艾叶来源外泌体样纳米囊泡及其应用和药物的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种艾叶来源外泌体样纳米囊泡及其应用和药物。


背景技术：

2.随着人口老龄化的加剧和人们不合理的饮食方式，糖尿病的发病率逐年上升。糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。不同地区人们对糖尿病的认识、治疗和控制存在很大差异。最近，发表于bmj杂志的中国人群糖尿病患病率的最新全国流行病学调查结果显示，我国糖尿病总体患病率为12.8％，糖尿病前期患病率为35.2％，地域之间存在明显的差异。糖尿病是由于胰岛素相对或绝对缺乏而引起的以慢性高血糖为主要特征的一组内分泌代谢性疾病，近年来糖尿病引发皮肤疾病的几率非常高，在临床中占30％左右。高血糖的毒性逐渐造成各种代谢紊乱，同时引起末梢神经和微血管病变、微循环障碍及皮肤感染等，继而出现溃疡，使得创面难以愈合。
3.最近的临床前研究表明，细胞外囊泡(evs)有能力通过加速再上皮化和新生血管来帮助慢性伤口的再生。目前，天然来源纳米囊泡在各种疾病治疗中的作用研究逐渐成为临床研究者的关注热点。植物来源外泌体样纳米囊泡携代了蛋白质、脂质、rna和大量活性物质，其中活性成分占植物细胞的90％以上，除了潜在的调节植物自身的免疫外，还能将这些物质传递至动物细胞介导动植物间的交流。公开号为cn115414469a的中国专利申请公开了一种含黄精、土茯苓外泌体治疗关节炎的组合物，该产品对各类型关节炎见效快，疗效好，使用方便，且不易复发。公开号为cn111436609a中国专利申请公开了一种含有红葡萄外泌体、红石榴外泌体、胡萝卜外泌和白藜芦醇的产品，该产品安全有效、抗氧化效果好。公开号为cn115161256a的中国专利申请公开了一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用，该虎杖外泌体具有较好的细胞修复能力，可促进细胞划痕修复和细胞增殖，适用于具有细胞修复能力的药品、医美产品或护肤品中。公开号为kr20200053486a的韩国专利申请公开了一种用于预防皮肤老化或保护皮肤的化妆品组合物，其有效成分包括人参来源外泌体，该组合物可降低由紫外线照射引起的cox-2和inos的表达，证实了其对炎症反应的缓解效果。公开号为kr20200053489a的韩国专利申请公开了一种用于皮肤保护和改善皮肤状况的化妆品组合物，包括大豆来源外泌体，该组合物对皮肤应用安全，能有效防止皮肤老化，改善皮肤状况，可通过加强皮肤屏障来保护皮肤，并具有良好的伤口愈合效果。
4.动物来源的外泌体的分离存在成本高、耗时、产量低等问题，很大程度上限制了其在慢性伤口愈合领域的应用。目前研究发现植物来源的纳米囊泡在抗氧化、抗炎、抗病毒感染、抗肿瘤作用、抗真菌作用、缓解酒精性肝病、缓解结肠炎、预防皮肤老化等方面具有显著的功效，但在糖尿病慢性创面愈合过程的潜在机制尚不明确，还有待研究。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的在于提供一种艾叶来源外泌体样纳米囊泡(简称faelns)，以解决上述问题中的至少一种。
7.本发明的第二目的在于提供艾叶来源外泌体样纳米囊泡在制备糖尿病皮肤创面修复产品中的应用。
8.本发明的第三目的在于提供一种糖尿病皮肤创面修复药物。
9.第一方面，本发明提供了一种艾叶来源外泌体样纳米囊泡，主要由以下方法制备得到：
10.将艾叶破碎，然后经固液分离后取液汁，再将液汁进行分离纯化处理，获得艾叶来源外泌体样纳米囊泡。
11.作为进一步技术方案，所述艾叶来源外泌体样纳米囊泡的粒径为43.8～141.8nm。
12.作为进一步技术方案，所述破碎的步骤包括：将艾叶与缓冲液混合后再进行破碎；
13.所述破碎的方式包括榨汁机破碎。
14.作为进一步技术方案，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液；
