一种根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法

1.本发明涉及林木转基因
技术领域：
：，尤其涉及一种根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法。
背景技术：
：：2.笃斯越橘(拉丁学名：vacciniumuliginosum)是我国分布最广且储存量最大的唯一天然野生蓝莓，也叫东北野生蓝莓，为杜鹃花科(ericaceae)越橘属(vaccinium)多年生落叶灌木1.。世界上90％的笃斯越橘主要分布在中国，主要分布于大兴安岭、小兴安岭和长白山等地区2.。笃斯越橘的浆果营养丰富，香甜可口，因此可以作为一种很好的保健食品。此外，浆果中丰富的花青素类天然色素的含量高，可用于调配出多种颜色，而且适应加工，可参与制造多种饮品、甜品以及调味品等，具有较高的经济价值3.。笃斯越橘虽是我国面积最大、贮量最多的野生浆果资源，但多生长在人烟稀少的深山中，人工育种至今尚无突破。然而，随着越橘的高营养价值越来越广为人知，市场需求量愈来愈大，我国对笃斯越橘的人工育种的开发利用就愈来愈迫切。3.日常生活最耳熟能详的蓝莓，是越橘属中无性系繁殖和转基因技术最成熟的。蓝莓是越橘属下的蓝莓亚属，市场商品化程度和种植规范化程度高，现有越橘属植物的转基因方法都是以蓝莓为材料开发的。蓝莓的育种工作始于20世纪初，美国coville博士从野生伞房花越橘(v.corymbosum)和狭叶越橘(v.angustifolium)的优株中选育出第一批蓝莓品种，在美国新泽西州进行栽培试验，开创了世界蓝莓育种工作的先河4.。此后，研究员rowland等对越橘属高丛蓝莓进行了转基因研究，试图引入外源基因来提高其抗病性和耐寒性，尽管这项研究没有成功，但它为后来的蓝莓转基因育种研究提供了经验5.；1998年，研究员cao等在转基因蓝莓的研究中成功地利用根癌农杆菌菌株eha105，以北方高丛蓝莓和南方高丛蓝莓腋芽为研究材料进行转基因研究，发现农杆菌菌株eha105的转化效率比lba4404更高，且最终成功地构建了蓝莓的转基因体系6.；2004年，宋国庆等以高丛蓝莓品种'aurora'、‘brigitta'、‘bluecrop’、‘legacy'60-70d苗龄的叶片为受体材料，使用根癌农杆菌eha105进行转化，共培养时间为6d，经过kana的筛选和gus检测，四个蓝莓品种都获得了转基因植株，但是转化效率普遍较低7.。将vcsoc1k基因在蓝莓'aurora’中进行过表达，提高了转基因植株对碱性土壤的耐受能力，使转基因植株的花期提前，促进了更多花芽的形成8.。2012年，song又以南方高丛蓝莓品种‘legacy'为研究材料，转入蓝莓c-重复结合因子(cbf)基因，阐明了cbf调控网络可以提高蓝莓的耐寒性9.；赵鑫通过农杆菌介导法将外源抗寒基因转入蓝莓‘北陆’当中，成功获得8株能够正常生长的转基因蓝莓苗，也因此提高了转基因蓝莓植株的耐寒性10.；在2020年，学者m乙酰丁香酮afumi等以在日本实验农场种植的两个高丛蓝莓品种‘o’neal’(‘on’)和‘bluemuffin’(‘bm’)为实验研究材料，使用crispr/cas9技术进行基因组编辑，并研究了该技术对蓝莓转化的影响。研究结果表明，基因组编辑技术有助于加快蓝莓育种和促进蓝莓转化11.；2022年，山东农业大学以“红纽扣”为实验材料，建立了一个高效的农杆菌介导的遗传转化系统。其中绿色荧光蛋白(gfp)编码基因的转化效率约为12.82％12.。4.目前已有的关于越橘属植物转基因方面的研究都是以蓝莓为研究材料展开的，因此越橘还没有可行的转基因体系。现有的越橘属植物转基因方法仅适用于高丛蓝莓，而不适用于笃斯越橘。因此，我们需要着手开发笃斯越橘的转基因技术，这对我国丰富的笃斯越橘资源开发利用有重要作用，尤其在实现它的经济价值上。参考文献[1]宗长玲，邓萌，宗成文，等.笃斯越橘研究进展[j].北方园艺，2011(12)：173-176.