积混匀；
84.共浸染烟草叶片，用于亚细胞定位；
85.共注射烟草叶片3d后，荧光共聚焦显微镜下观察叶片荧光。
86.rhetr3-1300的引物序列为seq id no.23和seq id no.24。
87.rhubc32-1300c的引物序列为seq id no.25和seq id no.26。
88.rhubc32的点突引物序列为seq id no.35和seq id no.36。
89.7、双分子荧光互补实验(bifc)
90.将rhetr3-yne(r)、rhubc32-yce(m)、pyce(m)载体及沉默抑制子p19分别转农杆菌gv3101；
91.将含有目的质粒的农杆菌，中摇(10ml)过夜培养，5000rpm，8min集菌；
92.用烟草侵染液调od
600
＝3.0，rhetr3-yne(r)分别与其他yce(m)菌等体积混匀，28℃，200rpm摇3h后注射烟草；
93.光下培养1.5d后，荧光共聚焦显微镜下观察荧光。
94.rhubc32-bifc的引物序列为seq id no.19和seq id no.20。
95.rhetr3-bifc的引物序列为seq id no.21和seq id no.22。
96.8、免疫共沉淀(co-ip)
97.rhetr3-flag分别与rhubc32-gfp、super1300-gfp共注射烟草，表达3d后，取样，液氮研磨，用2
×
sds蛋白上样buffer提取烟草叶片总蛋白；
98.分别用anti-flag和anti-gfp抗体wb检测两个目的基因蛋白是否表达，当两个标签蛋白都能检测到目的条带后，说明两个蛋白均表达，可进行后面操作；
99.按照每1ml材料中加入800μl非变性蛋白提取buffer提取总蛋白，每个组合提取3
管蛋白备用；
100.吸取anti-flag-flag m2 magnetic beads 20μl放入1.5ml离心管内，加入5倍体积tbs；
101.充分混匀后，将离心管放在磁力架上，静置15s左右，除去tbs buffer；
102.向beads内加入5倍体积的tbs，充分混匀；
103.将离心管放置在磁力架上，吸掉tbs buffer，重复2～3次；
104.向带beads的离心管内，加入1.2ml总蛋白(如果目的蛋白浓度较低，可将beads分两管，每个离心管内均加入1.2ml总蛋白)；
105.室温慢慢混匀，如果两个蛋白互作会发生降解，可在总蛋白中加入50μm mg132；
106.室温孵育1h后，将离心管放置在磁力架上，静止15s(beads充分的被吸附在管壁)后，用移液器移除上清；
107.tbs buffer清洗beads除去非特异结合的蛋白，加入20倍beads体积的tbs buffer，洗3次；
108.加入100μl 2
×
sds蛋白上样buffer，沸水煮10min变性；
109.分别用anti-flag和anti-gfp抗体检测目的蛋白。
110.9、酵母双杂交
111.酵母菌株mny51在ypda板上划线，30℃培养3d；
112.挑取4～5个单克隆与10ml ypda培养基内，28℃，200rpm过夜培养；
113.3000rpm，5min集菌；
114.加入10ml无菌水重悬酵母菌株；
115.3000rpm，5min；10ml无菌水重悬，分装到1.5ml离心管，每管1ml菌液；
116.6000rpm离心5min；
117.弃上清用100μl one-step buffer重悬；
118.加入6μl鲑鱼精dna(使用之前，沸水煮5min，冰浴5min；重复一次后可以使用)；
119.将含有目的基因的两个质粒各500ng加入到感受态细胞内，混匀，做好标记；
120.45℃水浴30min，每间隔10min涡旋一次；
121.转化后产物分别涂在在二缺sd-leu-trp和四缺sd-leu-trp-his-ade板上，30℃培养2～3天，观察酵母长势。
122.rhetr3-ste的引物序列为seq id no.13和seq id no.14。
123.rhetr3-ste-tm r的引物序列为seq id no.15。
124.rhetr3-ste
‑△
tm f的引物序列为seq id no.16。
