一种喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的新生产工艺

1.本发明属于脂溶性化学成分提取纯化分离技术领域，尤其涉及喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的提取纯化分离方法。


背景技术：

2.喜树(camptotheca acuminata decne)是蓝果树科、喜树属植物，是中国特有的多年生高大落叶乔木。喜树全身是宝，它全身各个构件单元如种子、叶、花、枝条、树皮、根均含有吲哚类生物碱，喜树碱(camptothecin，cpt)和10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin，10-hcpt/hcpt)。作为具有高效抗癌作用的天然成分，喜树碱和羟基喜树碱具有广谱的抗癌效果，在临床上用于治疗原发性肝癌、胃癌、肺癌、直肠癌、膀胱癌等。
3.目前，喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的提取方法有溶剂法、微波辅助提取、超声辅助提取、超临界co2提取等。喜树碱和羟基喜树碱作为热敏物质，需在低温或室温下进行提取，否则会导致喜树碱和羟基喜树碱的分解使提取率降低。微波、超声波、超临界等现代主流提取技术虽克服了传统萃取技术效率低的问题，但仍无法解决提取过程中能源消耗高、环境污染大、提取成本成高以及大规模化工业生产的问题。当前喜树中喜树碱和羟基喜树碱的提取多以分子溶剂为主(乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氯仿等)，具有较高的危险性和较低的环境效益。因此，将现代萃取技术与绿色溶剂相结合，建立一种操作简单、效率高、能耗低的绿色高效萃取纯化分离完整的新型生产工艺具有重要的研究意义。


技术实现要素：

4.针对上述不足，本发明的目的在于提供一种喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的可持续提取纯化分离方法。本发明提出一种超高压辅助胶束提取，脱色、固液萃取、柱层析、反溶剂重结晶纯化分离喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的新的生产工艺，操作简单，绿色安全，耗能低，可持续且提取效率高。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的可持续提取，通过脱色、固液萃取、柱层析、反溶剂重结晶纯化分离的生产工艺，包括以下步骤：
7.(1)将喜树种子阴干，粉碎，过筛，得到喜树种子粉末；
8.(2)将步骤(1)得到的喜树种子粉末与胶束提取溶剂按一定料液比充分混合，得到混合物，将混合物装入聚乙烯袋中，密封；
9.(3)将步骤(2)装有混合物的聚乙烯袋置于超高压设备中，进行超高压提取；
10.(4)提取结束后，倒出步骤(3)处理后的聚乙烯袋中的混合物，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，分别测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量；
11.(5)将步骤(4)得到喜树种子提取液加入活性炭和硅藻土加热搅拌，除去色素和蜡质等杂质得浸膏。
12.(6)将步骤(5)浸膏烘干，加入丙酮萃取，离心获得丙酮层，浓缩旋干，得到粗品一并计算其纯度。
13.(7)将步骤(6)粗品一溶解在甲醇和三氯甲烷混合溶剂中，通过硅胶柱层析，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，得到cpt和hcpt粗品二并计算其纯度。
14.(8)将步骤(7)粗品二分别溶解在乙醇中，加入去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品并计算其纯度和得率。
15.(9)将步骤(6)中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充一定体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
16.优选地，所述的步骤(1)的喜树种子粉末粒度为10～200目。
17.优选地，所述的步骤(2)的胶束提取溶剂为sls，其浓度为10mg/ml～100mg/ml。
18.优选地，所述的喜树种子粉末与胶束提取溶剂的用量比为1g∶10～40ml。
19.优选地，所述的步骤(3)中超高压提取时间为1～10min。
20.优选地，所述的步骤(3)中超高压提取压力为25～200mpa。
21.优选地，所述的步骤(3)中超高压提取次数为1～5次。
22.优选地，所述步骤(4)中超高压提取后的分离步骤为离心，转速
23.为5000～10000rpm/min，时间为5～10min，得到所述喜树种子提取液。
24.优选地，所述的步骤(5)得到喜树种子提取液加入0.5～2％的活性炭和硅藻土，除去色素和蜡质等杂质得浸膏。
25.优选地，所述的步骤(6)浸膏烘干后加入的丙酮溶液萃取的体积比为1∶2～1∶8(g∶ml)，萃取次数为1-5次。
26.优选地，所述的步骤(7)样品溶解在甲醇和三氯甲烷混合溶剂的体积比为1∶1～1∶6的溶剂中，通过硅胶柱层析洗脱分离，cpt和hcpt的洗脱液范围为甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100～1.5∶100。
27.优选地，所述的步骤(8)的样品采用反溶剂重结晶法(乙醇为溶剂，水为反溶剂)，所述cpt和hcpt在乙醇中的浓度范围分别为1～10mg/ml和1～10mg/ml，所述的乙醇∶水的体积比范围为1∶10～1∶30。
28.优选地，所述的步骤(9)补充的sls体积为1％～6％。
29.本发明提供了一种喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的可持续提取纯化分离方法，包括以下步骤：将喜树种子阴干，粉碎，过筛，得到喜树种子粉末。将喜树种子粉末与胶束提取溶剂按一定料液比充分混合，得到混合物，将混合物装入聚乙烯袋中，密封。将装有混合物的聚乙烯袋置于超高压设备中，进行超高压提取。提取结束后，倒出处理后的聚乙烯袋中的混合物，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量。然后，在喜树种子提取液中加入活性炭和硅藻土，除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将浸膏烘干，加入丙酮萃取，离心获得丙酮层，浓缩旋干，得到粗品一，将粗品一溶解在甲醇和三氯甲烷混合溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，得到cpt和hcpt粗品二。将粗品二分别溶解在乙醇中，加入去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品并计算其纯度和得率。经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充一定体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