[2]王明洁.黑龙江省笃斯越橘种质资源考察与分类评价[j].黑龙江农业科学，2019，no.306(12)：88-93.[3]张友民，王立军，贾伟平，谷安根.笃斯越桔营养器官初生结构的解剖学研究[j].吉林农业大学学[4]徐国辉，雷蕾，安琪，罗霖锜，王贺新.美国越橘属资源在蓝莓育种中的利用及发展趋势分析[j].果树学报，2021，38(07)：1173-1189.[5]ogdenljrel.efficientshootregenerationfromleafsectionsofhighbushblueberrysuitableforuseinagrobacteriummediatedtransformations[j].ruitlaboratorybeltsvilleagriculturalresearchcenteragriculturalresearchservice1993，beltsville，md20705[6]a.hoekemaprh，p.j.j.hooykaas，schilperoortra.abinaryplantvectorstrategybasedonseparationofvirandt-regionoftheagrobacteriumtumefaciensti-plasmid[j].departmentofbiochemistry，1983，33.[7]songgq，walwortha，zhaod，etal.thevacciniumcorymbosumfloweringlocust-likegene(vcft)：afloweringactivatorreversesphotoperiodicandchillingrequirementsinblueberry[j].plantcellrep，2013，32(11)：1759-69.[8]saloniaf，ciacciullia，polesl，etal.newplantbreedingtechniquesincitrusfortheimprovementofimportantagronomictraits.areview[j].frontplantsci，2020，11：1234.[9]songg-q，hancockjf.recentadvancesinblueberrytransformation[j].internationaljournaloffruitscience，2012，12(1-3)：316-32.[10]赵鑫.优质蓝莓转lea基因及耐寒性分析研究[d].东北林业大学，2011.[11]omorim，yamaneh，osakabek，etal.targetedmutagenesisofcentroradialisusingcrispr/cas9systemthroughtheimprovementofgenetictransformationefficiencyoftetraploidhiggbushblueberry[j].thejournalofhorticulturalscienceandbiotechnology，2020，96(2)：153-61.[12]wang，g.d，liu，m.m，liu，g.z.etal.establishmentandoptimizationofagrobacterium-mediatedtransformationinblueberry(vacciniumspecies)[j].scientiahorticulturae，2022，10：304.技术实现要素：[0005]本发明提供了一种根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，该方法以笃斯越橘的幼嫩茎叶为实验材料，在笃斯越橘愈伤组织再生体系的基础上实现了以根癌农杆菌介导的遗传转化，建立了笃斯越橘稳定且快速的遗传转化体系。