15.所述缓冲液的ph为7-8。
16.作为进一步技术方案，所述固液分离的方式包括离心或者过滤。
17.作为进一步技术方案，所述分离纯化处理包括差速离心法和/或蔗糖密度梯度离心。
18.作为进一步技术方案，所述差速离心法的步骤包括：
19.将所述液汁在600
×
g～1000
×
g下进行第一次离心，弃去沉淀，取上清液，然后将上清液在3500
×
g～4500
×
g下进行第二次离心，弃去沉淀，取上清液，再将上清液在8000
×
g～10 000
×
g下进行第三次离心，取上清液，之后将上清液在100 000
×
g～120 000
×
g下进行第四次离心，收集沉淀，再将沉淀重悬，经过滤除菌后，获得艾叶来源外泌体样纳米囊泡。
20.作为进一步技术方案，所述第四次离心后还包括将艾叶来源外泌体样纳米囊泡进行蔗糖密度梯度离心的步骤；
21.所述差速离心法和蔗糖密度梯度离心的温度为4℃。
22.作为进一步技术方案，采用缓冲液进行重悬；
23.所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
24.第二方面，本发明提供了上述艾叶来源外泌体样纳米囊泡在皮肤创面修复产品中的应用。
25.作为进一步技术方案，所述皮肤创面修复产品包括糖尿病皮肤创面修复产品。
26.第三方面，本发明提供了一种皮肤创面修复药物，包括上述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡。
27.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
28.经发明人研究发现，本发明提供的艾叶来源的外泌体样纳米囊泡以较低浓度量显示出优异的促细胞增殖和抗氧化特性，可以有效促进细胞迁移，具有强大的抗氧化活性，能够有效清除dpph、细胞活性氧，加快伤口愈合，对于糖尿病患者的皮肤创面修复具有良好的治疗效果。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明试验例1提供的试验结果(图1中的a、b和c分别为faelns的电镜、粒径分布和电位图)；
31.图2为本发明试验例2提供的试验结果(图2中的a和b为faelns促进血管内皮细胞、成纤维细胞增殖结果)；
32.图3为本发明试验例3提供的试验结果(图3中的a为faelns的dpph清除实验结果；图3中的b和c为faelns清除ros及其定量结果)；
33.图4为本发明试验例4提供的试验结果(图4中的a和b为体内糖尿病小鼠皮肤创面愈合实验及其定量结果)。
具体实施方式
34.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
35.第一方面，本发明提供了一种艾叶来源外泌体样纳米囊泡，主要由以下方法制备得到：
36.将艾叶破碎，然后经固液分离后取汁液，再将汁液进行分离纯化处理，获得艾叶来源外泌体样纳米囊泡。
37.经发明人研究发现，采用本发明提供的制备方法制备得到的艾叶来源的外泌体样纳米囊泡以较低浓度量显示出优异的促细胞增殖和抗氧化特性，可以有效促进细胞迁移，具有强大的抗氧化活性，能够有效清除dpph、细胞活性氧，加快伤口愈合，对于糖尿病患者的创面修复具有良好的治疗效果。
38.经发明人研究发现，本发明制备得到的艾叶来源外泌体样纳米囊泡的粒径在43.8～141.8nm范围内。
39.在一些优选的实施方式中，所述破碎的步骤包括：将艾叶与缓冲液混合后再进行破碎。
40.所述破碎的方式包括但不限于榨汁机破碎，或者本领域技术人员所熟知的其他破碎方式。
41.在一些优选的实施方式中，所述缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液；
42.所述缓冲液的ph为7～8，优选为7.4。
43.在一些优选的实施方式中，所述固液分离的方式包括离心或者过滤，以去除艾叶残渣，获得液汁。