30.本发明利用超高压辅助胶束提取技术高效提取并采用脱色、固液萃取、柱层析、反溶剂重结晶纯化分离喜树种子中的喜树碱和羟基喜树碱。所述胶束为十二烷基磺酸钠，即sls，是一种绿色安全的环保表面活性剂，在常温下对喜树碱和羟基喜树碱的溶解度较大，当超高压使植物细胞破损或被挤压变形时，sls与喜树碱和羟基喜树碱之间产生氢键作用力和静电作用力，喜树碱和羟基喜树碱被其以胶束形式带出细胞，实现喜树碱和羟基喜树碱的高效提取。本发明的提取过程效率高，能耗低，不会产生热量，克服了热敏化学物质因在高温下被分解而导致的提取率低的困难。同时，环境友好型提取溶剂的回收也避免了溶剂挥发而导致的环境污染和安全问题。该提取方法操作简单、提取效率高、能耗低、绿色环保、提取过程安全可靠，极具推广应用价值。并采用传统的脱色、固液萃取、柱层析、反溶剂重结晶纯化分离方法，操作简单省时省力，结合超高压胶束提取构建了一套完整的新型生产工艺。实施例的数据表明，本发明的提取方法的喜树碱和羟基喜树碱的提取率高达82.68
±
1.2％和89.02
±
0.9％，经脱色、固液萃取、柱层析、反溶剂重结晶纯化后，喜树碱和羟基喜树碱粗晶的得率分别为22.76
±
1.54％和27.73
±
2.54％，纯度分别为94.51
±
0.22％和96.76
±
0.29％，sls可重复使用。
附图说明：
31.图1为高效液相色谱图；图1中的(a)喜树种子提取液液相色谱图，图1中的(b)喜树碱标准品液相色谱图，图1中的(c)羟基喜树碱标准品液相色谱图
32.图2纯化过程高效液相色谱图；图2中的(a)喜树碱标准品液相色谱图，图2中的(b)羟基喜树碱标准品液相色谱图，图2中的(c)浸膏液相色谱图，图2中的(d)固液萃取后粗品一的液相色谱图，图2中的(e)硅胶柱层析分离其他杂质但未将喜树碱和羟基喜树碱分离前液相色谱图，图2中的(f)反溶剂重结晶后喜树碱的液相色谱图，图2中的(g)反溶剂重结晶后羟基喜树碱的液相色谱图
具体实施方式
33.本发明提供了一种喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的提取方法，包括以下步骤：
34.(1)将喜树种子阴干，粉碎，过筛，得到喜树种子粉末；
35.(2)将步骤(1)得到的喜树种子粉末与胶束提取溶剂按一定料液比充分混合，得到混合物，将混合物装入聚乙烯袋中，密封；
36.(3)将步骤(2)装有混合物的聚乙烯袋置于超高压设备中，进行超高压提取；
37.(4)提取结束后，倒出步骤(3)处理后的聚乙烯袋中的混合物，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量；
38.(5)将步骤(4)得到喜树种子提取液加入活性炭和硅藻土加热搅拌，除去色素和蜡质等杂质得浸膏并计算其纯度；
39.(6)将步骤(5)浸膏烘干，加入丙酮萃取，离心获得丙酮层，浓缩旋干，得到粗品一并计算其纯度；
40.(7)将步骤(6)粗品一溶解在甲醇三氯甲烷混合溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，得到cpt和hcpt粗品二并计算其纯度；
41.(8)将步骤(7)粗品二分别溶解在乙醇中，加入去离子水溶液中反溶剂重结晶，得
到喜树碱和羟基喜树碱纯品并计算其纯度和得率。
42.(9)将步骤(6)中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充一定体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
43.本发明将阴干后的喜树种子粉碎，过筛，得到喜树种子粉末，所述的步骤(1)的喜树种子粉末粒度优选为10～200目，更优选为80～100目，最优选为100目。
44.将步骤(1)得到的喜树种子粉末与胶束提取溶剂按一定料液比充分混合，得到混合物，将混合物装入聚乙烯袋中，密封。
45.在本发明中，所述的步骤(2)的胶束提取溶剂为sls，其浓度优选为10～100mg/ml，更优选为20～80mg/ml，最优选为60mg/ml。本发明对所述sls溶液的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的制备方法制得即可。
46.在本发明中，所述的喜树种子粉末与胶束提取溶剂的用量比优选为1g∶10～40ml，更优选为1g∶15～30ml，最优选为1g∶20ml。
47.将步骤(2)装有混合物的聚乙烯袋置于超高压设备中，进行超高压提取。
48.在本发明中，所述的步骤(3)中超高压提取时间优选为1～10min，更优选为1～5min，最优选为3min。
49.在本发明中，所述的步骤(3)中超高压提取压力优选为25～200mpa，更优选为50～150mpa，最优选为100mpa。
50.在本发明中，所述的步骤(3)中超高压提取次数优选为1～5次，更优选为2～4次，最优选为3次。
51.提取结束后，倒出步骤(3)处理后的聚乙烯袋中的混合物，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量。
52.在本发明中，所述步骤(4)中超高压提取后的分离步骤为离心，离心的转速优选为5000～10000rpm/min，更优选为6000～9000rpm/min，最优选为8000rpm/min，时间优选为5～10min，更优选为5～8min，最优选为6min，得到所述喜树种子提取液。
53.在本发明中，将步骤(4)得到喜树种子提取液加入活性炭和硅藻土，加入活性炭和硅藻土的浓度优选为0.5％～2％，更优选为0.8％～1.2％，最优选为1％，除去色素和蜡质等杂质得浸膏。
54.在本发明中，将步骤(5)得到的浸膏烘干，浸膏与添加丙酮的体积比优选为1∶2～1∶8(g∶ml)，更优选为1∶4～1∶6(g∶ml)，最优选为1∶5(g∶ml)。萃取次数为1-5次，更优选为2-4次，最优选为3次。
55.在本发明中，将步骤(6)得到的粗品一溶解在甲醇和三氯甲烷的混合溶剂中，甲醇∶三氯甲烷的体积比优选为1∶1～1∶6，更优选为1∶4～1∶6，最优选为1∶5，通过柱层析硅胶，cpt和hcpt的洗脱液范围优选为甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100～1.5∶100，更优选为0.2∶100～1.4∶100，cpt的洗脱液最优选为0.3∶100，hcpt的洗脱液最优选为1.3∶100。