[0006]具体技术方案如下：本发明提供了一种笃斯越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，包括：(1)在特定侵染液辅助下通过根癌农杆菌传递质粒到笃斯越橘中完成转基因；(2)用于农杆菌转基因的植物材料是笃斯越橘的愈伤组织，由笃斯越橘叶片和茎段经剪切和预培养得到；(3)农杆菌侵染外植体过程包含农杆菌与外植体在侵染液中、超声刺激、摇床培养抚育、外植体脱离菌液、外植体在共培养培养基上进行培养、共培养结束后细菌等过程；(4)外植体在筛选培养基中进行筛选培养，转基因材料愈伤组织长大，通过芽诱导培养基诱导生芽，芽长大；(5)通过生根培养基诱导生根。[0007]本发明使用的ruby报告基因，ruby报告基因在愈伤组织表达后，可以在转基因成功的愈伤组织中生成甜菜红素，是一种天然无害、观察方便、节省成本的报告系统。ruby阳性转基因愈伤呈现火龙果红色，不需要经过其他处理便可进行转基因阳性愈伤组织的判断。[0008]作为优选，进一步地，步骤(1)中，所述菌液的od600值为0.4-0.6，农杆菌种类为：陈其军实验室开发的三元体系中使用的lba4404.这里写为lba4404-ternary；作为优选，进一步地，步骤(1)中，所述侵染液的配方为：wpm+3％蔗糖+0.4mg/lcppu+0.8mg/liba+2mg/ll-谷氨酰胺+10mg/l乙酰丁香酮，ph＝5.2±0.02；作为优选，进一步地，步骤(2)中，所述外植体为切过的叶片和茎段，叶片正面朝下、茎段横置在愈伤诱导培养基，放置于28度的暗培养箱中预培养；作为优选，进一步地，步骤(2)中，外植体侵染步骤为：首先，28度摇床先摇20-30min，再对材料进行超声破碎(振幅60％)40s和抽真空处理3次，每次5min，之后再28度摇床摇培2h；作为优选，进一步地，步骤(3)中，共培养条件为：28℃黑暗条件下培养6d；作为优选，进一步地，步骤(3)中，共培养培养基：wpm+0.5％蔗糖+8.5g/l琼脂+0.4mg/lcppu+0.8mg/liba+2mg/ll-谷氨酰胺+10mg/l乙酰丁香酮，ph＝5.2±0.02；作为优选，进一步地，步骤(4)中，共培养结束后，用含400mg/l羧苄的灭菌ro水清洗转基因材料，清洗10遍左右，每遍30-60s；所述筛选培养条件为：28℃黑暗条件培养，每两周继代一次，继代两次后将材料移至28℃光照条件下培养，每天光照16h，黑暗8h，光照强度为50μe.m-2.s-1，培养40-60d后出现火龙果红色愈伤组织，出现转基因愈伤组织后，调整iba与cppu的激素比例，加速出芽；出现转基因芽后观察其生长状态，逐渐降低cppu浓度和添加zt激素，使其转基因芽生长。作为优选，进一步地，步骤(5)中，生根培养基的配方：wpm+3％蔗糖+8.5g/l琼脂+0.3mg/liaa+1.0mg/lkt，ph＝5.2±0.02。[0009]本发明中，“cppu”是指吡效隆；“iba”是指吲哚丁酸；“iaa”是指吲哚乙酸；“kt”是指激动素。[0010]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)首次实现了笃斯越橘愈伤组织的转基因，且获得了转基因芽，转化率达4.65％。(2)本发明中笃斯越橘的幼嫩枝条和叶片均可作为外植体，材料获得比较容易。附图说明图1，a为对照，未转入ruby基因的笃斯越橘不定芽；b～f转入ruby基因后的笃斯越橘不定芽生长过程。具体实施方式[0011]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。[0012]实施例1一种根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，具体步骤如下：(1)植物取材：以生长良好的无菌笃斯越橘的幼嫩叶片、茎段作为外植体材料，剪切过后正面朝下、平铺于预培养基上，放置于28度的暗培养箱中培养10～14d；所用培养基为：wpm+0.5％蔗糖+8.5g/l琼脂+0.4mg/lcppu+0.8mg/liba，ph＝5.2±0.02。