TNFRSF1A抑制剂miR-3059-5p在治疗脑卒中疾病中的用途

tnfrsf1a抑制剂mir-3059-5p在治疗脑卒中疾病中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及tnfrsf1a抑制剂mir-3059-5p在治疗脑卒中疾病中的用途。


背景技术：

2.缺血性脑卒中(ischemic stroke,is)是一类严重威胁人类生命健康安全的急性脑血管疾病，伴随着高死亡率和致残风险[53]。is的病理机制目前尚未完全阐明，现有的证据提示，存在多种机制共同参与is的发生和进展，且不同机制之间还存在着相互作用。因此，进一步探索is的病理机制有助于寻找新的治疗靶点。
[0003]
细胞凋亡被认为是is诱导神经细胞死亡的主要形式之一，在is的进展过程中缺血区域往往伴随着大量神经细胞凋亡。这是一种细胞受到外界环境刺激后，在基因精确调控下发生的主动程序性死亡过程，主要由线粒体途径、内质网应激途径和死亡受体途径三条信号通路介导，最终激活caspase-3等凋亡执行蛋白，造成细胞死亡。随着对细胞死亡机制的不断探索，研究者们在缺氧损伤的神经元中发现了一种全新的程序性细胞死亡形式：parp-1依赖性细胞死亡，又被称作parthanatos。不同于坏死或凋亡，这是一种受到调控的、非caspase依赖性细胞死亡形式，发展过程主要包括parp-1的过度激活、aif由线粒体向细胞核转位以及巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,mif)依赖的dna降解。凋亡和parthanatos已被证实在is诱导神经细胞死亡的病理机制中发挥至关重要的作用。因此，本研究试图寻找is中与凋亡和parthanatos通路密切相关的基因，作为is治疗的关靶键点。


技术实现要素：

[0004]
本发明提供了tnfrsf1a抑制剂在制备预防或治疗脑卒中的药物中的应用。
[0005]
进一步，所述脑卒中是缺血性脑卒中。
[0006]
术语“抑制剂”是指任何可减少tnfrsf1a蛋白的活性、降低tnfrsf1a基因或蛋白的稳定性、下调tnfrsf1a蛋白的表达、减少tnfrsf1a蛋白有效作用时间或抑制tnfrsf1a基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调tnfrsf1a有用的物质，从而可用于预防或治疗脑卒中。
[0007]
所述的抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子。其中核酸抑制剂选自：以tnfrsf1a或其转录本为靶序列、且能够抑制tnfrsf1a基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。蛋白结合分子选自：与tnfrsf1a蛋白特异性结合的物质，如能够抑制tnfrsf1a蛋白活性的抗体或配体。
[0008]
在本发明的一些实施方案中，所述的tnfrsf1a的抑制剂是小干扰rna(sirna)，所述的小干扰rna是指一种短片段双链rna分子，能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰(rna interference)过程。小干扰rna可以制备成双链核
酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链rna复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链rna复合物。
[0009]
在本发明的具体实施方案中，所述的tnfrsf1a的抑制剂是“小发夹rna(small hairpinrna，shrna)”，其是能够形成发夹结构的非编码小rna分子，小发夹rna能够通过rna干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shrna可以由双链dna模板来表达。双链dna模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shrna在真核细胞内dicer酶的作用下，可被切割成小干扰rna分子，从而进入rnai途径。“shrna表达载体”是指一些本领域常规用于构建shrna结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shrna(或类似物)相应的dna序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该dna序列转录后的rna可形成shrna(short hairpin)结构。所述的“shrna表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。
[0010]
本发明的核酸抑制物如sirna可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链rna之后进行制备。sirna等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
[0011]
在本发明的具体实施方案中，所述tnfrsf1a的抑制剂是mirna，所述mirna是mir-3059-5p或促进mir-3059-5p表达的试剂。
[0012]
本发明的促进mir-3059-5p表达的试剂不受限制，只要是可以促进或者增强mir-3059-5p或涉及mir-3059-5p上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗脑卒中有效的药物即可。
[0013]
本发明的促进mir-3059-5p表达的试剂可以用于补充内源性的mir-3059-5p的缺失或不足，从而治疗脑卒中。
[0014]
在本发明的具体实施例中，所述促进mir-3059-5p表达的试剂是mir-3059-5p mimic。
[0015]