56.在本发明中，将步骤(7)得到的粗品二分别溶解在乙醇中，加入去离子水溶液中反溶剂重结晶，所述cpt和hcpt在乙醇中的浓度范围分别优选为1～10mg/ml和1～10mg/ml，更优选为2～8mg/ml和2～8mg/ml，最优选为5mg/ml和5mg/ml，所述的乙醇∶水的体积比范围优选为1∶10～1∶30，更优选为1∶15～1∶25，最优选为1∶20，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品并计算其纯度和得率。
57.将步骤(6)中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充一定体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
58.在本发明中，所述的步骤(9)补充的sls体积优选为1％～6％，更优选为3％～6％，最优选为5％。
59.为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的提取方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
60.实施例1
61.将阴干后的喜树种子粉碎，过100目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与20ml浓度为100mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为1min，提取压力为100mpa，提取次数为3次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在5000rpm/min的转速下离心10min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的提取率分别为70.80％和82.10％。然后，在喜树种子提取液中加入1％活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入3ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为5次，每次萃取均加入3ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为41.25％和44.23％。将粗品一溶解在甲醇∶三氯甲烷＝1∶5的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝1.4∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为75.62％和77.83％。将粗品二分别溶解在1ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为3mg/ml和6mg/ml)，加入10ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品得率分别为23.53％和25.23％，纯度分别为91.29％和92.44％。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充5％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
62.实施例2
63.将阴干后的喜树种子粉碎，过80目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与30ml浓度为60mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为3min，提取压力为50mpa，提取次数为3次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在6000rpm/min的转速下离心8min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的提取率分别为72.30％和82.86％。然后，在喜树种子提取液中加入0.8％活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入5ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为4次，每次萃取均加入5ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为43.75％和47.83％，将粗品一溶解在甲醇∶三氯甲烷＝1∶6的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.3∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝1.2∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为69.27％和76.22％。将粗品二分别溶解在1ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为4mg/ml和6mg/ml)，加入15ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品
得率分别为23.57％和25.86％，纯度分别为91.34％和93.22％。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充4％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
64.实施例3
65.将阴干后的喜树种子粉碎，过120目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与20ml浓度为20mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为1min，提取压力为100mpa，提取次数为3次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在8000rpm/min的转速下离心10min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的的提取率分别为64.90％和77.20％。然后，在喜树种子提取液中加入1％活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入6ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为5次，每次萃取均加入6ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为45.32％和49.69％，将粗品一溶解在甲醇∶三氯甲烷＝1∶5的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.4∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝1.1∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为71.22％和77.92％，。将粗品二分别溶解在1ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为4mg/ml和7mg/ml)，加入20ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品得率分别为22.76％和27.32％，纯度分别为91.64％和93.25％。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充3％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
