Syrosingopine/LOD共负载纳米酶、其制备方法和应用

syrosingopine/lod共负载纳米酶、其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于纳米载体与生物医药技术领域，涉及一种共负载的纳米材料，具体涉及syrosingopine/lod共负载fe3o4纳米酶。本发明还提供了其制备方法及其肿瘤协同治疗应用。


背景技术：

2.肿瘤形成了快速生长、迁移、侵袭、免疫逃避、远处转移的有效的系统机制，典型表现为在缺氧情况下能量代谢异常而分泌大量乳酸，称为“warburg效应”。肿瘤细胞糖酵解引起的乳酸代谢引起的细胞内外ph反向梯度(即细胞内为弱碱性，细胞外为弱酸性)，为有效的基于纳米治疗的癌症治疗设置了巨大障碍，但同时也为肿瘤治疗提供了一个生物学的线索。
3.最近，基于纳米疗法的治疗方法在解决乳酸分泌问题以有效治疗癌症方面受到了广泛关注。到目前为止，主要有两种策略通过靶向逆转上述细胞ph反向梯度来实现增强的肿瘤抑制：一种是通过特定的试剂，如sirna、小分子抑制剂等，降低肿瘤细胞乳酸分泌的程度，导致肿瘤因细胞内和细胞外环境的恶化而衰竭。另一种策略是联合治疗，通过协同抗肿瘤作用为解决这种系统性性疾病提供了更好的途径。
4.当前，已经有部分文献报道基于乳酸分泌的纳米系统用于癌症的治疗，但是具有以下几方面的缺点：(1)忽略了癌症是一个系统性的问题，单一或者简单叠加的治疗手段难以进行有效的肿瘤治疗。(2)纳米载药系统设计复杂，效应发挥的稳定性令人怀疑且提高了应用成本。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种四氧化三铁载带syrosingopine/lod纳米材料，并将其应用于肿瘤的协同治疗。
6.本发明的另一个目的是提供上述四氧化三铁载带syrosingopine/lod纳米材料的制备方法。
7.本发明首次实现了利用fe3o4纳米酶作为载体，联合载带syrosingopine/lod，设计简单可靠，合成简便，载药效率高，同时实现了肿瘤的化学动力学/免疫/饥饿治疗的协同作用。凡是以糖酵解作为主要供能方式代谢外排大量乳酸的肿瘤治疗均可适用本发明的技术方法。且该方法还可以对传统的pd-l1免疫检查点治疗方式起到明显的增效作用。
8.本发明提供了一种共负载的纳米材料，所述的纳米材料是syr/lod@hfe3o4纳米颗粒，可以适用于具有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂/lod@四氧化三铁纳米颗粒。
9.优选地，所述四氧化三铁纳米颗粒是空心四氧化三铁纳米颗粒，所述空心四氧化三铁纳米颗粒的粒径为100-200nm。
10.本发明提供了一种lod/含有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂的纳米材料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
11.(1)将乙醇、去离子水、氨水使用磁力搅拌混合均匀后加入teos，搅拌，得到实心二氧化硅纳米颗粒；
12.(2)将上述获得的氧化硅纳米颗粒、二茂铁按照质量比1：(3-5)分散在丙酮中，高功率水域超声以充分分散，随后逐滴滴加过氧化氢，过氧化氢与丙酮的比例为1：(25-35)，继续搅拌1.5-2h；转移混合液到高压釜中，180-250℃反应24-50h；依次使用乙醇和水离心洗涤；
13.(3)将步骤(2)获得的产物加入到15-30ml、浓度为2m的碳酸钠中，50℃-65℃静置过夜，使用去离子水离心洗涤获得四氧化三铁纳米颗粒；
14.(4)将上述获得的四氧化三铁纳米颗粒与聚丙烯胺盐酸盐溶液共混，四氧化三铁纳米颗粒与聚丙烯胺盐酸盐溶液的比例为1：(4-5)，质量比，超声搅拌反应2h，离心收集产物后，分散到50mg的聚丙烯酸溶液中，超声搅拌反应2h，离心收集产物后，将其分散在5ml的去离子水中，在超声条件下缓慢滴加40mg氨基聚乙二醇(mpeg-5k-nh2，mw＝5000)1ml，超声搅拌10min后，使用2m的na2co3将反应溶液ph值调节到8.0，随后加入15mg的edc并搅拌12h后得到peg化的四氧化三铁纳米颗粒并命名为hfe3o4纳米颗粒；
15.(5)将四氧化三铁纳米颗粒纳米颗粒加入到含有具有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂的dmso溶液中混合，使用去离子水离心洗涤后获得具有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂@四氧化三铁纳米颗粒；所述的mct1/mct4双抑制的药物或者制剂添加量为0-500μg/mg nps，反应时间为1-12h；
