一种植物复合多糖及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及物质提取技术领域，特别涉及一种植物复合多糖及其制备方法和应用。


背景技术：

2.研究报道不同分子量的植物多糖具有不同的生物活性。目前，对于植物粗多糖或是低分子量酶解多糖的抗肿瘤活性研究较为普遍，但缺少对不同分子量段植物多糖的抗肿瘤活性比较研究。现有的多糖提取技术包括热水浸提法、微波辅助法、超声波辅助法、复合酶解法等，常用的粗多糖的分级纯化方法有醇沉法、色谱柱层析法和膜过滤法。多糖的结构和分子量不同，其极性大小不同，在有机溶剂中的溶解度不同，根据这一原理，可以依此增加醇浓度，从而将多糖按分子量从大到小的沉淀出来。但是目前醇沉法很难得到分子量均一多糖。近年来，有多种植物多糖被证明具有抗肿瘤活性，且复合植物多糖被证明可以使每一种单一多糖的作用得到很好发挥的同时还能协同发挥出各自所不具备的其它作用。相关技术公开利用分级醇沉方法将冬虫夏草菌丝体多糖分为几个组分，筛选出具有促进抗肿瘤免疫细胞增殖的组分，增强了机体抗肿瘤免疫力效果，但并没有对几个组分多糖进行分子量检测和纯度分析。柱层析法是纯化多糖的常用方法，但使用柱层析法往往受到柱子使用范围、经济成本和时间成本的限制，对于工业放大应用仍存在较大困难。膜过滤法是以压力为推动力的膜分离技术，应用膜分离原理将大小分子溶质分开，从而达到纯化的目的。也有方法利用超声波提取枸杞渣获多糖液，先用6.7万分子量膜超滤，然后再用10万分子量膜超滤，分别收集分子量小于6.7万、6.7-10万和分子量大于10万的超滤液，得到三种不同分子量的枸杞多糖溶液，经过浓缩后冷冻干燥，得到不同用途的枸杞多糖粉，但单纯应用多个超滤膜分离纯化多糖分离纯化步骤繁琐且较为耗时。


技术实现要素：

3.本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种植物复合多糖及其制备方法和应用。
4.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
5.根据本发明的第一个方面，提出了一种植物复合多糖的制备方法，包括以下步骤：
6.s1：将植物复合多糖加水配制成固液比为1：(5～15)的多糖溶液a，再加入乙醇，搅拌后静置，离心，上清液回收乙醇后即得分子量小于3000da的多糖级分3；
7.s2：向s1中离心获得的多糖沉淀加水配制成固液比为1：(2～8)的多糖溶液b，再加入乙醇，调节ph为6～11，搅拌后静置，离心，取沉淀即得分子量大于47000da的多糖级分1；
8.s3：将s2离心获得的多糖上清液回收乙醇，加水配制成固液比为1：(1～4)的多糖溶液c，再用3000da分子量的超滤膜超滤，取截留液即为3000da～47000da的多糖级分2。
9.在本发明的一些实施方式中，所述的植物复合多糖的制备方法还包括：在s1前，根据所述植物复合多糖的分子量分布确定分级纯化范围；优选地，在s1前，采用高效凝胶渗透
色谱法测定所述植物复合多糖的分子量，根据所述植物复合多糖的分子量分布确定分级纯化范围。
10.在本发明的一些实施方式中，s1中，所述多糖溶液a与所述乙醇的质量比为1：(3～8)。
11.在本发明的一些实施方式中，s1中，所述乙醇的浓度为60％～90％；优选为70％～90％。
12.在本发明的一些实施方式中，s1中，所述搅拌的时间为20min～40min。
13.在本发明的一些实施方式中，s1中，所述静置的时间为4h～8h。
14.在本发明的一些实施方式中，s1中，所述离心的转速为3000rpm～5000rpm；时间为8min～15min；优选为所述离心的转速为4000rpm；时间为10min。
15.在本发明的一些实施方式中，s2中，所述多糖溶液b与所述乙醇的质量比为1：(1～3)。
16.在本发明的一些实施方式中，s2中，所述乙醇的浓度为70％～90％。
17.在本发明的一些实施方式中，s2中，所述调节ph为7～9。
18.在本发明的一些实施方式中，s2中，所述搅拌的时间为20min～40min。
19.在本发明的一些实施方式中，s2中，所述静置的时间为4h～8h。
