有色蛋白的新用途的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及有色蛋白的新用途。


背景技术：

2.pcr即聚合酶链式扩增技术，已经广泛用于科学研究及临床诊断。pcr体系反应配制时需要将试剂加入到pcr管或pcr板内。但当人工加样操作时，由于pcr试剂无颜色，很容易漏孔或重复加样，尤其使用96孔板或384孔板等更容易发生。目前普通pcr预混液及sybr green法定量pcr预混液加入了溴酚蓝等化学染料作为加样指示剂，大大避免了这些加样操作误差。
3.但是在临床诊断上广泛应用的探针法定量pcr预混液尚无合适的加样指示剂。探针法荧光定量pcr染料往往使用多重pcr技术，即采用多荧光通道检测，化学染料在pcr循环的加热过程中无法降解，会对荧光信号检测产生干扰。有色蛋白是近几年来新从珊瑚和海葵发现的新型蛋白，目前只应用于蓝白斑筛选及细胞传感器用途，在国内外尚无研究和发明应用于pcr加样指示剂。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供有色蛋白的新用途，其作为pcr加样指示剂，避免了pcr试剂加样操作误差。
5.本发明公开了有色蛋白作为pcr试剂加样指示剂的用途，所述有色蛋白为珊瑚或海葵的有色蛋白；
6.本发明技术原理：为了替代不易热降解的化学染料作为pcr试剂加样指示剂，本发明制备了来自珊瑚或海葵的有色蛋白，由于蛋白指示剂可在pcr循环的加热过程中蛋白变性失去原来的可见光吸收特性，从而不对探针法荧光pcr检测信号产生干扰作用，从而成为一种可兼容荧光pcr及普通pcr的新型指示剂。
7.在另一优选例中，所述有色蛋白不限于来源于珊瑚或海葵的有色蛋白，包括amilcp(q66pv0)、spiscp(a8clx6)、aacucp(q66pu8)、ahyacp(q66pu9)、gfascp(a8clv6)、gdjicp(a8cll3)、stylcp(a8clm7)、meffcp(a8clm1)，meffblue(p83690)、gtcp(q95p04)、aecp597(q95p04)、aecp597(q2vfp3)asfp595(q9gz28)cjblue(a0aqq7)或基于以上发色基团氨基酸进行突变改造的有色蛋白。优选amilcp(q66pv0)及其突变体。
8.在另一优选例中，所述荧光pcr不限于于探针法荧光pcr或染料法荧光pcr，所述探针法荧光pcr为水解探针、分子信标等特异性探针法荧光pcr，所述染料法荧光pcr为sybrgreen，evgreen等染料法荧光pcr，优选为探针法荧光pcr；
9.在一些优选项中，所述有色蛋白作为pcr加样指示剂加入所述pcr试剂，其加入终浓度为1.27mg/ml-3.68mg/ml，所述pcr试剂不限于pcr预混液，pcr反应缓冲液，酶混合液等pcr制剂形态，优选pcr预混液
10.本发明的有益效果：本发明技术方案解决了一种可兼容荧光pcr及普通pcr的新型
指示剂，尤其解决了临床诊断常用的pcr诊断试剂加样漏孔或重复加样问题。
附图说明
11.图1不同浓度amilcp及spiscp对pcr试剂颜色深浅的影响。
12.图2不同浓度amilcp对pcr扩增曲线的影响。
13.图3不同浓度spiscp对pcr扩增曲线的影响。
14.图4 2.5mg/ml amilcp及spiscp对各荧光通道的pcr扩增曲线的影响。
具体实施方式
15.术语
16.在本发明中，术语“有色蛋白”，英文“chromoproteins”是指目前从珊瑚和海葵中发现的不产生荧光但具有颜色蛋白被称为有色蛋白。荧光蛋白的检测需要紫外光源，荧光检测设备或者流式细胞仪等昂贵的设备，并且检测时可能会有紫外破坏样品，强背景荧光及光漂白等负面影响。而有色蛋白仅需要吸收环境光即可肉眼可见，且无需任何仪器设备。有色蛋白的结构和荧光蛋白非常类似，也是由220-240个氨基酸组成的小分子量蛋白。在高级结构上也是由两部分组成，圆桶状蛋白骨架和内部的发色基团，类似“灯笼”的结构。圆桶状结构是有11条β链交织而成，将发色基团与周围环境中水分子等隔离，以保证发色的稳定性，类似于灯笼的“防风”功能。而57-74位氨基酸的肽链被包裹在桶内部，其中几个氨基酸残基由于空间位置形成共价键的发色基团，类似灯笼内部的“蜡烛”。通过x射线衍射晶体学研究发现，有色蛋白在溶液中往往以二聚体形式存在，且进行发色基团相关氨基酸突变可改变蛋白的颜色。目前为止，至少发现了30多而在珊瑚和海葵中发现的有色蛋白发现了仅仅十几种(表1)。
17.表格1.在珊瑚和海葵发现的有色蛋白
18.蛋白名uniprot编号基因来源最大吸收波长amilcpq66pv0acropora millepora(多孔鹿角珊瑚)588nmspiscpa8clx6stylophora pistillata(萼形柱珊瑚)560nmaacucpq66pu8acropora aculeus(尖锐轴孔珊瑚)580nmahyacpq66pu9acropora hyacinthus(风信子鹿角珊瑚)580nmgfascpa8clv6galaxea fasciculari(丛生盔形珊瑚)577nmgdjicpa8cll3goniopora djiboutiensis(大角孔珊瑚)583nmstylcpa8clm7stylocoeniella sp.(罩柱群珊瑚)574nmmeffcpa8clm1montipora efflorescens(繁锦蔷薇珊瑚)574nmmeffbluep83690montipora efflorescens(繁锦蔷薇珊瑚)592nmgtcpq95p04goniopora tenuidens(圆孔状管孔珊瑚)580nmaecp597q2vfp3actinia equina(等指海葵)597nmasfp595q9gz28anemonia sulcata(蛇卷海葵)595nmcjbluea0aqq7cnidopus japonicus(日本皮上海葵)610nm