16.(6)将上述获得的具有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂@四氧化三铁纳米颗粒分散在去离子水中，加入0-200μg/mg nps的lod，0-4℃翻转反应6-24h；使用去离子水离心洗涤，获得具有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂/lod@四氧化三铁纳米颗粒。
17.本发明中，teos是指ethylsilicate，中文名称正硅酸乙酯，别称：等硅酸乙酯、硅酸四乙酯、亚硅酸乙酯。dmso是指二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)。四氧化三铁纳米颗粒优选为空心四氧化三铁纳米颗粒。
18.所述步骤(1)中，乙醇：去离子水可以在9:1到6:4范围内。乙醇、去离子水、氨水需要混合均匀，三者的体积比可以是(20-30)：(1-2)：1，优选为25:1:1，体积比。teos与上述三者混合液的比例为1：(15-20)，优选为1:18，体积比。本发明的一个优选例中，50ml的乙醇，2ml的去离子水，2ml的氨水，磁力搅拌混合均匀后一次性加入3ml的teos。
19.所述步骤(2)中，二氧化硅纳米颗粒和二茂铁的比例为1：(3-5)，优选为1:4，质量比。混合物与丙酮的比例为(3-5)：1，质量体积比。本发明的一个优选例中，25mg的二氧化硅纳米颗粒、0.1g的二茂铁分散在30ml的丙酮，高功率水域超声20min以充分分散，随后逐滴滴加1ml的过氧化氢，继续搅拌2h。转移混合液到聚四氟乙烯高压釜中反应36小时以上，以能够生产稳定的产物为准。
20.步骤(3)中，在弱碱性条件下获得四氧化三铁纳米颗粒。可以将步骤(2)获得的产物加入到碳酸钠中，50℃-65℃静置至少8小时，然后使用去离子水离心洗涤。
21.步骤(4)中，共混的四氧化三铁纳米颗粒与聚丙烯胺盐酸盐溶液比例为1：(3-6)，优选1:5，质量比。盐溶液的浓度可以是5-10mg/ml。本发明的一个优选例中，称量10mg四氧化三铁纳米颗粒与50mg的聚丙烯胺盐酸盐溶液共混。
22.所述步骤(5)中，具有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂(优选为syr)的添加量为
0-500μg/mg nps，优选为100-300μg/mg nps。混合反应时间为1-12h，优选为至少2小时。其中，nps是指nanoparticles,中文称为纳米颗粒。在本发明的一个优选例中，步骤(5)中，取1mg四氧化三铁纳米颗粒纳米颗粒加入到50μl的syr的dmso溶液，浓度为1-25mg/ml，优选为10mg/ml，混合1-2h。
23.所述步骤(6)中，lod添加量为0-200μg/mg nps，优选为50-150μg/mg nps；翻转反应时间为6-24h，优选为12-18h。在本发明的一个优选例中，步骤(6)中，具有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂@四氧化三铁纳米颗粒分散在1ml去离子水中，加入50μg lod，4℃翻转反应12h；或者，使用去离子水离心洗涤三次。
24.本发明中，syr即syrosingopine，cas号为84-36-6，中文称为乙酯利血平，临床上作为降血压药物使用。lod是指乳酸氧化酶。本发明获得的四氧化三铁载带syr/lod纳米材料也可以称为syrosingopine/lod双载的四氧化三铁纳米材料，或者syrosingopine/lod共负载fe3o4纳米酶。
25.优选地，本发明提供了一种syrosingopine/lod双载的四氧化三铁纳米材料的合成方法。具体而言，本发明提出的空心四氧化三铁载带syrosingopine/lod纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
26.(1)准确称取50ml的乙醇，2ml的去离子水，2ml的氨水，磁力搅拌混合均匀后一次性加入3ml的teos，搅拌反应4h，得到实心二氧化硅纳米颗粒；
27.(2)准确称量上述获得的25mg的二氧化硅纳米颗粒、0.1g的二茂铁分散在30ml的丙酮，高功率水域超声20min以充分分散，随后逐滴滴加1ml的过氧化氢，继续搅拌2h。转移混合液到聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应48h。所得产物使用乙醇和水各离心洗涤3次；