20.在本发明的一些实施方式中，s2中，所述离心的转速为3000rpm～5000rpm；时间为8min～15min；优选为所述离心的转速为4000rpm；时间为10min。
21.在本发明的一些实施方式中，所述的植物复合多糖的制备方法还包括：将所述多糖级分1、多糖级分2、多糖级分3干燥分别制成对应的干粉。
22.在本发明的一些实施方式中，所述的植物复合多糖包括灵芝、菟丝子、茯苓、五味子、党参、白术的至少两种。
23.根据本发明的第二个方面，提出了一种植物复合多糖，包括如所述的植物复合多糖的制备方法制得的所述的多糖级分1、多糖级分2、多糖级分3的至少一种。
24.在本发明的一些实施方式中，植物复合多糖，包括如所述的植物复合多糖的制备方法中s2制得的所述的多糖级分1、s3制得的多糖级分2、s1制得的多糖级分3的至少一种。
25.根据本发明的第三个方面，提出了一种所述的植物复合多糖在制备抗肿瘤和/或提高机体免疫力的保健品、药物中的应用。
26.在本发明的一些实施方式中，所述的肿瘤为实体肿瘤或非实体肿瘤。
27.在本发明的一些实施方式中，所述实体肿瘤包括肝癌。
28.在本发明的一些实施方式中，所述植物复合多糖的治疗有效量为50mg/kg～200mg/kg。
29.本发明的有益效果是：
30.(1)相对于传统的耦合膜分离制备以及醇分离制备，分级醇沉耦合膜过滤分离法具有工艺简单、省时、低成本的特点，同时解决其制备纯度不足的难点。
31.(2)本发明按植物复合多糖分子量大小分级制备出高纯度的三个多糖级分，并且很好地保留了其原有增强机体免疫活性，其中植物复合多糖级分1和多糖级分2相较于粗多糖组分具有更好的增强机体免疫活性，可作为功能性保健食品的天然原料。
32.(3)本发明获得的三个纯度高且分子量确定的多糖级分，明确了多糖的分子量大
小与其免疫增强活性存在正相关。
附图说明
33.图1为本发明实施例1不同固液比多糖溶液对不同多糖级分分离效果的影响。
34.图2为本发明实施例1不同乙醇浓度醇沉对不同多糖级分提取效果的影响。
35.图3为本发明实施例1不同ph对不同多糖级分提取效果的影响。
36.图4为本发明实施例2中标准多糖分子量-洗脱体积标准曲线。
37.图5为本发明实施例2中植物复合多糖的gpc色谱图。
38.图6为本发明实施例2中多糖级分1的gpc色谱图。
39.图7为本发明实施例2中多糖级分2的gpc色谱图。
40.图8为本发明实施例2中多糖级分3的gpc色谱图。
41.图9为本发明实施例3中模型组、空白对照组、高剂量多糖级分实验组h22肝癌小鼠肿瘤组织图。
42.图10为本发明实施例3中各组抑瘤率结果。
43.图11为本发明实施例3中不同组方对h22皮下瘤小鼠的脾脏指数的影响结果。
44.图12为本发明实施例3中不同组方对h22皮下瘤小鼠的胸腺指数的影响结果。
45.图13为本发明实施例3中不同组方对h22皮下瘤小鼠血清中il-6含量的影响结果。
46.图14为本发明实施例3中不同组方对h22皮下瘤小鼠血清中il-12含量的影响结果。
具体实施方式
47.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
48.实施例1
49.本实施例对植物复合多糖的制备方法进行单因素条件优化，具体过程为：
50.分别考察醇沉固液比、乙醇浓度、ph值在植物复合多糖的制备方法不同步骤中对多糖级分1、多糖级分2、多糖级分3提取量变化的影响。
51.植物复合多糖的制备方法，包括以下步骤：
52.s1：将植物复合多糖加水配制成多糖溶液a，再加入乙醇，搅拌20min后静置8h，离心，上清液回收乙醇后即得分子量小于3000da的多糖级分3；
53.s2：向s1中离心获得的多糖沉淀加水配制成多糖溶液固液比为1：8的b，再加入乙醇使乙醇终浓度80％，调节ph，搅拌20min后静置8h，离心，取沉淀即得分子量大于47000da的多糖级分1；
54.s3：将s2离心获得的多糖上清液回收乙醇，加水配制成固液比为1：2的多糖溶液c，再用3000da分子量的超滤膜超滤，取截留液即为3000da～47000da的多糖级分2。
55.①
