一种与刺参生长性状相关的基因分子标记及其应用

1.本发明属于分子标记辅助育种领域，具体涉及一种与刺参生长性状相关的基因分子标记及其应用。


背景技术：

2.刺参(apostichopus japonicus)属棘皮动物门(echinodermata)海参纲(holothuroideaia)仿刺参属(apostichopus)，主要分布于太平洋沿岸，营养及药用价值极高，市场需求的扩增，致使刺参野生资源衰退严重。近年，刺参养殖业发展迅猛，成为海水养殖又一关键支柱性产业，为我国带来了显著的经济效益。但随着产业规模逐渐扩大，种质退化、生长缓慢、病害频发等问题日益凸显，其中生长缓慢是最为显著问题之一。刺参群体生长变异系数超过50％，具备非常高的遗传改良潜力。由此，对刺参进行遗传种质改良，培育具备生长速度快等优良性状的新品种对该产业的健康持续发展至关重要。
3.自20世纪90年代以来，良种匮乏问题逐渐成为制约海水养殖产业发展的重要因素，世界各国的育种学家积极探索育种工作的新思路、新方法，注重重要经济性状的遗传解析，致力于推动由传统育种平台向现代化分子育种平台过渡。相较畜牧行业，水产行业遗传改良兴起较晚，刺参的分子选育工作更是落后于其他水产生物。基于表型的选择育种和杂交育种作为传统类型的育种技术经多代选育后存在近交衰退现象，提纯效果不佳，阻碍了行业育种的发展。分子标记辅助育种及基因工程育种在刺参中刚刚起步。
4.孙文静等人(2010)利用刺参表达序列标签(expressed sequence tag，est)首次开发了用于描述刺参群体结构的13个snps；周遵春团队利用est开发了15个snps(yang et al.,2012)，后续通过高通量转录组测序技术发现了142,511个潜在snps(zhou et al.,2014)；包振民团队(2012)根据转录组测序技术筛选出54,000个潜在的snps位点，并利用高分辨率熔解(high resolution melting，hrm)基因分型技术开发了101个snps位点；jung-ha kang等人(2011)开发了6个可用于体色性状的snp分子标记；杨红生团队解析了hsp家族基因对刺参耐热的调控机制并开发出3个与耐高温关联的snp标记(xu et al.,2014b；xu et al.,2015；xu et al.,2014a)。
5.目前刺参遗传研究以抗性性状居多，分子标记辅助育种主要以分子标记开发为主，所开发的标记并未进行后续的扩大验证。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种与刺参生长性状相关的基因分子标记及其应用。
7.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
8.一种与刺参生长性状相关的基因分子标记，分子标记为于刺参基因组18号连锁群sif2基因的外显子区域。
9.所述分子标记为于刺参基因组18号连锁群sif2基因的外显子区域，该基因转录起始位点开始的第1538处(e2-2.1538)的t》c突变、第1574处(e2-4.1574)t》c突变、第29283处
(e9-2.29283)t》c突变中的一处或多处。
10.所述分子标记在sif2基因序列第1538处检测到(cc)、(tt)和(ct)3种基因型；
11.分子标记在sif2基因序列第1574处检测到(cc)、(tt)和(ct)3种基因型；
12.分子标记在sif2基因序列第29283处检测到(cc)、(ct)和(tt)3种基因型。
13.所述分子标记位于刺参生长基因sif2外显子区域，其核苷酸序列如seq id no:1中所示。
14.一种所述的与刺参生长性状相关的基因分子标记的应用，所述与刺参生长性状相关的基因分子标记在刺参选育中的应用。
15.一种筛选与snp分子标记基因分型的引物，引物对为
16.aj_e2-2_f:ctctccaagaatggggaccg
17.aj_e2-2_r:cgcagatcaggaccaactgt
18.aj_e2-4_f:acataaccgatggagcgaca
19.aj_e2-4_r:ttccgggtcaaaggtcgtg
20.aj_e9-2_f:agcacagcgtttggagattc
21.aj_e9-2_r:ccgtgttgtctcgtaaatgcc
22.所述pcr扩增程序与体系为：dna模板50ng/ul 1ul，premix taq酶7.5μl，正反引物各0.5μl，rnase-free water 5.5μl；pcr反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。