28.(3)将(2)中获得产物加入到20ml的2m的碳酸钠，60℃静置12h，使用去离子水离心洗涤三次获得空心的四氧化三铁纳米颗粒；
29.(4)准确称量10mg上述获得的空心四氧化三铁纳米颗粒与50mg的聚丙烯胺盐酸盐溶液共混，超声搅拌反应2h，离心收集产物后，分散到50mg的聚丙烯酸溶液中，超声搅拌反应2h，离心收集产物后，将其分散在5ml的去离子水中，在超声条件下缓慢滴加40mg氨基聚乙二醇(mpeg-5k-nh2，mw＝5000)水溶液1ml，超声搅拌10min后，使用2m的na2co3将反应溶液ph值调节到8.0，随后加入15mg的edc并搅拌12h后得到peg化的四氧化三铁纳米颗粒并命名为hfe3o4纳米颗粒；
30.(5)准确称取1mg的hfe3o4纳米颗粒加入到50μl的syr dmso溶液(10mg/ml)混合1小时，使用去离子水离心洗涤三次后获得syr@hfe3o4纳米颗粒；
31.(6)将上述获得载带syr的纳米颗粒分散在1ml去离子水中，加入50μglod，4℃翻转反应12h。使用去离子水离心洗涤三次，获得syr/lod@hfe3o4纳米颗粒。
32.优选地，所述syr的载带量和载带率分别为5-20w/w％nps和75～95％，质量百分比。
33.本发明提供了所述的具有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂/lod@四氧化三铁纳米颗粒在制备抗肿瘤药物或者试剂中的应用。本发明的lod/含有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂的纳米材料能够实现乳酸到过氧化氢到羟基自由基的转化，或者实现肿瘤的化学动力/免疫/代谢联合治疗，提高icb治疗效果。
34.优选地，本发明提供了一种syrosingopine/lod双载的四氧化三铁纳米材料在肿
瘤化学动力/免疫/代谢治疗的应用。μg
35.优选地，本发明提供了所述纳米材料在制备抗肿瘤药物或者试剂中的应用。本发明的syr/lod双载的四氧化三铁纳米材料能够抑制肿瘤细胞的增殖，降低肿瘤细胞的存活数量和存活率。所述的四氧化三铁纳米材料中，syr和lod的质量比为(0-5)：(0-2),不包括端值0。优选地，syr和lod的质量比为(0-5)：1，更优的，syr和lod的质量比为(0.5-4)：1。以1mg的纳米酶载体为例，lod是20-50μg，syr是200-250μg，这样的双药载带纳米酶体系的联合抑瘤效果较好；而syr是200μg时，lod是30、35、40、50μg时，syr/lod双载的四氧化三铁纳米材料具备更好的抑制肿瘤的效果。
36.优选地，syr/lod@hfe3o4纳米颗粒的应用方法包括：
37.(1)在磷酸盐缓冲液(0.05m,ph 6.5)中加入1mm乳酸乳酸(lactic acid:la)，100μg/ml的lod@hfe3o4纳米颗粒，在室温下孵育30min，每隔5min取样测试过氧化浓度；对于羟基自由基的检测，在反应液中加入10μg/ml的
38.(2)3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine:tmb)，室温孵育30min后测定450-800nm的紫外吸收；
39.(2)在荷瘤裸鼠通过尾静脉注射的方式注射纳米颗粒，剂量20mg/kg，分别于第0、3、6、9、12天注射纳米颗粒。注射后14天内每2天用数字卡尺测量肿瘤的长度和宽度；
40.(3)将荷瘤小鼠进行免疫治疗研究。纳米颗粒分别于第0、3、6、9、12天尾静脉注射，剂量为10mg/kg；注射nps后24h注射α-pdl1(静脉注射，剂量1mg/kg)。治疗期间，每隔一天记录小鼠肿瘤尺寸，治疗结束取得肿瘤检测免疫细胞浸润情况。
41.结果表明，本发明的syrosingopine/lod双载的四氧化三铁纳米材料能够显著抑制肿瘤细胞的增殖。
42.本发明的优点在于：
43.syrosingopine/lod双载的四氧化三铁纳米材料通过生物相容性和tme响应性纳米载体递送临床使用的降压药物syrosingopine，从而通过同时阻断mct1和mct4乳酸外排功能，增加细胞内的乳酸含量，降低细胞质ph；通过lod将乳酸转化为过氧化氢，持续供应过氧化氢原料，降低的的细胞质ph可以显著提高fenton反应的速率；抑制细胞内糖酵解和氧化磷酸化(oxphos)途径的atp供应；促进免疫原性细胞死亡，增强肿瘤炎症，促进免疫细胞浸润，抑制肿瘤细胞乳酸/h+外排所诱导的tme重塑的协同生物效应，包括增强巨噬细胞的抗癌活性，激活效应t细胞和nk细胞，抑制调节性t(treg)细胞的免疫抑制作用。综上所述，该多功能纳米平台以一种直接而简单的方式设计，展示了一石三鸟的效果，没有任何组件的功能损耗。