本发明的mir-3059-5p包括mir-3059-5p前体和成熟mir-3059-5p，本发明的mir-3059-5p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达mir-3059-5p的dna片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
[0016]
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及eb病毒)载体、甲病毒载体。
[0017]
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pcmv-myc表达载体、pcdna3.0表达载体、pcdna3.1表达载体、pegfp表达载体、pef bos表达载体、ptet表达载体、ptre表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pbin438、pcambia1301等。
[0018]
可以表达mir-3059-5p的dna片段可以通过如下方式获取：从mirna数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找mir-3059-5p在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定mir-3059-5p初始mirna的位置，在mir-3059-5p初始mirna位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达mir-3059-5p的dna片段。
[0019]
本发明中tnfrsf1a的抑制剂可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括但不限于乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。
[0020]
本发明还提供了一种治疗脑卒中的药物，所述药物包含tnfrsf1a抑制剂。
[0021]
本发明所述药物还包括药物学上可接受的载体。通过常规制药工艺将有效成分与药物学上可接受的载体制备成本发明的药物。
[0022]
短语“药学上可接受的载体”是本领域认可的并且包括例如参与从身体的一个器官或部分携带或运输任何主题组合物至身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或赋形剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包囊材料。每种载体必须在与主题组合物的其他成分相容的意义上是“可接受的”并且对患者无害。在某些实施方案中，药学上可接受的载体是无热原的。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药物制剂中使用的其他无毒的相容物质。
[0023]“施用”表示将剂量药物给患者的方法。在本发明方法中使用的组合物可通过选自但不限于如下途径施用：吸入、眼部、肠胃外、皮肤、经皮、口腔、直肠、舌下、舌周(perilingual)、鼻、局部给药和口服给药。肠胃外给药包括静脉内、腹膜内、皮下和肌内给药。优选的给药方法可根据多种因素变化，如，被施用的组合物的组分和被治疗的病症的严重度。
[0024]
以本领域熟练技术人员已知的方式制备本发明的药物，如通过常规的溶解、冻干、混合、制粒或成型方法。制造制剂的本领域熟知方法示于如remington：the science and practice of pharmacy，第20版，a.r.gennaro编，2000，lippincott williams&wilkins，philadelphia，和encyclopedia of pharmaceutical technology(制药技术百科)，j.swarbrick和j.c.boylan编，1988-1999，marcel dekker，new york。
[0025]
本领域熟练技术人员可容易地确定在本发明药物中使用的任何试剂的剂量。希望地，本发明药物中的试剂的剂量会足以缓解患者的脑卒中的症状。
附图说明
[0026]
图1显示mcao/r模型小鼠缺血侧脑血流变化情况；
[0027]
图2显示mrna-seq样本基因表达量总体分析结果图，其中(a)：fpkm箱线图；(b)：样本间相关系数热图；(c)：二维pca图；(d)：三维pca图；图中不同颜色的点，代表不同组的样本；
[0028]
图3显示degs分布火山图，注：横坐标表示基因在不同样本中表达倍数变化；纵坐标表示基因表达量变化的统计学显著程度；图中的散点代表各个基因，红色圆点代表有显
著性差异的上调基因，蓝色圆点代表有显著性差异的下调基因，灰色圆点表示无显著性差异的基因。在表达上调与表达下调的基因中各标注5个padj值最低，最具有统计学意义的基因；
[0029]
图4显示ssgsea分析样本表达矩阵与凋亡、parthanatos死亡相关基因集配对的富集评分结果图；
[0030]
图5显示时序分析结果图，其中(a)：与差异基因相关富集的功能通路信息；(b)：通路的相关基因表达信息与疾病时间性状的关系；
[0031]
图6显示wgcna中软阈值β的选择和验证的结果图，其中(a)：gse23160样本聚类树状图；(b)：软阈值β(横坐标)与无尺度拟合指数r2(纵坐标)的关系；软阈值β(横坐标与平均邻接系数(纵坐标)的关系；红色线代表0.9；(c)：选择软阈值β＝16，此时软连接度k的频率直方图显示此时基因间连接很少；软阈值β＝16时，无尺度拟合指数r2＝0.9；
[0032]
图7显示识别与目标疾病特征信息相关的基因模块的结果图，其中(a)：degs层级聚类树，树形图下方颜色行中不同的颜色代表不同的基因模块；(b)：模块与细胞凋亡、parthanatos死亡等相关性热图，每一格代表基因模块与相应疾病性状的相关性，包含相关系数和p值，颜色深浅代表了相关性的大小；