固液比条件考察：分别将植物复合多糖浓缩液加水配制成1：5、1：8、1：10、1：15四个固液比例，分别获得四个固液比例的多糖溶液a，加入乙醇使其乙醇终浓度80％过夜；s2中ph值为8.5；沉淀干燥分析多糖分子量分布，结果如图1所示。从图1可看出，s1中固液比
条件为1：(5～15)时对3个多糖级分均有一定分离效果，差异不大。
56.②
乙醇浓度条件考察：依据上述试验结果选择将s1中植物复合多糖浓缩液加水配制成固液比条件为1：8，获得固液比为1：8的多糖溶液a，加入乙醇使其醇沉终浓度设置为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％九个浓度梯度；s2中ph值为8.5；沉淀干燥分析多糖分子量分布。结果如图2所示。从图2可看出，乙醇浓度10％～30％对多糖级分1含量的提升有一定效果，乙醇浓度60％～90％对多糖级分2和多糖级分3含量的提升有一定效果。
57.③
ph值条件考察：依据上述实验结果，s1中选择将植物复合多糖浓缩液加水配制成固液比条件为1：8，获得固液比为1：8的多糖溶液a，乙醇终浓度80％；s2中ph值选择设置为2.5、4.5、6.5、8.5、10.5五个条件，用18％hci溶液和10％naoh溶液调节，常温过夜，4000rpm离心10min，沉淀干燥分析多糖分子量分布，结果如图3所示。从图3可看出ph值为6.5-10.5时对级分2含量的提升有一定效果，且ph值为7～9时对级分2含量提升效果最好。
58.实施例2
59.本实施例制备了一种植物复合多糖，具体过程为：
60.(1)采用高效凝胶渗透色谱法测定植物复合多糖浓缩液分子量，根据植物复合多糖浓缩液分子量分布确定分级纯化范围：
61.①
标准品溶液配制：所用的标准品为标准分子量分别为3000da、5000da、25000da、40000da、80000da、150000da、270000da、410000da、670000da的葡聚糖标准品。分别取各标准品10mg，加1ml流动相(纯水)溶解，经0.22μm滤膜过滤，取滤液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，绘制标准多糖分子量-洗脱体积标准曲线，结果如图4所示。
62.②
供试品溶液配制：用水分仪测定植物复合多糖浓缩液的固形物含量，根据固形物含量配制成浓度为10mg/ml的多糖溶液，经0.22μm滤膜过滤进样，记录色谱图，对照标准曲线计算分子量。
63.③
根据系列分子量右旋糖苷标准品的液相色谱图，所绘制的方程为:
64.log
mw
＝0.0202x
2-1.0347x+15.9，r2＝0.9974。
65.从植物复合多糖的gpc色谱图可以发现其包含三个彼此分离的吸收峰(植物复合多糖gpc色谱图如图5所示)，根据标准曲线计算三个吸收峰(多糖级分1、多糖级分2和多糖级分3)的分子量范围(多糖级分1、多糖级分2和多糖级分3的gpc色谱图分别对应如图6～8所示)如表1所示。
66.表1植物复合多糖分子量测定结果
67.吸收峰保留时间/min分子量范围/da吸收峰1(多糖级分1)《26》47000吸收峰2(多糖级分2)26-323000-47000吸收峰3(多糖级分3)》32《3000
68.(2)将植物复合多糖浓缩液加水配制成固液比为1：15的多糖溶液，加入其质量5倍的80％乙醇，常温下搅拌20min，静置8h，4000rpm离心5min，取上清，旋转浓缩回收乙醇(60℃)，乙醇挥干后加入适量水溶解多糖，所得多糖溶液用3000da分子量的超滤膜超滤，收集截留液，旋转浓缩得级分3多糖样品；
69.(3)将步骤(2)离心获得的多糖沉淀用水配制成比为1：5的多糖溶液，加入其质量3
倍的80％乙醇，常温下搅拌20min，静置8h，4000rpm离心5min，所得多糖溶液用50000da分子量的膜分离，收集截留液，收集级分1多糖沉淀，加适量水溶解；
70.(4)将步骤(3)离心得到的多糖上清液经过旋转浓缩回收乙醇，乙醇挥干后加水配制成固液比为1：3的多糖溶液；所得多糖溶液用3000da分子量的超滤膜超滤，收集截留液，旋转浓缩收集级分2多糖样品；