66.实施例4
67.将阴干后的喜树种子粉碎，过100目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与30ml浓度为60mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为3min，提取压力为150mpa，提取次数为3次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在5000rpm/min的转速下离心10min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的提取率分别为82.30％和90.80％。然后，在喜树种子提取液中加入0.5％活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入4ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为5次，每次萃取均加入4ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为41.77％和44.21％，将粗品一溶解在甲醇：三氯甲烷＝1∶5的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.5∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.9∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为72.86％和81.37％。将粗品二分别溶解在5ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为4mg/ml和6mg/ml)，加入5ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品得率分别为26.37％和29.23％，纯度分别为91.20％和94.65％。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充4％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
68.实施例5
69.将阴干后的喜树种子粉碎，过120目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与20ml浓度为100mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为5min，提取压力为100mpa，提取次数为3次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在7000rpm/min的转速下离心10min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的提取率分别为81.30％和87.90％。然后，在喜树种子提取液中加入1％活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入2ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为5次，每次萃取均加入2ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为42.41％和46.29％，将粗品一溶解在甲醇∶三氯甲烷＝1∶5的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.3∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为77.36％和79.01％。将粗品二分别溶解在1ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为5mg/ml和8mg/ml)，加入30ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品得率分别为21.32％和25.66％，纯度分别为92.44％和95.98％。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充3％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
70.实施例6
71.将阴干后的喜树种子粉碎，过100目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与20ml浓度为20mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为5min，提取压力为100mpa，提取次数为3次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在5000rpm/min的转速下离心8min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的提取率分别为70.20％和87.9％。然后，在喜树种子提取液中加入1％活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入8ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为3次，每次萃取均加入8ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为45.19％和48.25％，将粗品一溶解在甲醇：三氯甲烷＝1∶5的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.4∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝1.0∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为76.71％和78.39％。将粗品二分别溶解在1ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为3mg/ml和5mg/ml)，加入15ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品得率分别为23.75％和26.33％，纯度分别为94.21％和96.38％。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充4％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