[0033]
图8显示关键基因的筛选结果图，其中(a)：相关基因集取交集；(b)：ppi分析；
[0034]
图9显示ogd/r模型和mcao/r模型中tnfrsf1a表达水平变化的结果图，其中(a)：ogd/r模型tnfrsf1a的mrna水平；(b)：ogd/r模型tnfrsf1a的蛋白水平；(c)：mcao/r模型tnfrsf1a的mrna水平；(d)：mcao/r模型tnfrsf1a的蛋白水平，注：**p《0.01，****p《0.001；
[0035]
图10显示tnfrsf1a上游mirna的预测和验证的结果图，其中(a)：demirna火山图，图中的散点代表各个mirna，红色圆点代表有显著性差异的上调mirna，蓝色圆点代表有显著性差异的下调mirna，灰色圆点表示无显著性差异的mirna；(b)：绘制韦恩图分析mirdb、targetscan预测结果与测序数据demirna的交集mirna；(c)：双荧光素酶报告实验检测结果；(d)：western blot检测特异性转染mir-3059-5p inhibitor或mir-3059-5p mimic的ht-22细胞中tnfrsf1a蛋白表达水平，注：**p《0.01，***p《0.001；
[0036]
图11显示mir-3059-5p对tnfrsf1a的调控作用以及对ogd/r诱导的细胞parthanatos死亡和凋亡的影响的结果图，其中(a)：western blot检测各组细胞parp-1的蛋白表达和相对定量分析、(b)：线粒体中aif的蛋白表达和相对定量分析、(c)：细胞核内aif的蛋白表达和相对定量分析；(d)：各组ht-22细胞tunel染色结果相对定量分析；(e)各组ht-22细胞tunel染色结果，注：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001,****p《0.0001。
具体实施方式
[0037]
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
[0038]
实施例tnfrsf1a抑制剂mir-3059-5p在治疗脑卒中疾病中的用途
[0039]
一、实验步骤
[0040]
1、实验用的动物和细胞系
[0041]
本研究使用小鼠均为spf(specified-pathogens free)级、健康雄性c57bl/6j，年
龄为6-8周，体重20-25g，采购自北京华阜康生物科技有限公司(合格证批号：scxk 2019-0008)。所有小鼠按4-6只/笼饲养于天津市麻醉学研究所动物饲养室，允许自由摄取食物和饮用水。维持饲养环境温度20-24℃，湿度40-60％，12小时昼夜交替。实验开始之前，对小鼠适应性饲养一周。本研究所有动物实验操作均获得天津医科大学实验动物管理委员会批准。
[0042]
本研究所使用的小鼠海马神经元细胞系ht-22购自中桥新舟生物科技有限公司。培养液为含有10％胎牛血清(fbs)及1％ p/s(p:青霉素10000u/ml,s:链霉素10000u/ml)的dmem培养基，在37℃、5％ co2的细胞培养箱中培养。
[0043]
2、实验方法
[0044]
2.1 ht-22细胞培养
[0045]
(1)细胞复苏
[0046]
①
液氮中取出细胞冻存管，在37℃恒温水浴箱中快速复温解冻。
[0047]
②
冻存管内液体完全融化后，转移至无菌离心管中，加入2-3ml完全培养基充分混匀，室温下1000rpm离心5min，弃上清。
[0048]
③
加入1ml完全培养基，轻轻吹打重悬细胞沉淀，将细胞悬液均匀接种至t25 cm细胞培养瓶或10cm细胞培养皿，补足完全培养基4-7ml，轻轻晃动培养瓶/皿使细胞分布均匀，培养条件37℃、5％ co2。
[0049]
(2)细胞传代
[0050]
①
当倒置显微镜下观察到细胞生长融合度达到80％-90％，弃去原培养基，加入2ml无菌pbs溶液轻柔洗涤细胞2次。
[0051]
②
加入1ml 0.25％胰酶，轻柔晃动培养瓶/皿，使胰酶完全覆盖贴壁细胞。
[0052]
③
37℃培养箱中进行消化，消化时间根据不同的细胞类型略有差异，显微镜下间断观察细胞形态，待细胞收缩变圆或出现漂浮时，立即加入完全培养基终止消化，用枪头轻柔吹打数次，得到均匀的细胞悬液。
[0053]
④
室温下，1000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用1ml完全培养基重悬均匀，并按照1：3的传代比例接种至新的细胞培养瓶/皿中继续培养。
[0054]
(3)细胞冻存
[0055]
①
待细胞生长融合度达到80％以上可冻存细胞。弃去原培养基，无菌pbs漂洗、0.25％胰酶消化、完全培养基终止消化、离心获得细胞沉淀，以上步骤与细胞传代中步骤完全一致。
[0056]
②
向细胞沉淀中加入1ml细胞冻存液，轻轻吹打混匀，并转移至2ml细胞冻存管，清晰标记细胞名称、冻存日期及细胞代数。
[0057]
③
将冻存管放入细胞冻存盒，-80℃冰箱过夜后，转移至液氮罐以便长期储存。
[0058]
2.2 ogd/r模型的建立
[0059]
通过建立ogd/r模型体外模拟缺血和再灌注过程。具体步骤如下：ht-22细胞接种于培养瓶/皿中24h，保证贴壁。弃去原细胞完全培养基，无菌pbs轻柔洗涤3次，更换为无糖dmem培养基，在37℃、含94％ n2-1％ o2-5％ co2的低氧培养箱中培养6h，即氧-葡萄糖剥夺，模拟缺血阶段。弃去无糖dmem培养基，pbs洗涤，加入高糖dmem完全培养基，转移至37℃、5％ co2培养箱中继续培养24h，此过程模拟缺血后再灌注阶段。
[0060]
2.3 mcao/r模型的制备
[0061]
利用雄性c57bl/6j小鼠(20-25g，8周龄)建立mcao/r模型，具体步骤如下：
[0062]
(1)术前准备：手术前对小鼠禁食水12h，称重并标记分组。
[0063]
(2)具体造模步骤
[0064]
①
通过吸入异氟烷麻醉(诱导浓度4％，维持浓度1％-1.5％)，小鼠仰卧位固定于操作台。造模过程中注意小鼠保温。