(2)摇菌：将报告基因甜菜色素合成基因ruby转入农杆菌lba4404-temary中，然后摇菌，od600值为0.4-0.6。(3)侵染：将预培养好的外植体材料放入wpm侵染液中，且wpm侵染液中加入乙酰丁香酮、吡效隆(cppu)、吲哚丁酸(iba)；侵染培养的条件为：28度摇床先摇20-30min，再对材料进行超声破碎(振幅60％)40s和抽真空处理3次，每次5min，之后再28度摇床摇培2h；农杆菌侵染液的制备方法采用本领域常规方法进行制备；(4)共培养：在侵染处理结束后，将侵染液倒掉，然后将处理过的材料放在灭菌的滤纸上晾干。接下来，将材料置于共培养基中，以进行共培养。共培养培养基的配方为：wpm+0.5％蔗糖+8.5g/l琼脂+0.4mg/lcppu+0.8mg/liba+2mg/ll-谷氨酰胺+10mg/l乙酰丁香酮，ph值为5.2±0.02。为防止材料大面积滋生菌类，可以在共培养基表面放置一张经过灭菌处理的无菌滤纸。共培养条件为在黑暗、28℃下共培养6天。(5)筛选培养：完成共培养后，需要对转基因材料进行清洗。这一步骤包括使用含有400mg/l羧苄(carb)的灭菌ro水清洗转基因材料，清洗次数大约为10次，每次清洗时间为30-60s。处理后的材料需要晾干并放在无菌滤纸上，然后将其放入筛选培养基中进行筛选培养。筛选培养条件包括在28℃黑暗条件下培养，每两周继代一次，继代两次后将材料移至28℃光照条件下培养。光照条件包括每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为50μe·m-2·s-1。随着时间的推移，愈伤组织会逐渐明显增殖长大，40-60天后，洋红色愈伤组织开始出现。筛选培养基成分包括：wpm+0.5％蔗糖+8.5g/l琼脂+0.4mg/lcppu+0.8mg/liba+200mg/lcar+2.0mg/ll-谷氨酰胺+15mg/l潮霉素，ph值为5.2±0.02。(附图b-f为转基因植物材料生长过程)[0013]实验结果：整个转基因体系的生长周期为8个月(从外植体材料到报告基因成功转入再到长出芽成苗)，其中转化率可达到4.65％。[0014]对比例1本对比例选用另一种农杆菌gv3101，用同样的筛选抗生素潮霉素对转基因材料进行筛选，发现转基因材料的愈伤组织易褐化，愈伤组织不易存活，无火龙果色愈伤组织出现。[0015]具体步骤如下：本对比例外植体不进行预培养，剪切后直接进行侵染；所用农杆菌、侵染液、共培养、筛选培养配方均与实例1不同。(1)植物取材：以生长良好的无菌笃斯越橘的幼嫩叶片、茎段作为外植体材料，采取垂直于叶脉剪切的方法；(2)侵染：首先，将经过剪切的材料直接作为侵染材料。接下来，将其放入预先准备好的农杆菌gv3101ms侵染液中进行侵染培养，侵染液中加入20mg/l的乙酰丁香酮。侵染的条件是在28℃的摇床上摇动2小时。农杆菌侵染液的制备方法采用本领域常规方法进行制备；(3)共培养：经过侵染培养后，待侵染结束后，将侵染完成的材料倒出侵染液，晾干并放在滤纸上。接下来，将材料放入预先准备好的共培养基中进行共培养。该共培养基包括wpm、3％的蔗糖、8.5g/l的琼脂、0.50mg/liba、1.0mg/lzt以及20mg/l乙酰丁香酮，ph值为5.2±0.02。在共培养基表面可以放一张灭菌的无菌滤纸，以防止材料大面积长菌。共培养的条件是在28℃的黑暗条件下培养4天。(4)筛选培养：在共培养结束后，将转基因材料用含300mg/l头孢的灭菌ro水清洗，清洗大约10遍，每遍30-60秒，然后在无菌滤纸上晾干。接下来，将晾干后的材料放入筛选培养基中进行筛选培养。筛选培养条件为在黑暗条件下，以28℃为温度进行培养，每两周继代一次。经过一段时间的培养，愈伤组织会有明显的增殖和长大。所述筛选培养基包含wpm培养基、3％蔗糖、8.5g/l琼脂、0.50mg/liba、1.0mg/lzt、10mg/l潮霉素和300mg/lcarb，ph值为5.2±0.02。