72.实施例7
73.将阴干后的喜树种子粉碎，过120目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与30ml浓度为100mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯
袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为3min，提取压力为100mpa，提取次数为1次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在6000rpm/min的转速下离心10min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的提取率分别为81.00％和88.90％。然后，在喜树种子提取液中加入1％活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入9ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为2次，每次萃取均加入9ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为47.22％和51.89％，将粗品一溶解在甲醇：三氯甲烷＝1∶5的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.5∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为71.92％和75.64％。将粗品二分别溶解在1ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为4mg/ml和6mg/ml)，加入20ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品得率分别为27.53％和29.36％，纯度分别为91.25％和93.19％。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充5％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
74.实施例8
75.将阴干后的喜树种子粉碎，过80目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与20ml浓度为100mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为3min，提取压力为150mpa，提取次数为3次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在5000rpm/min的转速下离心10min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的提取率分别为82.10％和89.20％。然后，在喜树种子提取液中加入活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入6ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为3次，每次萃取均加入6ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为44.85％和47.62％，将粗品一溶解在甲醇：三氯甲烷＝1∶5的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.3∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为75.49％和77.61％。将粗品二分别溶解在1ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为5mg/ml和7mg/ml)，加入25ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品得率分别为25.66％和27.83％，纯度分别为92.32％和94.54％。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充6％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
76.实施例9
77.将阴干后的喜树种子粉碎，过100目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与20ml浓度为60mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为3min，提取压力为100mpa，提取次数为2次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在5000rpm/min的转速下离心10min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取
液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的提取率分别为80.98％和89.30％。然后，在喜树种子提取液中加入2％活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入5ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为5次，每次萃取均加入5ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为42.17％和45.30％，将粗品一溶解在甲醇∶三氯甲烷＝1∶5的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.2∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为71.11％和73.65％。将粗品二分别溶解在1ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为5mg/ml和7mg/ml)，加入15ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品得率分别为23.26％和25.69％，纯度分别为92.37％和93.49％。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充5％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