[0065]
②
胸骨上方至颈部备皮、消毒，沿颈部正中线作一约1cm的纵向切口，在体视显微镜观察下用眼科镊钝性分离肌肉、筋膜及神经，游离左侧颈总动脉(common carotid artery,cca)，6-0丝线打一活结。
[0066]
③
沿cca向上分离，游离出颈内动脉(external carotid artery,eac)和颈外动脉(internal carotid artery,ica)。将eca远心端与甲状腺动脉一起穿线结扎，在结扎处与cca分叉处之间穿一根6-0缝线，打一虚结。
[0067]
④
在虚结与结扎处之间，用显微剪斜行剪开一个小口，插入线栓后将虚结拉紧，力度以线栓刚好在血管内滑动而破口无血流流出。
[0068]
⑤
紧贴eca远心端结扎处将eca剪断，调整角度使线栓插入ica，并沿ica继续向前推送，直至感到轻微阻力，停止推送线栓，此时其前端完全阻断大脑中动脉起始部，在eca断端打一活结固定线栓。
[0069]
⑥
逐层缝合皮下组织和皮肤，消毒。缺血1h后，向外抽拔线栓，使其头端退至eca，以保证cca血流再灌注到大脑中动脉。重新缝合消毒，腹腔注射1ml生理盐水补液。
[0070]
⑦
假手术(sham)组小鼠，手术操作除线栓头端插入ica但不栓塞大脑中动脉外，其余步骤均同上。术后小鼠分笼饲养，注意保持体温，及时补液。
[0071]
2.4激光微循环血流成像仪检测脑血流
[0072]
小鼠麻醉后，取俯卧位，头部备皮消毒，沿失状位中线剪开小鼠额顶部的皮肤，暴露颅骨。打开pericam psi系统，调节动物位置至视野中央，采集血流灌注图片。随后对小鼠建立mcao/r模型，重复检测相同部位的血流灌注情况，以保证造模的成功率及稳定性。
[0073]
2.5组织或细胞中rna提取和质量控制(质控)
[0074]
(1)样品处理
[0075]
①
脑组织取材和匀浆：再灌注24h，将小鼠深度麻醉后处死，冰上迅速取出小鼠脑。去除小脑后，迅速用预冷的pbs溶液(rnase-free)冲洗。各组均取材左侧(缺血侧)半脑，称重后保存于2ml rnase-free螺纹冻存管，迅速置于液氮中保存。取样时间不超过2min，取材全过程保证rnase free。同组每3只样本随机混合为1个测试样本，每组设置3个重复。电子天平称重约100mg脑组织，加入1ml trizol，利用组织高通量研磨仪研磨成匀浆，室温下孵育5min。
[0076]
②
细胞裂解：当6孔板中细胞生长融合度达80％-90％，弃去细胞培养上清，无酶pbs溶液洗涤2次，加入1ml trizol轻轻吹打细胞，室温静置5min后将裂解液移入1.5ml ep管，12000rpm，离心5min，回收上清。
[0077]
(2)rna提取
[0078]
①
加入200μl氯仿，盖紧ep管盖，剧烈颠倒震荡，室温静置10-15min。
[0079]
②
4℃条件下12000rpm，离心15min。小心吸取含有rna的上层水相(约500μl)，枪头
切勿接触中间白色蛋白层，将上层水相转移至新的ep管中。
[0080]
③
向ep管中加入与上层水相等体积的异丙醇(约500μl)，充分混匀后，室温静置反应10min。
[0081]
④
4℃条件下12000rpm，离心15min。离心管底部的白色沉淀即rna，尽量吸净上清液。
[0082]
⑤
向rna沉淀中加入1ml 75％乙醇(4℃预冷)，缓慢混匀、洗涤rna沉淀。4℃，12000rpm，离心5min。弃去上清，开盖将rna沉淀晾干。
[0083]
⑥
将rna溶于50μl depc水中，静置5min，轻轻吹打其完全溶解。
[0084]
⑦
rna完整性检测：用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定rna的完整性，通常真核生物的28s rna与18s rna条带亮度比为2：1。
[0085]
⑧
rna纯度和浓度检测：nanodrop2000检测rna的od值和浓度，根据od260/od280比值确定纯度，数值在1.8-2.0范围内的rna视为质量较好，可用于后续实验。
[0086]
⑨
rna样品可长期保存于-80℃。
[0087]
2.6脑组织mrna和mirna高通量测序
[0088]
cdna文库构建及测序工作由上海中科新生命生物科技有限公司完成。
[0089]
2.7测序数据分析
[0090]
(1)基因表达分析
[0091]
对原始数据进行质量评估，利用hisat2软件(v.2.2.1.0)将clean reads(对原始数据进行过滤后的剩余数据)与指定的参考基因组进行序列比对。应用已知的参考基因序列和注释文件作为数据库，采用序列相似性比对法鉴定各个样本中各蛋白编码基因的表达丰度。使用featurecounts软件计算出每个基因在各个样本中的表达量fpkm值。
[0092]
(2)差异mrna和mirna表达分析
[0093]
首先，以各个样本的官方基因(gapdh)为参考，判断是否需要对样本进行标准化处理。然后，借助factominer包和fectoextra包，通过主成分分析(principle component analysis,pca)对数据进行降维，判断各组之间是否可以进行良好的区分。应用r语言中的deseq2进行两组间的差异表达分析。首先将fpkm值进行log2转换，避免后期由于数据的正态分布问题带来的统计学偏差。利用进行过转化的矩阵，使用经验贝叶斯估计，进行差异基因的分析。判断差异基因的标准为：得到的差异表达倍数(fold change,fc)，|log2fc|＞1且校正后的p值(adjusted p value,padj)＜0.05。运用r的ggplot2包绘制火山图对差异表达基因(differential expression gene,degs)进行可视化分析。
[0094]
2.8公共数据库
[0095]
(1)数据下载
[0096]