125.rhubc32-pr3n的引物序列为seq id no.17和seq id no.18。
126.10、重组蛋白在原核细胞中的表达
127.将含有sac i和sal i位点的rhubc32 orf克隆到pet28a-his-myc载体上，以获得pet28a-his-myc-rhubc32载体，用于his-myc-rhubc32蛋白纯化；
128.将目的质粒转入诱导型大肠杆菌transata，挑取12个单克隆，菌p检测，确定单克隆中含有目的质粒；
129.鉴定正确的单克隆菌株吸取2.5％菌液加入到含有200ml含有相关抗性的lb的2ml离心管内，37℃，200rpm培养3h；
130.加入0.4mm iptg，16℃过夜诱导培养；
131.8000rpm，4℃，5min，收集菌体；
132.his蛋白重悬液lysis buffer重悬菌；
133.菌液重悬后用超声破碎仪破碎，9.9s开，9.9s关，15min；
134.破碎后菌液4℃，10000rpm，40min离心；
135.取上清，直接进行蛋白纯化。
136.rhubc32-pet28a myc的引物序列为seq id no.27和seq id no.28。
137.11、his融合蛋白纯化
138.20％酒精提前润洗垫片，赶走里面的空气，按照100μl his resin/100ml菌液，加入一定量的his resin在含有垫片的柱子内；
139.20％酒精过3个柱体积，清洗填料；
140.用binding buffer预洗柱子，3个柱体积；
141.蛋白上清重悬resin，并倒入干净三角瓶内，60rpm，冰浴1h以上；
142.收集resin，wash buffer洗柱子，3个柱体积；
143.洗脱：柱子内加入2ml洗脱液i，反应3～5min，收集洗脱液；
144.向柱子内加入2ml洗脱液ii，反应3～5min，收集洗脱液；
145.加入2ml洗脱液iii，反应3～5min，收集洗脱液；
146.纯化后蛋白，跑蛋白胶检测浓度，分装-80℃保存。
147.12、泛素结合酶e2活性分析
148.向1.5ml离心管内加入50ng e1(拟南芥e1纯化蛋白)，100ng e2(纯化蛋白带his和myc标签)，1μl 20
×
reaction buffer，2μl纯化的his-ub(约2μg/μl)，加ddh2o至总体积为20μl；
149.每种e2同时做4管，两管含有ub，两管不含ub，37℃，900rpm反应5min；
150.结束后，加入4μl 5
×
sds loading buffer，其中每组各有一管加入+dtt(含β-巯基乙醇)和-dtt两种；
151.100℃煮沸6min，用anti-ub和anti-myc抗体检测e2是否加上ub。
152.13、荧光素酶互补分析
153.将含有bamh i和spe i位点的rhetr3 orf克隆到pcambia-nluc载体上，以获得rhetr3-nluc载体；
154.将含有bamh i和spe i位点的rhubc32 orf克隆到pcambia-cluc载体上，以获得rhubc32-cluc载体，并转化农杆菌；
155.将分别转化有rhetr3-nluc与rhubc32-cluc的农杆菌以不同比例混匀，室温静置3h，注射烟草，光下继续培养3d后，取下叶片，用双面胶固定在白色a4纸上，背面朝上，均匀喷施荧光素，黑暗处理5min后，通过荧光测定仪检测是否有荧光产生。
156.nluc-rhetr3的引物序列为seq id no.29和seq id no.30。
157.cluc-rhubc32的引物序列为seq id no.31和seq id no.32。
158.14、病毒诱导的基因沉默
159.rhubc32基因的3’末端507bp片段插入ptrv2载体中构建成ptrv2-rhubc32；
160.将ptrv1，ptrv2，ptrv2-目的片段，转化农杆菌gv3101；
161.挑取单克隆至含有5ml抗性lb培养液的50ml离心管，28℃，200rpm过夜摇菌；
162.用ptrv1和ptrv2的载体引物，pcr检测菌液中是否含有目的质粒；