44.在一些优选的实施方式中，所述分离纯化处理包括差速离心法和/或蔗糖密度梯度离心。
45.在一些优选的实施方式中，所述差速离心法的步骤包括：
46.将所述液汁在600
×
g～1000
×
g下进行第一次离心，弃去沉淀，取上清液，然后将上清液在3500
×
g～4500
×
g下进行第二次离心，弃去沉淀，取上清液，再将上清液在8000
×
g～10 000
×
g下进行第三次离心，取上清液，之后将上清液在100 000
×
g～120 000
×
g下进行第四次离心，收集沉淀，再将沉淀重悬，经过滤除菌后，获得艾叶来源外泌体样纳米囊泡。
47.上述差速离心法简单方便，能够有效实现对艾叶来源外泌体样纳米囊泡的提取。
48.在一些优选的实施方式中，采用pbs重悬沉淀。
49.在一些优选的实施方式中，过滤除菌为依次采用0.44μm和0.22μm的滤膜过滤。
50.在一些优选的实施方式中，所述第四次离心后还包括将艾叶来源外泌体样纳米囊泡进行蔗糖密度梯度离心的步骤；
51.所述差速离心法和蔗糖密度梯度离心的温度为4℃。
52.通过蔗糖密度梯度离心，以进一步提高艾叶来源外泌体样纳米囊泡的纯度。
53.在一些优选的实施方式中，采用缓冲液进行重悬；
54.所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
55.第二方面，本发明提供了上述艾叶来源外泌体样纳米囊泡在皮肤创面修复产品中的应用。
56.本发明提供的艾叶来源的外泌体样纳米囊泡具有优异的促细胞增殖和抗氧化特性，对于伤口的愈合具有良好的治疗效果，能够用于制备皮肤创面修复产品。
57.在一些优选的实施方式中，所述皮肤创面修复产品包括糖尿病皮肤创面修复产品。
58.经发明人研究发现，本发明提供的艾叶来源外泌体样纳米囊泡对于糖尿病皮肤创面修复同样具有良好的治疗效果，能够用于制备糖尿病创面修复产品。
59.第三方面，本发明提供了一种皮肤创面修复药物，包括上述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡。
60.由于该药物含有本发明提供的艾叶来源外泌体样纳米囊泡，因此该药物具有艾叶来源外泌体样纳米囊泡的全部有益效果，对于包括糖尿病患者在内的皮肤创面修复具有良好的治疗效果。
61.下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
62.实施例1艾叶来源外泌体样纳米囊泡的制备
63.将来源安徽八公山产地野生艾叶清洗干净，用剪刀剪碎放入榨汁机，加入4℃预冷磷酸盐缓冲液(pbs＝7.4)，用榨汁机破碎，用过滤网过滤弃去艾叶残渣。收集汁液，滤液采用差速离心法进行处理，首先在4℃、800
×
g下,离心40分钟，除去艾叶中较大的颗粒物；弃去沉淀，收集上清液在4℃、4000
×
g，离心60分钟，除去艾叶中的植物纤维；弃去沉淀，再收集上清液于4℃、10 000
×
g，离心120分钟，除去小颗粒物；弃去沉淀，取上清液，在120 000
×
g，离心120分钟，收集沉淀用适量pbs重悬，用0.44μm和0.22μm的滤膜依次过滤除菌，获得
艾叶来源外泌体样纳米囊泡。
64.实施例2艾叶来源外泌体样纳米囊泡的制备
65.将实施例1获得的艾叶来源外泌体样纳米囊泡转移至不连续蔗糖浓度梯度中(8％、20％、40％和60％)，在4℃、100 000
×
g条件下离心120分钟，小心吸取沉淀，经pbs稀释后于4℃、100 000
×
g条件下离心90分钟，洗去蔗糖溶液，最终将得到的沉淀重悬于pbs中得到高纯度的艾叶来源外泌体样纳米囊泡，按蛋白bca定量试剂盒方法对所收集的艾叶来源外泌体样纳米囊泡进行蛋白定量，于-80℃保存备用。
66.以下试验均以实施例2获得的艾叶来源外泌体样纳米囊泡进行。
67.试验例1艾叶来源的外泌体样纳米囊泡的表征