23.一种所述的引物的应用，所述引物在鉴定或辅助鉴定刺参生长基因中的应用。
24.一种筛选快速生长的刺参的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求6所述的筛选快速生长的刺参的引物以及筛选分子标记位点。
25.一种利用所述的刺参生长性状相关的sif2基因分子标记选育生长速度快刺参品系的方法，其特征在于：
26.(1)利用权利要求6或权利要求8中记载引物扩增待检测刺参个体的权利要求1所述生长相关sif2基因；
27.(2)分子标记在该基因第1538处ct型和cc型、第1574处ct型和cc型、第29283处ct型，选择其中的一个位点或者几个位点进行刺参生长性状良种选育；
28.(3)根据上述步骤选择的个体作为种参进行繁育，培育具备生长速度快优良表型的刺参品系
29.本发明与现有技术相比的优势：
30.1、本发明为刺参分子标记辅助育种提供了3个与刺参生长性状相关的snp分子标记及优势基因型。利用上述分子标记在其他刺参群体中进行了验证，能够更加高效选育出生长速度快的刺参良种。
31.2、使用该手段进行刺参选育，目标准确，选择效率更高，提纯效果更佳，且选育性状稳定。
附图说明
32.图1为刺参snps检测引物的pcr扩增(m：dl2000，泳道1为marker，泳道2为位点e2-2.1538t》c、泳道3为位点e2-4.1574t》c、泳道4为位点e9-2.29283t》c扩增片段)。
具体实施方式
33.下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
34.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
35.本发明通过sanger测序法对sif2基因外显子区域筛选出可用于辅助刺参生长性状选择育种的snp标记及优势基因型。利用上述标记建立刺参分子标记辅助育种方法，选育具备生长速度快优良表型的刺参新品种，为刺参原、良种匮乏等问题的解决提供解决方案。
36.实施例1：刺参生长性状相关snp分子标记获得
37.在东科一号(品种登记号：gs-01-015-2017)群体和普通群体中分别随机选取60只刺参作为实验材料，按照dna提取试剂盒(品牌：takara)说明书对刺参体壁组织进行dna提取，并使用nanodrop 2000紫外-可见分光光度计测定浓度以及通过1％琼脂糖凝胶电泳评价dna质量。
38.根据sanger测序法对sif2基因的外显子区域进行检测，共鉴定出26个snp位点，在上述两个群体中，针对所述位点处不同基因型与生长性状进行多重比较分析，结果见表1，其中3个位点在两群体中存在显著差异。以转录起始位点的位置为基准，将这3个snp分别命名为e2-2.1538t》c、e2-4.1574t》c、e9-2.29283t》c，对应的位点分别位于sif2基因第1538处、第1574处、第29283处。3个snp位点皆检测到(tt)、(ct)和(cc)3种基因型。东科一号新品种刺参具备生长速度快的优点，故而在分子标记e2-2.1538t》c处，(tt)和(ct)型个体生长速度快于(cc)型个体、e2-4.1574t》c处(tt)和(ct)型个体生长速度快于(cc)型个体、e9-2.29283t》c处(ct)型个体生长速度快于(tt)和(cc)型个体。
39.表1sif2基因外显子区域鉴定的3个显著差异的snp
[0040][0041]
实施例2：所述分子标记在生长性状辅助育种中的应用
[0042]
根据sanger测序法获得的3个snp位点，在其两侧侧翼序列设计snp位点扩增检测引物，相应引物序列为aj_e2-2_f5
’‑
tctccaagaatggggaccg-3'和aj_e2-2_r5
’‑
cgcagatcaggaccaactgt-3'；aj_e2-4_f5
’‑
acataa ccgatggagcgaca-3'和aj_e2-4_r5
’‑
ttccgggtcaaaggtcgtg-3'；aj_e9-2_f5
’‑
agcacagcgtttggagattc-3'和aj_e9-2_r5
’‑
ccgtgttgt ctcgtaaatgcc-3'。
[0043]
所述snp分子标记扩增检测用体系为：dna模板50ng/ul 1ul，premix taq酶7.5μl，正反引物各0.5μl，rnase-free water 5.5μl；pcr反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。