71.(5)将三种不同级分多糖浓缩液进行冷冻干燥：将分离纯化后的三种多糖样品收集于离心管，冷冻干燥48h，取出后封口于干燥器中保存。
72.(6)采用高效凝胶渗透色谱法测定植物复合多糖级分1、多糖级分2和多糖级分3的分子量，具体方法参照步骤(1)。与步骤(1)不同的是样品溶液配制方法为：分别取各样品10mg，加1ml流动相(纯水)溶解，用0.22μm滤膜过滤。
73.根据标准曲线计算的样品的分子量和各样品峰面积占比如表2所示。
74.表2多糖级分1-3多糖样品分子量和峰面积占比测定结果
75.样品保留时间/min分子量/da峰面积占比/％级分1《26》4700090.56级分226-323000-4700082.00级分3》32《300097.84
76.由上述结果可知，乙醇分级醇沉耦合膜过滤的方法可以成功将植物复合多糖按分子量分布特点分离制备成三个多糖级分，且分离度较高。
77.实施例3
78.本实施例探索不同分子量多糖对小鼠h22肝癌皮下肿瘤增殖的影响，具体过程为：
79.(1)细胞培养及动物饲养
80.h22肝癌细胞(小鼠肝癌细胞系)，在dmen培养基中培养，辅以10％fbs、1
×
105u/l青霉素和100mg/l链霉素，在37℃加湿环境中5％的二氧化碳培养箱。细胞培养直到达对数生长。
81.皮下接种细胞数量筛选实验：spf级雄性balb/c小鼠，6～8周龄，体重18g～22g，spf级环境饲养，给予标准小鼠饲料和饮用水，隔天更换消毒垫料一次，饲养室恒温(22℃)、恒湿(50％)，光照时间与黑暗时间为12h更替。所有小鼠均自由进食及饮水。所有小鼠均在无特定病原体级(spf)实验动物房饲养。
82.(2)小鼠h22肝癌皮下瘤模型构建
83.按体重随机分配，每组8只，每只小鼠在右后肢皮下窝进行皮下注射接种0.2ml肿瘤细胞悬液，每只接种约2
×
106个肿瘤细胞，接种3～5天左右背部有米粒状突起。当ab2/2大于50mm3(a：肿瘤长径；b：肿瘤短径)，即小鼠建模成功。
84.(3)植物复合多糖及其不同多糖级分膳食干预方式、分组及剂量
85.连续10天对实验建模成功小鼠模型进行灌胃，每天一次，每次0.2ml。
86.表3动物实验组别
[0087][0088]
(4)解剖采样和抑瘤率计算
[0089]
按照表3，连续10天对小鼠进行灌胃干预。10天后，次日称重记录称重。小鼠co2麻醉处死，心脏采血置于1.5ml ep管中，剥离肿瘤组织，拍照记录肿瘤大小和形态后称重计算抑瘤率，按以下公式计算：
[0090]
抑瘤率＝(wa-wb)/wa*100％；
[0091]
其中wa：模型组肿瘤重量，wb：实验组肿瘤重量。
[0092]
模型组、空白对照组、高剂量多糖级分实验组各组h22肝癌小鼠肿瘤组织图见图9。从肿瘤表征观察结果可知，模型组肿瘤直径可达3cm左右，经过不同样品的治疗后，可以看出有不同的抑制效果。可以看出多糖级分1和多糖级分2的肿瘤明显变小，抑制肿瘤效果明显。
[0093]
各组抑瘤率结果见附图10。从h22肝癌皮下瘤小鼠抑瘤率计算结果可知，三个多糖级分均对肿瘤的生长有抑制作用，多糖级分1和多糖级分2实验组抑瘤率高于多糖级分3实验组，其中高剂量多糖级分1组对h22肝癌细胞实体肿瘤的抑制率高达64％，说明大分子量的复合植物多糖可以显著增强机体免疫功能。
[0094]
(5)免疫器官指数检测
[0095]
具体检测方法为：按照表3，连续10天对小鼠进行灌胃干预。10天后，次日称重记录称重。小鼠co2麻醉处死，心脏采血置于1.5ml ep管中，小心剥离下胸腺和脾脏称重并记录。小心剥离下胸腺和脾脏称重并记录。
[0096]
免疫指数计算方法如下：
[0097]
脾脏指数＝wc/we，胸腺指数＝wd/we；
[0098]
其中wc：脾脏重量，wd：胸腺重量，we:小鼠体重。
[0099]
图11是不同组方对h22皮下瘤小鼠的脾脏指数的影响结果。经过不同级分多糖的作用后，h22皮下瘤小鼠脾脏指数有不同程度的恢复和提高。除低剂量和中剂量多糖级分3
组，其它处理组的脾脏指数显著高于模型组；图12是不同组方对h22皮下瘤小鼠的胸腺指数的影响结果，经过不同级分多糖的作用后，h22肝癌小鼠胸腺指数有不同程度的恢复和提高。除中剂量级分1组和中剂量级分3组，其它处理组的脾脏指数显著高于模型组。