68.采用malvern zetasizer nano zs进行粒径分布和电位的测定；采用tem透射电子显微镜观察艾叶来源外泌体样纳米囊泡的形态。faelns的tem电镜、粒径分布和电位如图1中的a、b和c所示，粒径显示在43.8nm和141.8nm之间不等，且在68nm处平均数量最多，tem电镜同样显示在60-90nm之间不等。faelns电位显示在-6.5mv附近。
69.试验例2艾叶来源的外泌体样纳米囊泡对于血管内皮细胞、成纤维细胞的增殖影响
70.取对数生长期细胞，首先将l929细胞、huvec细胞以每孔6
×
103个/孔的初始密度接种到96孔板中，同时设置空白组、对照组和实验组。在37℃、5％ co2培养箱中培养24小时之后，吸弃培养基，对照组只加培养基，实验组加入含有一系列浓度梯度的艾叶纳米囊泡，培养24小时，采用细胞毒性试剂盒(cck-8)检测，每孔各加10μl cck-8，在37℃下孵育1小时，然后用酶标仪在450nm波长下测定。
71.结果如图2中的a和b所示，从图中可以看出，与对照组相比，经faelns处理后，l929细胞和huvec细胞的活率均在100％以上，本发明提供的艾叶来源的外泌体样纳米囊泡无细胞毒性。faelns具有促进huvec细胞和l929细胞增殖的作用，且随着浓度的增加，增殖效果更明显。faelns在75、150μg/ml浓度时促进huvec细胞增殖存在显著性差异(p《0.01)。与对照组相比，faelns在100、150μg/ml浓度时促进l929细胞增殖存在显著性差异(p《0.01)，综上说明faelns能够促进成huvec、l929细胞的增殖，尤其在150ug/ml的浓度，增殖最显著，后续均采用150μg/ml faelns进行实验。
72.试验例3艾叶来源的外泌体样纳米囊泡的抗氧化性能
73.dpph自由基清除测定：
74.采用清除1,1-二苯基-2-吡啶肼基(dpph)自由基的方法，评价了艾草纳米囊泡的抗氧化效率。设置空白组和实验组，实验组配置一系列不同浓度梯度的艾叶纳米囊泡溶液，各吸取100μl于2ml ep管中，依次加入0.1mg/ml的dpph-乙醇溶液900μl，混合均匀，避光反应30分钟，用紫外-可见分光光度计测量。
75.结果如图3中的a所示，随着faelns浓度的依次增加，dpph清除率也呈现出浓度依赖型的增加，当浓度为150μg/ml时，dpph自由基清除能力为faelns仅次于vc，说明faelns有较强的抗氧化作用。
76.细胞内活性氧(ros)测定：
77.取对数生长期细胞，将nih-3t3细胞以每孔1
×
105个/孔的细胞密度接种到共聚焦小皿中，同时设置对照组、模型组和实验组。在37℃、5％ co2培养箱中培养24小时之后，吸
弃培养基，对照组和模型组只加培养基，实验组加入150μg/ml艾叶纳米囊泡预处理24小时后，模型组和实验组用300μm h2o2干预2小时，之后各组加入dcfh-da和dapi染料，在培养箱中孵育1分钟，用pbs洗3次，最后，在共聚焦显微镜下拍照，每孔至少拍3-5张照片，image j计算荧光强度。
78.结果如图3中的b和c所示细胞内活性氧图像与定量，阳性组(h2o2组)分别与阴性组(未处理组)、faelns组的ros荧光定量存在显著差异(p《0.01)，faelns组荧光定量强度为35.3％，阴性组为13.6％，说明faelns能显著降低h2o2诱导nih-3t3细胞内产生活性氧水平，即减轻细胞在氧化剂刺激下的氧化损伤及延缓细胞衰老。
79.试验例4艾叶来源的外泌体样纳米囊泡用于糖尿病小鼠皮肤创面修复研究
80.雄性c57bl/6小鼠(8-10周龄)，体重在20-30克之间。小鼠禁食过夜12小时后，腹腔注射链脲佐菌素(stz)50mg/kg，stz由ph 4.5的柠檬酸钠缓冲液配置。每3天监测一次血糖水平。尾静脉采血，使用血糖仪测量，血糖水平在11.1-16.5mm之间即可，麻醉动物，剃毛，用直径10mm的环形密封标记缺陷区域，通过活检穿刺器在背部制造6mm直径的标准化的全层皮肤伤口，用pbs和faelns治疗伤口各2次，在14天后分析伤口愈合情况。