从geo数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载gse21360数据集的表达数据和平台文件gpl6885。样本动物为8-10周龄雄性c57bl/6j小鼠，数据集共包含了sham组和mcao造模后大脑皮层在不同再灌注时间点(2h、8h、24h)的转录谱。具体样本信息如表1所示。
[0097]
表1 geo数据库的样本信息
[0098][0099]
(2)主要生物信息学分析方法
[0100]
1)单样本基因集富集分析(single-sample gene set enrichment analysis,ssgsea)
[0101]
从xdeathdb(https://pcm2019.shinyapps.io/xdeathdb/)数据库中分别提取与细胞凋亡、parthanatos(parp-1依赖性细胞死亡)相关的基因。使用ssgsea分别计算gse23160中每个样本与细胞凋亡相关基因集、parthanatos死亡相关基因集配对的富集程度，利用参考的基因集得到相对应的机制在转录组表达矩阵中相对应的评分，评分代表了样本中相关基因上调或下调水平。
[0102]
2)加权基因共表达网络分析(weighted correlation network analysis,wgcna)
[0103]
wgcna算法是一种分析具备多种表型信息的多个样品基因表达模式矩阵的方法。通过聚类表达模式相似的基因形成模块，并识别分析模块与特定疾病或疾病特征之间的关联性。本研究中，为缩小wgcna分析的范围，使其更真实准确的反映脑急性缺血再灌注损伤过程中相关性的改变，我们以测序数据筛选得到的degs为分析对象，在gse23160数据集中结合多种疾病相关的性状(疾病状态、造模时间、细胞凋亡分数、parthanatos分数)，进行wgcna分析，识别作为研究对象的degs与目标疾病的表型具有最强相关性的模块和模块中的关键基因。在wgcna分析过程中，首先评估不同测序样本与表型性状之间的离散度，去除离群样本；然后通过相关性值进行冥次运算，得到最佳软阈值(power)。通过选定的软阈值进行网络构建，并关联表型信息进行模块分析。最后，将具有较强相关性且具有统计学意义的模块(p《0.05)进行筛选得到该模块内的基因。
[0104]
3)蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,ppi)网络构建
[0105]
使用string在线数据库(https://string-db.org/)，预测编码蛋白之间可能的相
互作用关系，构建ppi网络。将生成的ppi网络导入cytoscape(v3.9.0)软件，进一步构建可视化网络模型并进行网络分析。网络中的节点代表蛋白质，节点度(degree)即蛋白节点拥有的相互作用个数，degree最高的编码基因被认为是ppi网络中的关键基因。
[0106]
2.9 gsea通路时序分析
[0107]
借助fgsear包的geseca功能，利用远程连接到的msigdb数据库将筛选得到的degs纳入分析，得到与degs相关的富集的功能通路信息。根据得到的padj值大小进行相关性排序，绘制表述通路信息的热图。最后，利用伴随造模后时间的性状信息，将最具有统计学意义的通路上相关基因表达信息与时间性状共同纳入时序分析，从而得到关于通路的激活情况在疾病发生发展不同状态下的信息。
[0108]
2.10生物信息学手段预测关键基因上游调控mirna
[0109]
利用生物信息学在线网站targetscan(http://www.targetscan.org)和mirdb(https://www.mirdb.org)预测前面筛选得到的关键基因的上游调控mirna。为了使得到的mirna更符合疾病的状态，结合在线网站预测结果和测序分析获得的差异表达mirnas，通过韦恩在线分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/)取交集，查找共有的mirna。
[0110]
2.11双荧光素酶报告基因检测
[0111]
(1)重组质粒的构建
[0112]
查找ncbi数据库，获得tnfrsf1a基因3’utr区域与mmu-mir-3059-5p可能的结合位点及其附近237bp的序列，并改变部分互补序列碱基以获得突变型3’utr片段。引物由擎科生物技术公司设计合成。野生型tnfrsf1a3’utr(wt)和突变型tnfrsf1a3’utr(mut)片段，经pcr扩增后，克隆至pmirglo载体上。克隆成功的质粒经转化、提取，测序鉴定合格后备细胞转染用。
[0113]
(2)细胞转染
[0114]
①
用含10％ fbs的dmem培养基培养293t细胞，取对数期的293t细胞消化后重悬，以2
×
105个/ml的密度接种于24孔板，37℃、5％ co2培养箱中继续培养。
[0115]
②
当细胞生长融合度达到约80％，按照以下分组对细胞进行转染，每组设置3个重复：
[0116]
表2细胞分组
[0117][0118]
③
制备转染混合液，a液：0.6μg质粒﹢20pmol mirnaoligo加入50μl无血清dmem培
养基中，轻轻混匀；b液：2μl lipofectamine 2000加入50μl无血清dmem培养基中，轻轻混匀。将a、b液混合均匀，室温静置20min。
[0119]
④
移去原细胞培养上清液，pbs洗涤3次，加入转染混合液，37℃、5％ co2培养箱继续培养。
[0120]
⑤
6h后更换新鲜培养基，24h后进行荧光素酶活性检测。
[0121]
(3)荧光素酶活性检测
[0122]
①
弃去细胞培养上清，pbs清洗细胞2遍。加入细胞裂解液100μl/孔，室温裂解15min。
[0123]
②
吹打细胞使裂解充分，把裂解液收集到1.5ml ep管内，12000rpm离心5min，收集上清。
[0124]
③
吸取5μl上清至96孔板，加入40μl萤火虫荧光素酶检测试剂ⅱ(larⅱ)，混匀后于多功能酶标仪中检测荧光强度。
[0125]
④
加入40μl海肾荧光素酶底物(stop&glo)，混匀后于多功能酶标仪中检测荧光强度。
[0126]
⑤