[0044]
所述检测引物的pcr扩增序列，其中灰色的即为分子标记位点，具体为：
[0045][0046]
ccaaccagagaagaaacacaagtggcttcagattctttacagttgttgctgagcg
[0047]
ttgaattaccgacaggtctgcagaccgtggacgatcaaggcaacacgtccaccaa
[0048]
tcacagccctgcgatggtgaacggacgcaaagatggctcccgtccgggtcagacg
[0049]
ggcctcttctctaccctggccctgccggacaagaaaacagattccgtccccgtctc
[0050]
tggcagcgtccgaaaggccatcgcaaaccgcaaagatcagcgcaagttgaaatat
[0051]
gcgacatactccggaaagaaccgcgaggccctgcagaggtcttactacgaaaaca
[0052]
tggatacggaggacggtaaatcggaggactttgacgactccacccttaaagcatc
[0053]
caagtcgaaaccgtccaggcacggaagccaccccgagctggatattgcctccagc
[0054]
agtccgagtgccgacgagcaccatgaattggtcagacagctaagtgggagcccgg
[0055]
ggaggggcagcgggtatttaagcgcatctcaaatggacgcgggcataaacaatgg
[0056]
tgtcttgaagagcgccaagttcgtggcagcgaacgcccaaaatttcaagacggca
[0057]
aacagcgtctcccagatcacccctacgacacccgaaaaggaattaaaaaatgaca
[0058]
gaaagtctggcattaggactcgactgaaggtggaggggcagtctttcttcggtcg
[0059]
tgggaacaagacgaagacgaaaaacaaagccaagaggtctaccagtttcagcga
[0060]
gaaattcttcacccgggtccacgtgaaggataacgccaacaagaacagtctggac
[0061]
gaggcccagcgggtactggaagaaacgaactcgctcttacaggcctacgaggttc
[0062]
acctgcagatgcagacactcgacgaaacgatagacggtctaccttcgaccggaga
[0063]
cgaccgatcggtggcgtccaagtcgtcgtgtgggaccgcatcggatataccgaaat
[0064]
ggaagaagcgtctctcagagggcatcaccagtggcagcgagtgcagtagcttaag
[0065]
tcaccatggcgacggtagtactttgacctcaagtgagaccatgtccaaaggggat
[0066]
caggatctacaggagttcttctaccacgatgaggaggacatggaagaggaggagg
[0067]
atggtgaggaggatggagacagccattctctcagctcacaccacacacacgcttc
[0068]
catgttccaacagaggggcgccatcaggaaggccggttggctgcacgtcaagagc
[0069]
atgctcgtacagaggaagaaacgggtggaacgaccaggcaagaggtcctggaag
[0070]
aaatattgggtctgtttgaaaggaacaatgctgttattccatgcaccctcagacag
[0071]
agaaaccgatgagagcagtgaacctag
[0072]
acatatcctggtggttgagaacggcctcgcccaggcggtcccagagcatcccaag
[0073]
cgagagaacatcttctgtttgagcacagcgtttggagattcctatttcttacaagc
[0074]
acctaatcagattgagctcgaaaattggaccattgcaatacattcagcctgttcctcg
[0075]