81.结果如图4中的a和b所示，第三天时各组伤口面积出现减小，faelns组与对照组存在着显著性差异(p《0.05)，伤口面积分别为54.6％、75.3％，尤其在第14天经faelns处理后伤口面积缩小更为明显，说明faelns能够在一定程度上加快伤口愈合。
82.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种艾叶来源外泌体样纳米囊泡，其特征在于，主要由以下制备方法制备得到：将艾叶破碎，然后经固液分离后取液汁，再将液汁进行分离纯化处理，获得艾叶来源外泌体样纳米囊泡。2.根据权利要求1所述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡，其特征在于，所述艾叶来源外泌体样纳米囊泡的粒径为43.8～141.8nm。3.根据权利要求1所述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡，其特征在于，所述破碎的步骤包括：将艾叶与缓冲液混合后再进行破碎；所述破碎的方式包括榨汁机破碎。4.根据权利要求1所述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡，其特征在于，所述固液分离的方式包括离心或者过滤。5.根据权利要求1所述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡，其特征在于，所述分离纯化处理包括差速离心法和/或蔗糖密度梯度离心。6.根据权利要求5所述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡，其特征在于，所述差速离心法的步骤包括：将所述液汁在600
×
g～1000
×
g下进行第一次离心，弃去沉淀，取上清液，然后将上清液在3500
×
g～4500
×
g下进行第二次离心，弃去沉淀，取上清液，再将上清液在8000
×
g～10 000
×
g下进行第三次离心，取上清液，之后将上清液在100 000
×
g～120 000
×
g下进行第四次离心，收集沉淀，再将沉淀重悬，经过滤除菌后，获得艾叶来源外泌体样纳米囊泡。7.根据权利要求6所述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡，其特征在于，所述第四次离心后还包括将艾叶来源外泌体样纳米囊泡进行蔗糖密度梯度离心的步骤；所述差速离心法和蔗糖密度梯度离心的温度为4℃。8.权利要求1-7任一项所述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡在皮肤创面修复产品中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述皮肤创面修复产品包括糖尿病皮肤创面修复产品。10.一种皮肤创面修复药物，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的艾叶来源外泌体样纳米囊泡。

技术总结
本发明提供了一种艾叶来源外泌体样纳米囊泡及其应用和药物，涉及医药技术领域。本发明提供的一种艾叶来源外泌体样纳米囊泡，主要由以下方法制备得到：将艾叶破碎，然后经固液分离后取清液，再将清液进行分离纯化处理，获得艾叶来源外泌体样纳米囊泡。经发明人研究发现，本发明提供的艾叶来源的外泌体样纳米囊泡以较低浓度量显示出优异的促细胞增殖和抗氧化特性，可以有效促进细胞迁移，具有强大的抗氧化活性，能够有效清除DPPH、细胞活性氧，加快伤口愈合，对于糖尿病患者的皮肤创面修复具有良好的治疗效果。良好的治疗效果。


技术研发人员：权利要求书1页说明书6页附图3页
受保护的技术使用者：浙江省人民医院
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/8/1