附图说明
44.为了更清楚地说明本技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的每一幅附图针对本技术的部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
45.图1为本发明实施例1制备的syr/lod@hfe3o4纳米颗粒的透射电镜(tem)图；
46.图2为本发明实施例2中syr@hfe3o4纳米颗粒的syr载带量和载带率曲线以及在不同ph值下的释放情况；
47.图3为本发明实施例3中lod@hfe3o4纳米颗粒催化乳酸产生过氧化氢的曲线图以及随后将过氧化氢转化为羟基自由基的紫外吸收曲线；
48.图4为本发明实施例4中多种纳米颗粒与b16-f10细胞共孵育24h后细胞内外的乳酸含量变化；
49.图5为本发明实施例5中多种纳米颗粒与b16-f10细胞共孵育24h后细胞内atp含量变化；
50.图6为本发明实施例6中多种纳米颗粒与b16-f10细胞共孵育24h后细胞的活性检测；
51.图7为本发明实施例7中syr/lod@hfe3o4纳米颗粒在活体水平的荧光成像；
52.图8为本发明实施例8中多种纳米颗粒在活体水平催化治疗联合代谢治疗的效果图；
53.图9为本发明实施例9中经过治疗后小鼠血清中炎症因子tnf-α和ifn-γ浓度；
54.图10为本发明实施例9中肿瘤附近淋巴结成熟dc细胞比例；
55.图11为本发明实施例9中肿瘤组织内效应t细胞和treg细胞的比例；
56.图12为本发明实施例9中肿瘤组织内m1型巨噬细胞和m2型巨噬细胞之比；
57.图13为本发明实施例9中肿瘤组织切片nk细胞免疫荧光染色图片；
58.图14为本发明实施例10中多种纳米颗粒联合α-pdl1的肿瘤免疫治疗效果评估。
具体实施方式
59.本发明提供了一种具有化学动力学治疗活性的空心四氧化三铁纳米颗粒联合载带乙酯利血平(syrosingopine，syr)和乳酸氧化酶(lactate oxidase，lod)的纳米载体的制备方法及其肿瘤协同治疗应用。
60.该方法包括：纳米酶载体的制备：将正硅酸乙酯溶解在乙醇和碱性水溶液的混合溶液中，水解得到二氧化硅纳米颗粒；二茂铁和硅纳米颗粒在丙酮中，在200℃的高温下经过过氧化氢氧化反应后再刻蚀去除二氧化硅，得到空心的四氧化三铁纳米颗粒；将空心四氧化三铁纳米颗粒表面修饰氨基化的聚乙二醇层，得到分散性良好的peg修饰的空心四氧化三铁纳米材料。双药共载带：通过共混的方式依次载带乙酯利血平和乳酸氧化酶获得syrosingopine/lod共负载的fe3o4纳米药物。
61.该方法合成的syrosingopine/lod共负载纳米药物粒径均一，具有极高的syrosingopine载带率和优异的水溶性和生物相容性；针对肿瘤能量代谢异常导致的细胞内、外ph反向梯度引起的细胞抗凋亡和免疫抑制肿瘤微环境的生物学特性，该药物利用临床老药syr同时阻断单羧酸转运蛋白mct1/mct4的功能，高效抑制乳酸外排，作为后续肿瘤高效协同治疗的激发子同时改善胞内和微环境的肿瘤治疗相关特性。细胞内乳酸含量的增加导致的酸化和纳米载体共递送lod有利于持续性高效地催化细胞内乳酸产生过氧化氢，四氧化三铁纳米酶可通过类芬顿反应将过氧化氢催化转化为羟基自由基，进行自增强的原料自补充的纳米催化治疗。此外，大量产生的ros可损伤线粒体，以便抑制肿瘤细胞在糖酵解供能受阻后改以氧化磷酸的替代能量供应，达成双重的饥饿治疗效果。同时，通过ph反向梯度逆转实现抗肿瘤免疫微环境的重塑，包括促进促炎细胞因子的释放、恢复效应t细胞和nk细胞、增加m1型肿瘤相关巨噬细胞和限制调节性t细胞的活性。
62.本发明的双载药纳米酶系统具有制备方法简便可批量生产，且具有良好的生物相容性等优势；通过简单直接高效的方式调节肿瘤细胞胞内、外的反向ph梯度生物学特性作为激发因素实现了化学动力学/饥饿/免疫治疗的协同抑瘤作用，最为关键的是各个治疗效应之间没有抵消和耗散。
63.下面将通过本技术的实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分优选实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动所获得的所有其他实施例，都属于本技术的保护范围。
64.实施例1
65.(1)准确称取50ml的乙醇，2ml的去离子水，2ml的氨水，磁力搅拌混合均匀后加入3ml的teos，搅拌反应4h，得到实心二氧化硅纳米颗粒；