163.检测正确的农杆菌按1:100稀释比例进行大摇，500ml三角瓶中加入100ml lb含抗生素的及1ml菌液，28℃过夜培养；
164.5000rpm、8min离心弃上清，收集菌液，利用侵染液重悬菌，调od
600
＝1.0；
165.将ptrv1菌液分别与ptrv2、ptrv2-目的基因片段等体积混匀，每组约300-500ml菌液；
166.黑暗静置3～6h，备用。
167.将在组培瓶内生根4周的苗子在瓶子内取出，按照大小进行分组，12棵一组，等分给各组菌；
168.用纱布包裹好分好组的组培苗，浸没在菌液内，在苗子上方放一个研钵，以免抽真空过程中苗子飘在侵染液上；
169.抽真空，当压强达到0.8个大气压后，保压5min，慢慢放气；
170.重复一次，第三次，压强达到1.0个大气压后保压5min，慢慢放气，使菌液能够进入月季苗子内；
171.侵染结束后，在自来水上冲洗，洗掉多余菌液；
172.将小苗子放置在带线的小盆内(根部在水里，茎叶在空气中)，用保鲜膜包裹，保持湿度；
173.8℃黑暗放置3d；
174.3d后将组培苗种在含有蛭石和营养土(1:1)的小盆中，用塑料膜盖住保湿一周，置于培养室内培养；
175.生长一个月后，热硼法提取沉默植株叶片的总rna，反转录，检测cp基因，确定沉默载体是否进入苗子内；
176.将含有cp基因的材料用基因检测引物检测基因的表达水平，挑选出表达量较低的植株，进行后续实验。
177.rhubc32-trv2的引物序列为seq id no.33和seq id no.34。
178.trv1的引物序列为seq id no.3和seq id no.4。
179.trv2的引物序列为seq id no.5和seq id no.6。
180.trv-cp的引物序列为seq id no.7和seq id no.8。
181.15、rhubc32 rnai稳定转基因月季
182.rhubc32构建ptrv2载体的405bp序列通过asc i/swa i，pac i/bam hi位点，将其正向及反向序列连入pfgc1008载体中；
183.将含有rnai质粒的eh105a农杆菌，用重悬液重悬至od
600
＝0.6，28℃，200rpm，2h后放入月季胚性愈伤组织，抽真空，当压强达到0.8个大气压后，保压5min，慢慢放气；
184.重复一次后，28℃180ppm培养40min后，弃侵染液，用无菌吸水纸吸干胚性愈伤组织表面的菌液，放入共培养培养基中，暗下培养；
185.3d后，将愈伤组织转移至选择增殖培养基，每两周更换一次培养基，选择增殖2个月后，将抗性的愈伤组织转移至选择萌发培养基，两周更换一次培养基，筛选2月后，每4周更换一次培养基；
l-1
的6-ba、60g l
–1的葡萄糖、2.5g l
–1gel、100mg l-1
的水解络蛋白和100mm as混合。
208.根据一种优选实施方式，增殖培养基配置方法为：ms、1.0mg l-1
的2,4-d、0.05mg l-1
6-ba、60gl-1
葡萄糖、2.5g l
–1gel、20mg l-1
hygromycin b、300mg l-1
cef混合。
209.根据一种优选实施方式，萌发培养基配置方法为：ms、1.0mg l-1 6-ba、0.05mg l-1
naa、1.0mg l-1
ga3、0.1mg l-1
ch、30g l-1
葡萄糖、7.0g l-1
琼脂、20mg l-1
hygromycin b、300mg l-1
cef混合。
210.根据一种优选实施方式，10ml one-step buffer(现用现配)配置方法为：2ml 10x liac(1n)、8ml 50％ peg3350、76.9μlβ-巯基乙醇混合。
211.实施例1
212.本实施例提供一种rhubc32基因克隆的方法。本发明提供一种泛素结合酶基因克隆的方法。
213.本发明以rhetr3为诱饵，对月季分裂泛素化酵母双杂文库进行了筛选，共获得了245个克隆。经序列比对和酵母回转验证，共得到28个确定的阳性克隆，并自其中获得一个泛素结合酶rhubc32(ru05948)，如图2a所示。