19.在本发明中有色蛋白不限于表1所述的14种野生蛋白，也不限于基于以上有色蛋白对57-74位氨基酸进行改造突变的变色的有色蛋白。
[0020]“pcr加样指示剂”是指pcr或荧光定量pcr中加入的化学染料或蛋白染料，以肉眼可见的颜色防止加样时漏加或重复加样。目前使用的加样指示剂主要是化学染料，尚无蛋白类指示剂。从原理上来说，pcr过程中蛋白类指示剂添加因加热变性，不会干扰荧光pcr的信号通道检测。且这种蛋白指示剂生产与化学染料生产的相比对环境污染小。
[0021]
来自珊瑚和海葵的有色蛋白目前国际研究尚处于起步阶段，已经应用于蓝白斑筛选，细胞生物传感器及合成生物学指示剂，但这些用途都仅限于活细胞内标记显色用途，尚无研究报道和专利发明用于体外检测包括pcr检测。
[0022]
本发明中是有色蛋白的新用途，不限于荧光pcr试剂，普通pcr试剂以及基于pcr体系检测的试剂用途。
[0023]
术语“荧光定量pcr”指实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr)是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。real-timepcr是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。荧光定量pcr检测过程pcr体系容易被具有吸收或荧光的物质影响。目前临床诊断常用的探针法荧光pcr尚无添加指示剂来防止漏加或重复加样。
[0024]
本发明中所述的探针法荧光pcr不限于基于dna检测的荧光pcr及基于rna检测的rt-qpcr。
[0025]
如本文所用“探针”是指与靶核酸通过杂交相互作用的核酸。探针可与靶核酸序列完全互补或部分互补。互补水平将取决于多种因素，通常是基于探针功能。探针可以本领域中熟知的多种方式中的任一种方式经标记或未标记，或经修饰。探针可与靶核酸特异性地杂交。探针可为dna、rna或rna/dna杂合体。探针可为寡核苷酸、人工染色体、片段化人工染色体、基因组核酸、片段化基因组核酸、rna、重组核酸、片段化重组核酸、肽核酸(pna)、锁核酸、环状杂环的寡聚体或核酸的偶联物。探针可包含经修饰核碱基、经修饰糖部分和经修饰核苷酸间连接。探针可用于检测甲基化靶核酸的存在或不存在。探针长度通常为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100个核苷酸或更长。
[0026]
所述探针不限于水解探针，分子信标等特异性探针标记，优选水解探针。所述探针的5’端标记的荧光基团为选自fam、hex、cy5、tet、joe、cy3、tamra、rox、vic中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl中的任一种。
[0027]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0028]
实施例1：有色蛋白的克隆表达及纯化。
[0029]
本实施例提供的amilcp及spiscp基因序列见如uniprot数据库编号分别为q66pv0、a8clx6所示，经密码子优化后获得其用于大肠杆菌表达的基因序列。
[0030]
本实施例提供的amilcp及spiscp的制备方法包括如下步骤：
[0031]
(1)将amilcp及spiscp所对应的核苷酸序列分别无缝克隆至pet-28a的xbai和
noti之间的多克隆位点，获得amilcp重组载体和spiscp重组载体。
[0032]
(2)将重组载体转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布于含卡那霉素的平板，37℃过夜培养。
[0033]
(3)通过菌落pcr以及测序筛选阳性克隆，将筛选的阳性克隆菌株接种到液体lb培养基中37℃，200rpm培养，当培养液od
600
值达到0.6左右加入iptg至终浓度1mm进行诱导，37℃过夜诱导。
[0034]
(4)诱导结束离心收集菌体，用匀浆破碎仪进行细胞破碎，破碎后12000rpm离心5min，收集上清液。将上清液用0.22μm滤膜过滤，获得粗酶液。
[0035]
(5)将过滤后的粗酶液过镍亲和层析柱，以不同咪唑浓度的缓冲液进行杂蛋白洗涤，以及目的蛋白的洗脱，并根据紫外吸收图谱收集目的蛋白。通过sds-page凝胶鉴定收集液中目的蛋白纯度。
[0036]
(6)将含有目标蛋白的收集液置于50kd的超滤管中，离心浓缩和换液。
[0037]
实施例2：有色蛋白的添加浓度摸索
[0038]
(1)将amilcp和spiscp加入到2