[0100]
(6)血清细胞因子测定
[0101]
白细胞介素-6(interleukin-6)，简称白介素6(il-6)，是一种功能广泛的多效性细胞因子。细胞介素12(il-12)又名自然杀伤细胞刺激因子，il-12主要由巨噬细胞、b细胞产生，对t细胞核自然杀伤细胞有多种作用。测定的细胞因子il-6、il-12，使用试剂为小鼠细胞因子elisa试剂盒。
[0102]
测定方法：按照表3，连续10天对小鼠进行灌胃干预。10天后，次日称重记录称重。小鼠co2麻醉处死，心脏采血置于1.5ml ep管中，使用elisa试剂盒测定血清样品中细胞因子il-6、il-12水平。
[0103]
图13是不同组方对h22皮下瘤小鼠血清中il-6含量的影响结果；图14是不同组方对h22皮下瘤小鼠血清中il-12含量的影响结果。与模型组相比，不同剂量组的三个多糖级分处理后的h22皮下瘤小鼠血清中il-6含量各具有极显著性增加。不同组方对h22皮下瘤小鼠血清中il-12含量测定结果和il-6相似。结果表明三个多糖级分均可促进il-6、il-12含量的升高，具有最好的免疫效果。
[0104]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种植物复合多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：s1：将植物复合多糖加水配制成固液比为1：(5～15)的多糖溶液a，再加入乙醇，搅拌后静置，离心，上清液回收乙醇后即得分子量小于3000da的多糖级分3；s2：向s1中离心获得的多糖沉淀加水配制成固液比为1：(2～8)的多糖溶液b，再加入乙醇，调节ph为7～9，搅拌后静置，离心，取沉淀即得分子量大于47000da的多糖级分1；s3：将s2离心获得的多糖上清液回收乙醇，加水配制成固液比为1：(1～4)的多糖溶液c，再用3000da分子量的超滤膜超滤，取截留液即为3000da～47000da的多糖级分2。2.根据权利要求1所述的植物复合多糖的制备方法，其特征在于：在s1前，根据所述植物复合多糖的分子量分布确定分级纯化范围。3.根据权利要求1所述的植物复合多糖的制备方法，其特征在于：s1中，所述多糖溶液a与所述乙醇的质量比为1：(3～8)。4.根据权利要求1所述的植物复合多糖的制备方法，其特征在于：s1中，所述乙醇的浓度为60％～90％。5.根据权利要求1所述的植物复合多糖的制备方法，其特征在于：s2中，所述多糖溶液b与所述乙醇的质量比为1：(1～3)。6.根据权利要求1所述的植物复合多糖的制备方法，其特征在于：s2中，所述乙醇的浓度为70％～90％。7.根据权利要求1～6任一项所述的植物复合多糖的制备方法，其特征在于：所述的植物复合多糖包括灵芝、菟丝子、茯苓、五味子、党参、白术的至少两种。8.一种植物复合多糖，包括由如权利要求1～7任一项所述的植物复合多糖的制备方法制得的所述的多糖级分1、多糖级分2、多糖级分3的至少一种。9.一种如权利要求8所述的植物复合多糖在制备抗肿瘤和/或提高机体免疫力的保健品、药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物复合多糖的治疗有效量为50mg/kg～200mg/kg。

技术总结
本发明公开了一种植物复合多糖及其制备方法和应用，本发明按植物复合多糖分子量大小分级制备出高纯度的三个多糖级分，并且很好地保留了其原有增强机体免疫活性，其中植物复合多糖级分1和多糖级分2相较于粗多糖组分具有更好的增强机体免疫活性，可作为功能性保健食品的天然原料。相对于传统的耦合膜分离制备以及醇分离制备，分级醇沉耦合膜过滤分离法具有工艺简单、省时、低成本的特点，同时解决其制备纯度不足的难点。纯度不足的难点。


技术研发人员：龙洁怡 林晓亮 梁明 余意 余庆涛 张婷
受保护的技术使用者：无限极（中国）有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/1