214.通过多重序列比对，得到了ru05948的全长，根据基因注释命名为rhubc32。rhubc32的基因全长共1170bp，orf为912bp，编码303aa。通过smart蛋白序列分析程序，如图1a所示，rhubc32蛋白n端有一个保守的ubcc结构域(13-128位氨基酸)，该结构域的序列为图中带有下划线的序列。rhubc32蛋白c端有一个可能的跨膜区(269-289位氨基酸)，该跨膜区的序列为图中灰色框标记的序列。
215.如图1b所示，系统进化树显示rhubc32与拟南芥ubc32之间的位置最近，证明rhubc32与拟南芥ubc32同缘关系最近。该结果表明rhubc32属于ubc家族。
216.实施例2
217.本实施例提供一种rhubc32基因与rhetr3基因的关联检测方法。
218.通过双分子荧光互补(bifc)、分裂泛素化酵母双杂交(myth)以及co-ip三种试验验证了rhubc32与rhetr3之间存在互作。
219.rhubc32-gfp分别与rhetr3-mcherry、er-mcherry在烟草中共表达，通过confocal荧光显微镜观察荧光，进行共定位实验分析。如图2b所示，rhubc32-gfp绿色荧光能够与质膜marker红色荧光完全重合，表明rhubc32定位在质膜，属于膜定位蛋白；且其绿色荧光也可与rhetr3-mcherry红色荧光重合，说明rhubc32和rhetr3共定位，在植物体内可能存在相互结合。
220.如图2c所示，乙烯受体rhetr3蛋白有4个结构域，分别是n端跨膜域(transmembrane)、gaf域(gaf)、组氨酸激酶域(histidine kinase)和接收域(receiver)。
221.如图2c所示，在将rhetr3进行短截并分为跨膜域和去跨膜域两部分后对rhetr3两部分进行了验证。rhubc32-pr3n与rhetr3-ste共转酵母mny51，能在二缺板sd-tl上生长，这表明质粒转化酵母成功。在四缺板sd-tlha上，rhetr3-ste与rhubc32-pr3n能够生长，随着酵母菌液的稀释，菌斑依旧可以生长，能够被x-gal染成蓝色，而负对照rhetr3-ste与空载pr3n在四缺板上不会生长，即rhetr3在酵母中与rhubc32存在互作，且其结合发生在rhetr3跨膜域。
222.bifc体内验证结果显示，rhubc32与rhetr3蛋白能够在体内结合。如图2d所示，在
荧光共聚焦显微镜下可以看到绿色荧光，且荧光位于细胞膜，rhetr3-yne(r)与空载pspyce(m)未看到荧光。该结果表明rhetr3与rhubc32在植物体内相互作用。
223.如图2e所示的rhubc32-gfp与rhetr3-flag共注射烟草的结果，三个蛋白均有表达，rhetr3-flag与rhubc32-gfp共表达样品中用anti-flag beads免疫沉淀(ip)后，gfp抗体可以检测到rhubc32-gfp蛋白，而负对照super1300-gfp中ip后蛋白未检测到条带，这表明rhetr3与rhubc32在体内存在结合。但是rhetr3-flag ip后蛋白量较input总蛋白减少很多，可能是在ip过程中，随着rhetr3和rhubc32蛋白浓度的增加，加速了对rhetr3蛋白的降解。
224.实施例3
225.本实施例提供一种rhubc32基因表达量的检测方法。
226.通过qrt-pcr方法检测了rhubc32对乙烯的响应及在花朵开放过程中的变化。
227.如图3a所示，3级花朵的rhubc32表达量高于2级花朵的rhubc32表达量。5级花朵的rhubc32表达量高于3级花朵的rhubc32表达量。在自然开放过程中，rhubc32表达逐渐升高。如图3a所示，乙烯处理24h后，rhubc32表达量(eth)显著高于对照组(control)。
228.如图3b所示，与在未加泛素或加入泛素但体系中有dtt的对照反应中，没有检测到rhubc32与泛素结合的条带；而加入泛素未加dtt的泳道内可检测到泛素化条带(如图中箭头所指条带)，证明了rhubc32具有e2结合酶活性。
229.如图3c所示，烟草中瞬时过表达的rhubc32-flag蛋白也得到了一样的结果。与在未加泛素或加入泛素但体系中有dtt的对照反应中，没有检测到rhubc32与泛素结合的条带；而加入泛素未加dtt的泳道内可检测到泛素化条带(如图中箭头所指条带)，证明了rhubc32具有e2结合酶活性。