×
qpcr预混液中(toroivd)配制了8种不同蛋白浓度的试剂组合，试剂中的两种蛋白浓度分别如下表所示，浓度单位为mg/ml，使用不含添加有色蛋白的空白试剂作为对照试剂：
[0039]
序号12345678amilcp(mg/ml)0.531.061.572.082.573.063.534.00spiscp(mg/ml)0.641.271.892.503.103.684.254.81
[0040]
试剂呈现出如图1不同深浅的颜色，选择可以通过观察进行明显区分的颜色范围进行下一步测试，测试加入有色蛋白后，是否会对ct值和荧光信号产生影响，其中含amilcp的试剂选择的浓度选择范围为1.57mg/ml-3.57mg/ml(3-7)，共5个浓度；含spiscp的试剂选择浓度选择范围为1.27mg/ml-3.68mg/ml(2-6)，共5个浓度。
[0041]
(2)使用非洲猪瘟rox和vic标记的引物探针5ul(oie公布)，5ul非洲猪瘟vp72质粒模板，10ul含amilcp或spiscp的2
×
qpcr预混液中(toroivd)配制成20ul反应体系。荧光定量仪器的循环条件为设置为：95℃，5min；(95℃，10sec，60℃，30sec)45循环。以不加入有色蛋白的2
×
qpcr预混液中配制的体系为对照。
[0042]
(3)如图2、3所示，在rox及vic通道中添加不同浓度的amilcp和spiscp对扩增曲线的起峰位置决定ct值及荧光信号影响不大。选择amilcp在试剂中的浓度为2.57mg/ml，spiscp在试剂中的浓度为2.5mg/ml，用于后续的测试。
[0043]
实施例3：有色蛋白的对不同荧光通道检测影响
[0044]
(1)根据实施例2的实验结果，选择amilcp和spiscp在预混液中的浓度为2.5mg/ml配制试剂，使用rox，vic，fam，cy5，tamara等5种标记的荧光探针标记进行测试，分析试剂中加入amilcp或spiscp后是否对常用五种荧光通道信号及ct值的影响。
[0045]
反应体系配制及循环条件按实施例2中进行，如图4发现，2.5mg/ml的amilcp和spiscp蛋白加入2
×
qpcr预混液中(toroivd)对rox，vic，fam，cy5，tamara五个常用通道的ct值和荧光信号值没有明显明显，可以作为qpcr预混液指示剂使用。
[0046]
实施例4：有色蛋白指示剂不干扰pcr荧光的原理研究。
[0047]
经过大量测试发现有色蛋白不会探针荧光pcr的荧光信号影响，推测可能是由于
pcr过程中的加热使得该有色蛋白变性而失去颜色。为了证明这个原理，对有色蛋白进行了95℃，15min加热实验。经过95℃，15min的amilcp的蓝色完全失去，解释了这种有色蛋白添加剂不干扰荧光的机理。
[0048]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

技术特征：
1.有色蛋白作为pcr试剂加样指示剂的用途，所述有色蛋白为珊瑚或海葵的有色蛋白。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述有色蛋白为amilcp、spiscp、aacucp、ahyacp、gfascp、gdjicp、stylcp、meffcp、meffblue、gtcp、aecp597、aecp597、asfp595、cjblue或基于以上发色基团氨基酸进行突变改造的有色蛋白。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述有色蛋白为amilcp及其突变体。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述pcr为荧光pcr或普通pcr。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述荧光pcr为于探针法荧光pcr或染料法荧光pcr。6.如权利要求1所述的用途，所述有色蛋白作为pcr加样指示剂加入所述pcr试剂，其加入终浓度为1.27mg/ml-3.68mg/ml。7.如权利要求6所述的用途，所述有色蛋白为amilcp时，amilcp的试加入终浓度为1.57mg/ml-3.57mg/ml。8.如权利要求6所述的用途，所述有色蛋白为spiscp时，spiscp的试加入终浓度为1.27mg/ml-3.68mg/ml。9.如权利要求1所述的用途，所述pcr试剂为pcr预混液，pcr反应缓冲液或酶混合液。10.如权利要求1所述的用途，所述pcr试剂为pcr预混液。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及有色蛋白的新用途。本发明公开了有色蛋白作为PCR试剂加样指示剂的用途，所述有色蛋白为珊瑚或海葵的有色蛋白。本发明技术方案解决了一种可兼容荧光PCR及普通PCR的新型指示剂，尤其解决了临床诊断常用的PCR诊断试剂加样漏孔或重复加样问题。样问题。


技术研发人员：徐真 王炳然 鞠毅堂 张玉晴 赵兴聪 陈普 李振海 王学东
受保护的技术使用者：天罗诊断科技江苏有限公司
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/8/1