66.(2)准确称量上述获得的25mg的二氧化硅纳米颗粒、0.1g的二茂铁分散在30ml的丙酮，高功率水域超声20min以充分分散，随后逐滴滴加1ml的过氧化氢，继续搅拌2h。转移混合液到聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应48h。产品使用乙醇和水各离心洗涤3次；
67.(3)将(2)中获得产物加入到20ml的2m的碳酸钠，60℃静置12h，使用去离子水离心洗涤三次获得空心的四氧化三铁纳米颗粒；
68.(4)准确称量10mg上述获得的空心四氧化三铁纳米颗粒与50mg的聚丙烯胺盐酸盐溶液共混，超声搅拌反应2h，离心收集产物后，分散到50mg的聚丙烯酸溶液中，超声搅拌反应2h，离心收集产物后，将其分散在5ml的去离子水中，在超声条件下缓慢滴加40mg氨基聚乙二醇(mpeg-5k-nh2，mw＝5000)1ml，超声搅拌10min后，使用2m的na2co3将反应溶液ph值调节到8.0，随后加入15mg的edc并搅拌12h后得到peg化的四氧化三铁纳米颗粒；
69.(5)准确称取1mg的peg修饰的四氧化三铁纳米颗粒加入到0-50μl的syrdmso溶液(10mg/ml)混合1小时，使用去离子水离心洗涤三次；
70.(6)将上述获得载带syr的纳米颗粒分散在1ml去离子水中，加入50μglod，4℃翻转反应12h。使用去离子水离心洗涤三次，获得syr/lod@hfe3o4纳米颗粒。
71.图1为本发明实施例1制备的syrosingopine/lod双载的四氧化三铁纳米材料的透射电镜(tem)图，显示合成的纳米颗粒形貌是球状并且是空心的结构，尺寸约为150nm，该纳米层的厚度约为17nm。
72.实施例2
73.按实施例1(5)步骤实施，并且每次收集洗涤液，并测定洗出液中的syr浓度，采用差减法的方式计算syr的载带率和载带量。将获得的载带syr的纳米颗粒分散在不同ph的pbs中，在固定的时间采集上清液并测定syr的浓度。图2a为实施例2中药物在hfe3o4中的载带量和载带率曲线，可以看出由于颗粒具有空腔结构，syr的载带量最高可达18.5w/w％nps，载带效率超过80％，最大程度的降低了药物的浪费。在图2b看出，syr在弱酸性条件下迅速释放，10min爆发式释放了41.4％，24h累计释放了68.9％，而在弱碱性条件下，24h总共释放仅为12.4％。
74.实施例3
75.在磷酸盐缓冲液(0.05m,ph 6.5)中加入1mm乳酸乳酸(lactic acid:la)，100μg/ml的lod@hfe3o4纳米颗粒，在室温下孵育30min，每隔5min取样测试过氧化浓度；对于羟基自
由基的检测，在反应液中加入10μg/ml的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine:tmb)，室温孵育30min后测定450-800nm的紫外吸收。
76.图3显示，lod@hfe3o4纳米颗粒催化乳酸持续产生过氧化氢，30min产生了315.4μm的过氧化氢。产生的过氧化氢能够被四氧化三铁转化为羟基自由基，表现为溶液在650nm处有明显的紫外吸收峰。由此，lod@hfe3o4纳米颗粒实现了从乳酸到过氧化氢到羟基自由基的级联催化反应。
77.实施例4
78.将b16-f10细胞(1
×
105)接种于6孔板中培养，待细胞贴壁后。加入各种纳米颗粒(50μg/ml,ph6.5)处理24h，同时收集上清和细胞，上清直接检测乳酸浓度即为细胞分泌的乳酸。将收集的细胞使用超声将细胞破碎，离心去除细胞碎片后测定乳酸浓度即为细胞内的乳酸含量；
79.图4显示，syr@hfe3o4和syr/lod@hfe3o4共孵育后，b16-f10细胞分泌的乳酸降低了50％，而细胞内堆积的乳酸含量提高了1倍以上。其他组细胞内外乳酸均无明显变化。
80.实施例5
81.将b16-f10细胞以每孔5
×
106个细胞的密度接种于24孔板，培养过夜。用含50μg/ml纳米颗粒的新鲜培养基孵育24h。使用ripa裂解液裂解细胞，随后使用atp检测试剂盒测试细胞内的atp含量；
82.图5显示，仅有syr/lod@hfe3o4共孵育后能够显著降低细胞内的atp含量实现肿瘤代谢治疗。
83.实施例6
84.将b16-f10细胞以每孔个1
×
104细胞的密度接种于96孔板，培养过夜。然后更换为含有多种100μg/ml的纳米颗粒的新鲜培养基孵育继续孵育24h。更换为含10％cck-8的无血清培养基，进一步共孵育1h后，通过与对照组比较450nm处的吸光度，检测细胞活性；