检测结果利用萤火虫荧光素强度值/海肾荧光素强度值进行标准化校正，以pmirglo-null作为内对照。
[0127]
2.12 ht-22细胞转染
[0128]
将实验用ht-22细胞随机分为：空白对照control组、转染mir-3059-5pmimic(货号：mir1160304024404-1-5，广州ribobio公司)、转染无关序列mimic(nc mimic，货号：mir1n0000001-1-5，广州ribobio公司)、转染mir-3059-5p inhibitor(货号：mir30014811-4-5，广州ribobio公司)、转染无关序列inhibitor(nc inhibitor，货号：mir3n0000001-4-5，广州ribobio公司)。
[0129]
①
ht-22细胞以1
×
106个/孔接种于6孔板，正常培养，待细胞融合度达70％，进行转染。
[0130]
②
用opti-mem培养基稀释lipofectamine 3000试剂：取2个1.5ml ep管，各加入125μl opti-mem培养基，随后分别加入3.75μl和7.5μl lipofectamine3000，充分混合均匀。设置两个浓度的目的是摸索ht-22细胞的lipofectamine3000适用剂量。
[0131]
③
用opti-mem培养基稀释质粒：取一个1.5ml ep管，加入250μl opti-mem，5μg mir-3059-5p mimic/inhibitor(或nc mimic/inhibitor)。然后加入10μl p3000试剂(2μl/μg质粒)，充分混合均匀。
[0132]
④
将前两步配制的溶液各取125μl，充分混合，室温孵育10-15min。
[0133]
⑤
将上述混合液(250μl)加入6孔板，37℃孵育ht-22细胞48h，荧光显微镜下观察或实时定量pcr检测转染效率。
[0134]
2.13实时定量pcr检测
[0135]
(1)组织或细胞中总rna的提取
[0136]
按照常规方法进行。
[0137]
(2)rna的体外反转录合成cdna
[0138]
将表3中的试剂依次加入rnase/dnase-free pcr管中，冰上操作。
[0139]
表3反转录体系1
[0140][0141]
轻轻摇匀，短暂低速离心，65℃孵育5min，冰上冷却。
[0142]
将表4中的试剂依次加入上述pcr管中，冰上操作。
[0143]
表4反转录体系2
[0144][0145]
轻轻混匀，42℃孵育60min，70℃加热5min，终止反应。反应产物可直接用于后续实验或分装放入-80℃冰箱保存。
[0146]
(3)实时荧光定量pcr检测步骤
[0147]
①
所用引物序列如表5所示。
[0148]
表5引物序列
[0149][0150]
②
将稀释后的cdna(100ng/μl)作为模板，反应体系如表6所示。
[0151]
表6实时荧光定量pcr检测体系
[0152][0153]
③
设置反应程序，95℃预变性30s；pcr反应：95℃10s，60℃30s，共40个循环；溶解曲线：95℃15s，60℃1min，每15s升温0.3℃，95℃15s。
[0154]
④
数据分析：使用荧光定量pcr仪检测各模板的ct值，采用2-δδct
计算实验组和对照组目的基因的相对表达量，δct＝ct(目的基因)-ct(内参)，δδct＝δct(实验组)-δct(对照组)。
[0155]
2.14 tunel染色检测细胞凋亡
[0156]
1)将无菌的细胞爬片放入96孔板中，ht-22细胞以1
×
104个/孔的密度接种至96孔板，37℃、5％ co2培养过夜。
[0157]
2)根据实验设计，对不同分组的细胞进行干预处理。
[0158]
3)pbs清洗细胞3次，4％多聚甲醛室温固定15min。
[0159]
4)pbs清洗细胞3次，加入0.3％ tritonx-100通透液，室温孵育5min。
[0160]
5)按照tunel检测试剂盒说明书预先配置好tunel检测工作液，现配现用，不能冻存。每孔加入50μl tunel工作液，37℃避光孵育1h。
[0161]
6)pbs洗3次，每次5min。dapi避光染色，5min。荧光显微镜下随机区域观察并计数阳性细胞。
[0162]
2.15 western blot检测小鼠海马组织中tnfrsf1a及parthanatos死亡相关蛋白表达水平
[0163]
(1)海马总蛋白的提取
[0164]
①
深麻醉后颈椎脱臼处死小鼠，置于冰上断头取脑。
[0165]
②
用眼科剪沿矢状线剪开颅顶皮肤，眼科镊剥离颅骨，注意不要损伤脑组织。完整取出左侧(缺血侧)半球脑组织，冰上剥开大脑皮层，暴露海马组织，与周围组织分离后迅速转移至ep管中，立即进行后续步骤或存储于液氮罐中。
[0166]
③
组织称重后，按组织：ripa：pmsf＝1：10000：100，向组织中加入ripa和pmsf混合液，超声波组织细胞破碎仪对组织进行破碎匀浆。4℃条件下，15000rpm，5min离心，回收上清。
[0167]
(2)western blot检测步骤
[0168]
①
蛋白浓度测定：将不同浓度的bsa标准品(0、0.025μg/μl、0.05μg/μl、0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl、0.5μg/μl)依次加入96孔板的标准孔，20μl/孔，各设置2个复孔。取20μl待测蛋白加入样品孔，每个样品3个重复。每孔均加入200μl预先配置混匀的bca工作液(试剂a：试剂b＝50：1)，混匀后37℃避光孵育30min，酶标仪检测od562nm数值，根据bsa标准品测定值绘制标准曲线，计算待测样品浓度。
[0169]
②
将30μg蛋白按浓度换算成对应的体积，按照总体积：5
×
loading buffer＝4：1的比例，加入5
×
loading buffer混匀，金属浴100℃煮沸10min，12000rpm离心10min。
[0170]
③
电泳：选用4-20％ surepagetm梯度预制胶，电泳槽内倒入充足的电泳液。将样品加入上样孔，两侧边孔分别加入3μl蛋白marker。以130v恒压进行电泳。