78.实施例10
79.将阴干后的喜树种子粉碎，过100目筛，得到喜树种子粉末。称取喜树种子粉末1g与20ml浓度为60mg/ml的胶束提取溶剂(sls)充分混合，得到混合物。将混合物装入聚乙烯袋中，密封，置于超高压设备中，进行超高压提取，提取时间为5min，提取压力为150mpa，提取次数为3次。提取结束后，取出装有混合物的聚乙烯袋，将混合物倒出，在5000rpm/min的转速下离心10min，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液，通过高效液相色谱测定提取液中喜树碱和羟基喜树碱的含量，经过计算得到喜树碱和羟基喜树碱的提取率分别为81.27％和88.92％，喜树种子提取液的液相图如图1所示。然后，在喜树种子提取液中加入1％活性炭和硅藻土以除去色素和蜡质等杂质得浸膏。之后，将1g浸膏烘干，加入7ml丙酮萃取，离心获得丙酮层，萃取次数为4次，每次萃取均加入7ml的新鲜丙酮，收集丙酮层浓缩旋干，得到粗品一，cpt和hcpt的纯度分别为46.81％和49.10％，将粗品一溶解在甲醇∶三氯甲烷＝1∶5的溶剂中，通过柱层析硅胶，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝0.4∶100，hcpt的洗脱液比例为甲醇∶三氯甲烷＝1.4∶100，得到cpt和hcpt粗品二，cpt和hcpt的纯度分别为73.09％和75.22％。将粗品二分别溶解在1ml乙醇中(cpt和hcpt在乙醇中的浓度分别为4mg/ml和7mg/ml)，加入20ml去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品得率分别为25.73％和27.84％，纯度分别为92.64％和94.59％，不同纯化步骤的液相图如图2所示。将上述步骤中经丙酮萃取后的残渣用水复溶，离心除去不溶性杂质，收集上清，补充6％体积的sls，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。
80.以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的新生产工艺，具体包括超高压胶束提取、脱色、固液萃取、柱层析、反溶剂重结晶纯化分离工序，其特征在于，包括以下步骤：(1)将喜树种子阴干，粉碎，过筛，得到喜树种子粉末；(2)将步骤(1)得到的喜树种子粉末与胶束提取溶剂按一定料液比充分混合，得到混合物，将混合物装入聚乙烯袋中，密封；(3)将步骤(2)装有混合物的聚乙烯袋置于超高压设备中，进行超高压提取；(4)提取结束后，倒出步骤(3)处理后的聚乙烯袋中的混合物，分离喜树种子残渣，得到喜树种子提取液；(5)将步骤(4)得到喜树种子提取液加入活性炭和硅藻土，除去色素和蜡质等杂质得浸膏；(6)之后，将步骤(5)浸膏烘干，加入丙酮萃取，涡旋混匀，离心除去残渣，上清丙酮层浓缩，旋干得粗品一；(7)将步骤(6)粗品一溶解在甲醇和三氯甲烷混合溶剂中，通过硅胶柱层析，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，得到cpt和hcpt粗品二；(8)将步骤(7)粗品二分别溶解在乙醇中，加入去离子水溶液中反溶剂重结晶，得到喜树碱和羟基喜树碱纯品；(9)将步骤(6)中经丙酮萃取后的剩余残渣回收，用水复溶，补充一定体积的十二烷基磺酸钠(sls)，重复应用于下一次喜树碱和羟基喜树碱的提取。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的步骤(1)喜树种子粉末粒度为10～200目。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的步骤(2)的胶束提取溶剂为sls，其浓度为10mg/ml～80mg/ml，喜树种子粉末与胶束提取溶剂的用量比为1g∶10～40ml。4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的步骤(3)中超高压提取时间为1～10min，提取压力为25～200mpa，提取次数为1～5次。5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中超高压提取后的分离步骤为离心，转速为5000～10000rpm/min，时间为5～10min，得到所述喜树种子提取液。6.根据权利要求1所述的纯化分离方法，其特征在于，所述的步骤(5)喜树种子提取液加入0.5％～2％活性炭和硅藻土加热搅拌，除去色素和蜡质等杂质得浸膏。7.根据权利要求1所述的纯化分离方法，所述的步骤(6)浸膏烘干后加入的丙酮溶液萃取的体积比为1∶2～1∶8(g∶ml)，萃取次数为1-5次，离心后收集丙酮层旋干浓缩后计算纯度。8.根据权利要求1所述的纯化分离方法，所述的步骤(7)样品溶解在甲醇和三氯甲烷混合溶剂的体积比为1∶1～1∶6的溶剂中，通过硅胶柱层析，将喜树碱和羟基喜树碱进行洗脱分离，cpt和hcpt的洗脱液范围为甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100～1.5∶100。将采集的样品分别进行旋干，得到cpt和hcpt粗品。9.根据权利要求1所述的纯化分离方法，所述的步骤(8)的样品采用反溶剂重结晶法(乙醇为溶剂，水为反溶剂)，所述cpt和hcpt在乙醇中的浓度范围分别为1～10mg/ml和1～10mg/ml，所述的乙醇∶水的体积比范围为1∶10～1∶30，得到cpt和hcpt晶体。
10.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的步骤(9)补充的sls的体积为1％～6％。

技术总结
本发明属于脂溶性化学成分提取纯化分离领域，具体公开了一种喜树种子中两种难溶生物碱的绿色可持续提取纯化分离方法。本发明以十二烷基磺酸钠胶束为提取溶剂，采用超高压胶束提取、脱色、固液萃取、柱层析、反溶剂重结晶纯化等一系列工序，实现喜树碱(CPT)和羟基喜树碱(HCPT)的高效提取和纯化。本发明操作简单、提取效率高、能耗低、绿色环保、提取过程安全可靠，纯化过程简单易操作，具有较高的经济效益和环境效益，极具推广应用价值。极具推广应用价值。


技术研发人员：赵修华 王思莹 谢兰兰 贾文强 杨旗蕾 赵文
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/8/1