85.图6细胞活性测试结果显示，对照组、hfe3o4纳米颗粒、syr@hfe3o4纳米颗粒均没有明显的细胞毒性，而lod@hfe3o4纳米颗粒由于能够产生有一定毒性的过氧化氢，细胞存活率降低到了39.3％，但是仍然明显高于syr/lod@hfe3o4纳米颗粒的19.1％的细胞存活率。结果表明，降低细胞质ph联合级联反应产生羟基自由基具有最佳的肿瘤抑制效率。
86.实施例7
87.在6周龄雌性balb/c裸鼠的右侧后腿皮下注射b16-f10细胞(2
×
106个/只)。当肿瘤体积接近200mm3时，尾静脉注射cy5.5修饰的syr/lod@hfe3o4，剂量20mg/kg，注射后的第0、2、4、8、12、24h使用活体成像系统对小鼠体内荧光分布进行检测，第24h处死小鼠，取得主要器官和肿瘤组织进行荧光成像。图7结果显示，由于颗粒尺寸为150nm上下，能够通过epr效应积累到肿瘤部位，所以肿瘤组织具有最高的荧光强度。
88.实施例8
89.在6周龄雌性裸鼠的右侧后腿皮下注射b16-f10细胞(2
×
106个/只)。当肿瘤体积接近50mm3时，将小鼠随机分为5组(n＝4):1)control；2)free syr；3)syr@hfe3o4；4)lod@hfe3o4；5)syr/lod@hfe3o4。尾静脉注射，剂量20mg/kg，分别于第0、3、6、9、12天注射纳米颗粒。注射后14天内每2天用数字卡尺测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝l
×
w2/2，其中l、w分别为肿瘤长径(mm)、宽径(mm)。治疗周期结束后取得肿瘤组织拍照
记录。
90.图8的肿瘤生长曲线以及治疗后取出的肿瘤组织的图片均显示游离syr和syr@hfe3o4几乎没有肿瘤抑制效果，而lod@hfe3o4纳米颗粒由于能够产生有一定毒性的过氧化氢，肿瘤抑制效率可达69.1％，但是仍然明显低于syr/lod@hfe3o4纳米颗粒的90.5％的肿瘤抑制率。说明催化增强联合代谢治疗具有极高的肿瘤治疗效果。
91.实施例9
92.采用6周龄雌性balb/c小鼠右后肢皮下注射b16-f10细胞(2
×
106细胞/只)的方法建立皮下移植瘤模型。当肿瘤体积接近50mm3时，将荷瘤小鼠随机分为4组(n＝4):1)control；2)syr@hfe3o4；3)lod@hfe3o4；4)syr/lod@hfe3o4，静脉注射，剂量10mg/kg。分别于第0、3、6、9、12天注射纳米颗粒。为了进行流式细胞分析，这些收集的肿瘤使用200目过滤器研磨，以制备相应的单细胞悬液。采用流式细胞术对淋巴结内成熟dc(cd11c
+
cd80
+
cd86
+
)和肿瘤内cd8
+
t细胞(cd3
+
cd4
+
cd8
+
)、treg细胞(cd4
+
foxp3
+
)、m1型巨噬细胞(f4/80
+
cd80
+
)、m2型巨噬细胞(f4/80
+
cd206
+
)进行详细分析。
93.nk细胞检测，将肿瘤组织冰冻切片后采用nk1.1免疫荧光染色的方法进行表征。
94.细胞因子检测采用elisa试剂盒检测血清中tnf-α、ifn-γ的分泌水平。
95.图9显示，lod能够产生大量ros，诱导的肿瘤细胞免疫原性死亡，血清中细胞促炎细胞因子(tnf-α和ifn-γ)的浓度显著增加。促炎因子能够促进dc细胞成熟。
96.图10显示，与对照组相比，syr@hfe3o4组成熟dc(cd11c
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/cd80
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/cd86
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)细胞略有增加，从15.8％提高到了20.1％。lod@hfe3o4组成熟dc细胞的百分率为25.4％，主要是由ros刺激的细胞炎性因子释放引起的。此外，在syr/lod@hfe3o4处理组中，成熟dc细胞的数量增加到27.6％，表明免疫原性细胞死亡释放的炎性因子是诱导dc成熟的主要因素。
97.如图11所示，syr/lod@hfe3o4处理的肿瘤组织中细胞毒性t细胞的平均百分比为55.7％，而对照组和syr@hfe3o4组的平均百分比分别为27.6％和41.5％。此外，与对照组相比，syr@hfe3o4和syr/lod@hfe3o4组的treg细胞百分比分别降低了53％和58％，这对激活免疫和抑制肿瘤转移提出了强烈的积极意义。
98.图12显示，syr/lod@hfe3o4组的m1/m2巨噬细胞比例明显高于其他三组，抗肿瘤活性得到增强。