[0171]
④
转膜：根据蛋白marker所指示的分子量，对凝胶进行裁剪，保留目的蛋白对应位置的凝胶。将pvdf膜裁剪成对应尺寸，甲醇浸泡激活后待用。组装转膜夹，确认从负极到正极按顺序依次放置海绵-凝胶-pvdf膜-海绵，插入eblot l1快速湿转仪进行转膜。
[0172]
⑤
封闭：取出pvdf膜，浸泡在5％脱脂牛奶中，室温下置于摇床上封闭2h。
[0173]
⑥
抗体孵育：结束封闭，pvdf膜浸泡在tbst缓冲液中漂洗5min
×
3次。分别加入以适当比例稀释的一抗：tnfrsf1a1：1000，parp-1 1：1000，aif 1：1000，histone h3 1：5000，cox iv 1：5000，gapdh 1：5000，置于摇床上4℃孵育过夜。次日，用tbst缓冲液洗膜10min
×
3次，根据一抗种属将pvdf膜浸泡在对应的二抗(1：5000)中，室温孵育90min。结束后重复tbst缓冲液洗膜，10min
×
3次。
[0174]
⑦
显影和图像采集：黑暗环境中，将ecl工作液a和b等比例混合配制发光液，均匀滴加在pvdf膜上。将pvdf膜放入曝光机中，采用alphaview软件进行曝光和图像获取。
[0175]
2.16统计学分析
[0176]
应用graphpad prism 8.0.2软件进行实验数据的统计学分析，组间数据比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，结果以平均数
±
标准差(x
±
s)的形式表示，p＜0.05时认为差异具有统计学意义。
[0177]
二、实验结果
[0178]
1、监测脑血流判定mcao/r模型稳定性
[0179]
利用激光微循环血流成像仪检测造模期间小鼠脑血流，结果显示插入线栓阻塞大脑中动脉即刻，小鼠梗阻侧脑血流下降至基线值的23.18％
±
1.14％；阻塞60min后拔出线栓，脑血流恢复至基线值的76.28％
±
3.24％(图1a)。小鼠脑基线状态、线栓插入即刻和再灌注24h后的脑血流灌注成像图见图1b。
[0180]
2、mrna-seq样本基因表达量总体分析
[0181]
根据各样本的fpkm值，绘制箱线图(图2a)。样本间基因表达水平的相关性是检验实验可靠性的重要指标，样本间相关性系数越高，表示样本之间表达模式的相似度越高。本次测序中所有样本间相关性系数均大于0.8，说明重复效果好，可继续后续分析(图2b)。利用样本间主成分(principal component analysis，pca)分析评估sham组和mcao/r组组间差异以及组内样本生物学重复的聚类质量，可见两组之间的样本可以显著区分，且同组样本的聚类尚可(图2c,d)。
[0182]
3、sham组与mcao/r组间差异表达分析
[0183]
以|log2fc|＞1且padj＜0.05为筛选阈值进行sham组和mcao/r组间基因差异表达分析，并绘制火山图对结果进行可视化。共鉴定出1107个差异表达基因(differentially expressed genes,degs)，其中919个基因表达上调，188个基因表达下调，并标记出上调和下调最显著的前5个基因(图3)。
[0184]
4、各样本细胞凋亡和parthanatos评分
[0185]
采用ssgsea计算各样本的细胞凋亡及parthanatos死亡评分，结果显示mcao/r组
样本细胞凋亡评分及parthanatos死亡评分均显著高于sham组样本(图4)。
[0186]
5、gsea时序分析
[0187]
如图5a所示，得到具有统计学意义的通路热图。其中tnfa_signaling_via_nfkb、apoptosis通路都是后续要特别关注的通路。针对最具有统计学意义的tnfa_signaling_via_nfkb通路进行时序分析，结果如图5b所示，随着造模后时间的推移，始终伴随着通路的激活。表明该通路在疾病的发生和进展过程中，都起到了一定的作用。
[0188]
6、加权共表达网络构建和关键模块识别
[0189]
利用pearson相关系数对gse23160中的样本进行聚类，绘制样本聚类树状图和目标临床特征信息的关联性热图(图6a)，可以观察到聚类树中没有离群样本的存在。根据软阈值β的选取标准，即无尺度拟合指数r2＞0.8且平均邻接系数＜100，选取合适的软阈值β(图6b)。当β＝16时，r2＝0.9，斜率为-1.38，此时的基因表达网络可认为近似无尺度网络分布(图6c)。
[0190]
构建基因间的系统聚类树，采用动态混合剪切树算法识别出若干由不同颜色表示的基因模块，相同颜色的模块表示其中的基因共表达程度高。聚类分析合并相似程度高的模块，最终得到蓝色模块、绿松石色模块和灰色模块，其中灰色模块代表无法归类到任何模块中的基因(图7a)。最后，将得到的基因模块与细胞凋亡、parthanatos死亡、疾病、再灌注时间等性状进行相关性分析，发现绿松石色模块特征基因与上述性状均呈显著正相关性(p《0.05，图7b)。
[0191]
7、关键基因的ppi分析
[0192]
提取绿松石色模块基因(317个)，通过韦恩分析与细胞凋亡和parthanatos死亡(apoptosis&parthanatos)相关基因集取交集，最终获得12个关键基因(图8a)。对关键基因进行ppi分析，degree(网络中一个节点与其他节点的连接数量)最高的两个基因分别是tnfrsf1a和caspase-8(图8b)。结合2.2.5时序分析富集到的tnfa_nf-κb信号通路，确定关键因子tnfrsf1a。
[0193]
8、关键基因tnfrsf1a的表达
[0194]
确定关键基因tnfrsf1a后，我们利用qpcr和western blot技术分别从体外和体内验证is对tnfrsf1a表达水平的影响。结果显示，与control组相比，ogd/r处理后的ht22细胞中tnfrsf1amrna和蛋白表达水平显著提高(图9a、b)；同样地，相较于sham组，mcao/r组小鼠脑组织tnfrsf1a mrna和蛋白表达明显增加(图9c、d)。