gcatttacgagacaacacggaaaagaggaaactttacgtcttctacgattagaaacacacaaa
[0076]
ctggaggacaagattgaactggaagacaaagaagatggccgagctgcagctgagcac
[0077]
ggtttcggatccaaagaatcgacaagctatagcatctcaggtagagacaatgccca
[0078]
cgataattgattgttatgatgcattgtgtgactcaagtacaggaaaacgacttgcat
[0079]
gttactctgtttgtttttgtgtcgtcagagttggattagaagcctgggaattattcc
[0080]
atgtcgtacaatga
[0081]
在刺参育苗期，随机选取亲参，通过pcr扩增对上述snp位点处进行基因分型，根据分型结果，选取基因型在e2-2.1538t》c处(tt)和(ct)型个体、e2-4.1574t》c处(tt)和(ct)型个体、e9-2.29283t》c处(ct)型个体。

技术特征：
1.一种与刺参生长性状相关的基因分子标记，其特征在于：分子标记为于刺参基因组18号连锁群sif2基因的外显子区域。2.按权利要求1所述的与刺参生长性状相关的基因分子标记，其特征在于：所述分子标记为于刺参基因组18号连锁群sif2基因的外显子区域，该基因转录起始位点开始的第1538处的t>c突变、第1574处t>c突变、第29283处t>c突变中的一处或多处。3.按权利要求2所述的与刺参生长性状相关的基因分子标记，其特征在于：所述分子标记在sif2基因序列第1538处检测到(cc)、(tt)和(ct)3种基因型；分子标记在sif2基因序列第1574处检测到(cc)、(tt)和(ct)3种基因型；分子标记在sif2基因序列第29283处检测到(cc)、(ct)和(tt)3种基因型。4.按权利要求1-3任意一项所述的与刺参生长性状相关的基因分子标记，其特征在于：所述分子标记位于刺参生长基因sif2外显子区域，其核苷酸序列如seq id no:1中所示。5.一种权利要求1所述的与刺参生长性状相关的基因分子标记的应用，其特征在于：所述与刺参生长性状相关的基因分子标记在刺参选育中的应用。6.一种筛选与筛选与snp分子标记基因分型的引物，引物对为aj_e2-2_f:ctctccaagaatggggaccg；aj_e2-2_r:cgcagatcaggaccaactgt；aj_e2-4_f:acataaccgatggagcgaca；aj_e2-4_r:ttccgggtcaaaggtcgtg；aj_e9-2_f:agcacagcgtttggagattc；aj_e9-2_r:ccgtgttgtctcgtaaatgcc。7.一种权利要求6所述的引物的应用，其特征在于：所述引物在鉴定或辅助鉴定刺参生长基因中的应用。8.一种筛选快速生长的刺参的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6所述的筛选快速生长的刺参的引物以及筛选分子标记位点。9.一种利用权利要求1所述的刺参生长性状相关的sif2基因分子标记选育生长速度快刺参品系的方法，其特征在于：(1)利用权利要求6或权利要求8中记载引物扩增待检测刺参个体的权利要求1所述生长相关sif2基因；(2)分子标记在该基因第1538处ct型和cc型、第1574处ct型和cc型、第29283处ct型，选择其中的一个位点或者几个位点进行刺参生长性状良种选育；(3)根据上述步骤选择的个体作为种参进行繁育，培育具备生长速度快优良表型的刺参品系。

技术总结
本发明属于分子标记辅助育种领域，具体涉及一种与刺参生长性状相关的分子标记组合及其应用。本发明通过筛选出刺参sif2基因分子标记，建立刺参分子标记辅助育种方法，为刺参生长性状遗传改良提供基因标记和技术方法。所述分子标记位于刺参sif2基因的外显子区域。通过Sanger测序法筛选获得与刺参生长性状显著相关的分子标记，包括以下位点：转录起始位点开始第1538处的T>C突变、第1574处T>C突变、第29283处T>C突变。应用时利用其中一个或几个分子标记来进行具备生长速度快优良表型的刺参苗种选育。本发明为从遗传水平改良刺参生长性状提供了分子标记，对提高刺参养殖效益具有重要意义。要意义。要意义。


技术研发人员：孙丽娜 崔玮 刘石林 杨红生 邢丽丽 林承刚
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/8/1