99.图13免疫荧光染色结果显示，相比于syr@hfe3o4组、lod@hfe3o4组和对照组(control)，syr/lod@hfe3o4组有更多的荧光标记部位和荧光强度，其自然杀伤(nk)细胞(nk1.1
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)更多地浸润到肿瘤中，nk细胞作为对抗癌症的第一道防线，能够在早期阶段靶向杀伤肿瘤细胞，对肿瘤的预防和治疗具有重要意义。
100.综上所述，syr/lod@hfe3o4纳米酶平台极大地激活了整合的抗肿瘤免疫活性，包括激活效应t细胞和nk细胞，抑制treg细胞，促进巨噬细胞m1型极化和dc成熟。
101.实施例10
102.将b16-f10荷瘤小鼠随机分为以下8组(n＝4)：1)control；2)syr@hfe3o4；3)lod@hfe3o4；4)syr/lod@hfe3o4；5)α-pdl1；6)syr@hfe3o4+α-pdl1；
103.7)lod@hfe3o4+α-pdl1和8)syr/lod@hfe3o4+α-pdl1。纳米颗粒分别于第0、3、6、9、12天尾静脉注射，剂量为10mg/kg。注射nps后24h注射α-pdl1(静脉注射，剂量1mg/kg)。治疗期间，每隔一天记录小鼠肿瘤尺寸。
104.肿瘤免疫治疗作为最有希望治愈肿瘤的策略之一，由于实体瘤免疫抑制微环境的存在，其在实体瘤中的疗效一直较差。如上所述，纳米平台激活了免疫微环境，这对增强免疫检查点阻断(icb)疗法的治疗效果可能具有重要的积极意义。
105.图14显示，在α-pd-l1单药治疗中，由于实体瘤中免疫细胞难以浸润和有限的抗肿瘤能力，与对照组相比，肿瘤抑制效率仅为20.1％，而当syr@hfe3o4和α-pd-l1联合使用时，肿瘤抑制率急剧上升至69.7％。而lod@hfe3o4联合α-pd-l1治疗组的肿瘤抑制率为61.5％，略高于lod@hfe3o4治疗组的45.1％。此外，syr/lod@hfe3o4+α-pd-l1组的肿瘤抑制率最高(96.3％)。这些结果表明，syr通过抑制乳酸外排重塑免疫微环境提高免疫检查点阻断(icb)治疗效果中发挥了关键作用。syr/lod@hfe3o4纳米平台将乳酸包裹在肿瘤细胞内的策略和增强的催化治疗驱动的肿瘤免疫原性死亡有效地激活了抗肿瘤免疫活性，在一定程度上克服了icb治疗在实体瘤治疗中的局限性。
106.以上所述的实施例仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可以不通过创造性劳动即能够联想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以本技术中权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种共负载纳米酶，其特征在于，所述的共负载纳米酶是四氧化三铁载带syrosingopine/lod的纳米材料。2.根据权利要求1所述的共负载纳米酶，其特征在于，所述的四氧化三铁纳米颗粒是空心四氧化三铁纳米颗粒，所述syrosingopine的载带量和载带率分别为5-20w/w％nps和75～95％，质量百分比。3.一种共负载纳米酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：(1)将乙醇、去离子水、氨水使用磁力搅拌混合均匀后加入teos，搅拌，得到实心二氧化硅纳米颗粒；(2)将上述获得的氧化硅纳米颗粒、二茂铁按照质量比1：(3-5)分散在丙酮中，高功率水域超声以充分分散，随后逐滴滴加过氧化氢，过氧化氢与丙酮的比例为1：(25-35)，继续搅拌1.5-2h；转移混合液到高压釜中，180-250℃反应24-50h；依次使用乙醇和水离心洗涤；(3)将步骤(2)获得的产物加入到15-30ml、浓度为1-2m的碳酸钠中，50℃-65℃静置过夜，使用去离子水离心洗涤获得四氧化三铁纳米颗粒；(4)将上述获得的四氧化三铁纳米颗粒与聚丙烯胺盐酸盐溶液共混，四氧化三铁纳米颗粒与聚丙烯胺盐酸盐溶液的比例为1：(4-5)，质量比，超声搅拌，离心收集产物后，分散到40-70mg的聚丙烯酸溶液中，超声搅拌，离心收集产物后，将其分散在去离子水中，在超声条件下缓慢滴加40mg氨基聚乙二醇1ml，超声搅拌后，使用na2co3将反应溶液ph值调节到7.8-8.1，随后加入edc并搅拌，得到peg化的四氧化三铁纳米颗粒；(5)将四氧化三铁纳米颗粒纳米颗粒加入到含有syrosingopine的dmso溶液中混合，使用去离子水离心洗涤后获得syrosingopine@四氧化三铁纳米颗粒；所述的syrosingopine添加量为0-500μg/mgnps，反应时间为1-12h；(6)将上述获得的syrosingopine@四氧化三铁纳米颗粒分散在去离子水中，lod的用量为0-200μg/mgnps，0-4℃翻转反应6-24h；使用去离子水离心洗涤，获得syrosingopine/lod@四氧化三铁纳米颗粒。