[0195]
9、对tnfrsf1a上游mirna的预测和验证
[0196]
对sham组和mcao/r组样本mirna-seq测序结果进行差异表达分析，设置|log2fc|＞1且padj＜0.05为筛选阈值，共鉴定出994个差异表达mirna(differentially expresses mirna，demirna)，其中774个上调，220个下调，见图10a。分别利用targetscan和mirdb在线数据库预测tnfrsf1a上游调控mirna，并通过韦恩分析将预测结果与测序数据demirna取交集，共得到5个mirna(mmu-mir-3059-5p、mmu-mir-3102-3p、mmu-mir-223-5p、mmu-mir-324-5p和mmu-mir-5621-3p)，见图10b。其中，只有mmu-mir-3059-5p在mcao/r组样本中表达显著下调，而其余4个mirna表达均上调，因此选定mir-3059-5p是is关键基因tnfrsf1a的上游调控mirna并进一步验证二者间的结合关系。
[0197]
构建野生型tnfrsf1a 3’utr(wt)结合序列和突变型tnfrsf1a 3’utr(mut)结合序
列，克隆至荧光素酶报告质粒中，并分别和mir-3059-5pmimic或nc mimic共转染到293t细胞中。实验结果显示(图10c)，同时转染tnfrsf1a 3’utr(wt)和mir-3059-5p mimic可以显著降低293t细胞中荧光强度，而tnfrsf1a 3’utr(mut)组未检测到荧光强度降低。此外，在ht-22细胞中过表达mir-3059-5p，tnfrsf1a蛋白的表达量明显降低(p《0.01)；相反地，抑制ht-22细胞中mir-3059-5p水平，tnfrsf1a蛋白的表达量显著增加(p《0.01)，见图10d。
[0198]
10、mir-3059-5p对ogd/r诱导ht-22细胞凋亡和parthanatos死亡的影响
[0199]
通过拯救实验，进一步研究在ogd/r处理的ht-22细胞中，mir-3059-5p对tnfrsf1a的调控作用及其对细胞parthanatos和凋亡的影响。western blot结果显示(图11a-c)，与control组相比，ogd/r组神经元中parp-1表达水平显著提高(p《0.0001)，aif从线粒体向细胞核转位，核内aif表达水平显著提高(p《0.0001)；与ogd/r组相比，过表达mir-3059-5p显著降低了ogd/r处理的神经元细胞中parp-1表达量(p《0.0001)，与此同时，尽管过表达mir-3059-5p后，在ht-22细胞线粒体中aif的表达变化无统计学意义，但细胞核中aif的表达量显著降低(p《0.01)，提示抑制了aif向细胞核转位。而进一步转染tnfrsf1a过表达质粒后，ogd/r+mir-3059-5p+pcdna-3.1-tnfrsf1a组parp-1表达量及核内aif表达量均显著高于ogd/r+mir-3059-5p+pcdna-3.1组，提示tnfrsf1a的过表达可以逆转mir-3059-5p对细胞parthanatos死亡的抑制作用。同样地，我们利用tunel染色检查各组细胞凋亡情况，结果显示，过表达mir-3059-5p显著降低了ht-22细胞凋亡率(p《0.0001)，但tnfrsf1a的过表达部分逆转了mir-3059-5p的这一作用(p《0.01)，见图11d、e。
[0200]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.tnfrsf1a抑制剂在制备预防或治疗脑卒中的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脑卒中是缺血性脑卒中。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述tnfrsf1a抑制剂包括减少tnfrsf1a蛋白的活性、降低tnfrsf1a基因或蛋白的稳定性、下调tnfrsf1a蛋白的表达、减少tnfrsf1a蛋白有效作用时间或抑制tnfrsf1a基因的转录和翻译的物质。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述tnfrsf1a抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述核酸抑制剂包括shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述微小rna是mir-3059-5p。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述tnfrsf1a抑制剂还包括促进mir-3059-5p表达的试剂。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进mir-3059-5p表达的试剂是mir-3059-5p mimic。9.一种治疗脑卒中的药物，所述药物包含tnfrsf1a抑制剂。10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述tnfrsf1a抑制剂如权利要求1-8中任一项中所述。

技术总结
本发明公开了TNFRSF1A抑制剂miR-3059-5p在治疗脑卒中疾病中的用途。本发明的实施例证明miR-3059-5p可通过负性调控TNFRSF1A表达水平抑制OGD/R诱导的神经细胞凋亡和Parthanatos死亡，进而减轻OGD/R造成的神经元损伤。故本发明的研究成果为临床上治疗脑卒中提供了一种潜在的新型药物。提供了一种潜在的新型药物。提供了一种潜在的新型药物。


技术研发人员：董贝贝 张馨月 于泳浩 陈红光 王元琳
受保护的技术使用者：天津医科大学总医院
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/8/1