230.实施例4
231.本发明提供一种泛素结合酶e2活性的分析方法。本发明提供一种rhubc32促进rhetr3蛋白降解的方法。本发明还提供一种rhubc32促进rhetr3蛋白降解的展示方法。
232.将rhetr3-flag分别rhubc32-gfp，supper1300-gfp与在烟草叶片中共表达，检测rhetr3-flag蛋白。如4a左侧电泳图所示，在rhubc32和rhetr3同时存在的情况下，rhetr3条带亮度高于不与rhubc32混合的rhetr3条带亮度，该结果说明在没有乙烯存在的情况下，rhubc32能够促进rhetr3蛋白的降解。如4a右侧电泳图所示，10ppm乙烯处理，在rhubc32和rhetr3同时存在的情况下，rhetr3条带亮度高于不与rhubc32混合的rhetr3条带亮度，该结果说明在没有乙烯存在的情况下，rhubc32能够促进rhetr3蛋白的降解。同时，没有乙烯存在的rhubc32和rhetr3混合的泳道的亮度高于10ppm乙烯处理下的rhubc32和rhetr3混合的泳道，该结果说明乙烯加速了rhetr3蛋白的降解。上述结果表明rhubc32能够促进rhetr3蛋白降解，且乙烯处理能够加速受体的降解速率。
233.如图4b所示，以第一列的泳道作为阴性对照，添加mg132的第三列的泳道的蛋白亮度比未添加mg132的第二列的泳道的蛋白亮度高。该结果表明，当添加mg132后，rhubc32促进rhetr3降解的现象能够被抑制。
234.图4c结果显示，rhubc32 ubc结构域活性位点突变体rhubc32
c93-a
与rhetr3混合的第二列的条带亮度大于rhubc32和rhetr3混合的第一列的条带亮度。该结果说明，rhubc32 ubc结构域活性位点突变体rhubc32
c93-a
失去了对rhetr3的降解能力。上述结果表明rhetr3
通过26s蛋白酶体erad途径被降解。
235.双荧光素酶结果表明，如图4d所示，a图亮度高于b、c和d图。随着rhetr3-nluc与rhubc32-cluc比例的增加，rhubc32-cluc的量逐渐增加后，luc荧光强度逐渐减弱。该结果说明rhetr3与rhubc32蛋白在体内互作，且这种互作结合后加速了rhetr3的降解，致使luc荧光强度变弱。
236.实施例5
237.本发明提供一种对乙烯高敏的月季植株的构建方法。本发明提供一种利用乙烯培育月季的方法。本发明提供一种乙烯促进季花朵开放的表型检测方法。
238.将rhubc32 328-3～utr区域500bp的序列连接到病毒沉默载体ptrv2载体上，载体结构如图5a所示。
239.如图5b所示，rhubc32沉默的月季植株中rhubc32基因条带(trv-rhubc32对应的1、2、3电泳条带)亮度低于转化空载trv的月季植株中rhubc32基因条带(trv对应的1、2、3电泳条带)亮度。以rhubi2为阴性对照，rhubc32沉默的月季植株中rhubc32基因表达量显著低于对照trv2植株，沉默效果明显。
240.2级状态的花朵表现为萼片全部展开，花苞紧闭。
241.用10ppm乙烯处理处于2级状态的花朵24h后，观察沉默植株花朵及trv2对照植株花朵的开放程度。根据花朵的开放程度，分为花瓣脱落和翻卷、全开、半开和不开四种程度，进行了统计。图5c示出rhubc32沉默植株与正常植株在乙烯处理后的花朵表型。如图5d所示，乙烯处理后脱落和翻卷的花朵在rhubc32沉默植株中占95％，显著高于trv2对照组的39％，即沉默组植株的乙烯敏感性增加。
242.本发明还涉及1个rhubc32 rnai载体，通过农杆菌介导的转基因技术获得稳定转基因植株。通过qrt-pcr分析，如图6a所示，获得2个rhubc32低表达株系，rhubc32-rnai#18和rhubc32-rnai#22。
243.如图6b所示，低表达植株的分枝数高于野生型。