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，准确称取1mg的四氧化三铁纳米颗粒纳米颗粒加入到50μl的含有syrosingopine的dmso溶液，浓度为10mg/ml，混合1-2h；或者，使用去离子水离心洗涤三次。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，syrosingopine@四氧化三铁纳米颗粒分散在1ml去离子水中，加入50μglod，4℃翻转反应12h；或者，使用去离子水离心洗涤三次。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：(1)准确称取50ml的乙醇，2ml的去离子水，2ml的氨水，磁力搅拌混合均匀后加入3ml的teos，搅拌反应4h，得到实心二氧化硅纳米颗粒；(2)准确称量上述获得的25mg的二氧化硅纳米颗粒、0.1g的二茂铁分散在30ml的丙酮，高功率水域超声20min以充分分散，随后逐滴滴加1ml的过氧化氢，继续搅拌2h；转移混合液到聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应48h；使用乙醇和水各离心洗涤3次；(3)将(2)中获得产物加入到20ml的2m的碳酸钠，60℃静置12h，使用去离子水离心洗涤三次获得空心的四氧化三铁纳米颗粒；(4)准确称量10mg上述获得的空心四氧化三铁纳米颗粒与50mg的聚丙烯胺盐酸盐溶液
共混，超声搅拌反应2h，离心收集产物后，分散到50mg的聚丙烯酸溶液中，超声搅拌反应2h，离心收集产物后，将其分散在5ml的去离子水中，在超声条件下缓慢滴加40mg氨基聚乙二醇1ml，mpeg-5k-nh2，mw＝5000，超声搅拌10min后，使用2m的na2co3将反应溶液ph值调节到8.0，随后加入15mg的edc并搅拌12h后得到peg化的四氧化三铁纳米颗粒并命名为hfe3o4纳米颗粒；(5)准确称取1mg的hfe3o4纳米颗粒加入到50μl的syrdmso溶液，10mg/ml，混合1h，使用去离子水离心洗涤三次后获得syr@hfe3o4纳米颗粒；(6)将上述获得载带syr的纳米颗粒分散在1ml去离子水中，加入50μglod，4℃翻转反应12h；使用去离子水离心洗涤三次，获得syr/lod@hfe3o4纳米颗粒。7.权利要求1所述的纳米材料的应用，其特征在于，所述的纳米材料在制备抗肿瘤药物或者试剂中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的lod/含有mct1/mct4双抑制的药物或者制剂的纳米材料用于抑制体外培养的、以糖酵解作为主要供能方式代谢外排大量乳酸的肿瘤细胞生长或者增殖，能够实现乳酸到过氧化氢到羟基自由基的转化，或者实现肿瘤的化学动力/免疫/代谢联合治疗，提高icb治疗效果。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，四氧化三铁载带syrosingopine/lod的纳米材料与免疫检查点阻断药物联合使用。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的四氧化三铁载带syrosingopine/lod的纳米材料与α-pd-l1联合使用。

技术总结
本发明属于纳米载体与生物医药技术领域，涉及一种共负载Fe3O4纳米酶。本发明提供了四氧化三铁载带Syr/LOD纳米材料，其制备方法包括：制备二氧化硅纳米颗粒，通过与二茂铁在丙酮得到四氧化三铁纳米颗粒；对颗粒表面修饰，得到PEG修饰的四氧化三铁纳米材料；通过共混获得Syr/LOD共负载的Fe3O4纳米材料。该纳米材料能够同时增加细胞内的乳酸含量、降低细胞质pH，通过LOD将乳酸转化为过氧化氢，促进免疫原性细胞死亡，增强肿瘤炎症，促进免疫细胞浸润，抑制肿瘤细胞乳酸/H+外排所诱导的TME重塑的协同生物效应，包括增强巨噬细胞的抗癌活性，激活效应T细胞和NK细胞，抑制调节性T细胞的免疫抑制作用。疫抑制作用。疫抑制作用。


技术研发人员：王祎龙 吴胜明
受保护的技术使用者：同济大学
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/8/1