244.如图6c所示，乙烯处理24h后，相较于野生型(wt)，rhubc32-rnai#18和rhubc32-rnai#22的花朵花瓣脱落至仅剩1片花瓣。该表型表明rhubc32-rnai转基因植株的乙烯敏感性增加，与rhubc32 vigs沉默植株一致。
245.如图6d所示，10ppm乙烯处理3h后，相较于野生型，rhubc32-rnai#18和rhubc32-rnai#22中的乙烯响应基因rhebf2显著增加。如图6e所示，在乙烯诱导3h后，rhubc32-rnai#18相较野生型rhetr3蛋白条带更亮。野生型的结果表明rhubc32能够促进rhetr3蛋白降解，且乙烯处理能够加速受体的降解速率。rhubc32-rnai#18的结果表明乙烯诱导了rhetr3蛋白的积累，抑制了乙烯对其降解。
246.表1
247.[0248][0249][0250]
需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开
内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”、“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。在全文中，“优选地”所引导的特征仅为一种可选方式，不应理解为必须设置，故此申请人保留随时放弃或删除相关优选特征之权利。

技术特征：
1.一种调控乙烯受体rhetr3降解的基因rhubc32，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为seq id no.1。2.一种调控乙烯受体rhetr3降解的蛋白rhubc32，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为seq id no.2。3.一种培育具有乙烯高敏感表型的植株的方法，其特征在于，包含：在包含所述基因的编码区选取500bp片段，将所述靶标片段插入到pfgc1008载体，获得沉默载体；使用所述沉默载体转化农杆菌，获得含所述沉默载体的农杆菌基因工程菌；将所述农杆菌基因工程菌侵染月季胚性愈伤组织，获得权利要求1所述基因低表达的突变体株系。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用于克隆正向所述靶标片段的引物的核苷酸序列为seq id no.37和seq id no.38。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用于克隆反向所述靶标片段的引物的核苷酸序列为seq id no.39和seq id no.40。6.含有权利要求1所述基因的表达载体。7.含有权利要求1所述基因的菌株。8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于，所述菌株能够为农杆菌。9.权利要求1所述的调控乙烯受体rhetr3降解的基因rhubc32于如下方面的应用：(1)调控植物花朵开放、衰老进程；(2)调控乙烯促进的植物花朵开放。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，具体应用时，将含有所述调控乙烯受体rhetr3表达的基因rhubc32的植物的表达载体导入月季胚性愈伤组织，使所述基因在月季中超表达，从而获得具有明显的花期延长表型的转基因植株。

技术总结
研究乙烯调节的花朵开放机理，进而用于保持切花月季的观赏价值具有重要意义。本发明提供一种调控乙烯受体RhETR3降解的基因及应用。所述基因和所述基因的应用能够为月季早晚花筛选和定向培育提供依据和方向。所述基因序列为SEQ ID NO.1。通过对植物的该基因的分子调节，能够显著提高或降低植物对乙烯的敏感度，从而延长或缩短植物的开花时间。通过对该基因的微观调节或观察，能够通过降低植物的乙烯敏感度或筛选植物的乙烯敏感度而降低异常开花植物的存在。植物的存在。植物的存在。


技术研发人员：马男 赵清翠 周晓锋 高俊平 杨若昀 赵嘉欣 符茜佳
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.03.20
技术公布日：2023/8/1