[0016]结果表明，愈伤组织在筛选过程中易出现褐化，导致转基因材料在筛选过程中存活率大大降低，严重影响了转化效率。[0016]对比例2本对比例选用另一种农杆菌eha105，用同样的筛选抗生素潮霉素浓度对转基因材料进行筛选，发现转基因材料生长缓慢，愈伤组织不易存活。具体步骤如下(步骤(1)实施例1步骤(1)相同)：(1)植物取材：以生长良好的无菌笃斯越橘的幼嫩叶片、茎段作为外植体材料，采取垂直于叶脉剪切的方法，正面朝下、平铺于预培养基上，放置于28度的暗培养箱中培养10～14d；所用培养基为：wpm+3％蔗糖+8.5g/l琼脂+0.4mg/lcppu+0.8mg/liba，ph＝5.2±0.02；(2)侵染：材料在再生培养基中培养10d后便作为侵染材料，然后将其放人制备好的od600值为0.4-0.6的农杆菌eha105wpm侵染液中进行侵染培养，并且侵染液中加入2mg/ll-谷氨酰胺和10mg/l乙酰丁香酮；侵染培养的条件为：28℃摇床先摇10min，再进行超声破碎40s，振幅不定，最后再28℃摇床摇2h；农杆菌侵染液的制备方法采用本领域常规方法进行制备；(3)共培养：经过侵染培养后，待侵染结束后，将侵染完成的材料倒出侵染液，晾干并放在滤纸上。接下来，将材料放入预先准备好的共培养基中进行共培养。该共培养基包括wpm、3％的蔗糖、8.5g/l的琼脂、0.40mg/liba、0.8mg/lcppu以及10mg/l乙酰丁香酮，ph值为5.2±0.02。在共培养基表面可以放一张灭菌的无菌滤纸，以防止材料大面积长菌。共培养的条件是在28℃的黑暗条件下培养6天。(4)筛选培养：在共培养结束后，将转基因材料用含300mg/l头孢的灭菌ro水清洗，清洗大约10遍，每遍30-60秒，然后在无菌滤纸上晾干。接下来，将晾干后的材料放入筛选培养基中进行筛选培养。筛选培养条件为在黑暗条件下，以8℃为温度进行培养，每两周继代一次。经过一段时间的培养，愈伤组织会有明显的增殖和长大。所述筛选培养基包含wpm培养基、3％蔗糖、8.5g/l琼脂、0.40mg/liba、0.80mg/lcppu、10mg/l潮霉素和300mg/lcarb，ph值为5.2±0.02。[0017]结果表明，转基因材料在筛选过程中生长比较缓慢，愈伤组织不易存活，虽有个别愈伤组织表现出火龙果红色，但该火龙果红色愈伤组织无法增殖长大，一段时间后甚至消失不见，转基因材料假阳性比较高，严重影响了转基因效率。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在特定侵染液辅助下通过根癌农杆菌传递质粒到笃斯越橘中完成转基因；（2）用于农杆菌转基因的植物材料是笃斯越橘的愈伤组织，由笃斯越橘叶片和茎段经剪切和预培养得到；（3）农杆菌侵染外植体过程包含农杆菌与外植体在侵染液中、超声刺激、摇床培养抚育、外植体脱离菌液、外植体在共培养培养基上进行培养、共培养结束后细菌等过程；（4）外植体在筛选培养基中进行筛选培养，转基因材料愈伤组织长大，通过芽诱导培养基诱导生芽，芽长大；（5）通过生根培养基诱导生根。2.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（1）中，所述菌液的od
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为0.4-0.6。3.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）中，所述外植体为切过的叶片和茎段，叶片正面朝下、茎段横置在愈伤诱导培养基，放置于28度的暗培养箱中预培养。4.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）中，侵染液为wpm液体培养基：wpm + 3% 蔗糖 + 0.4 mg/l cppu + 0.8 mg/l iba + 2 mg/l l-谷氨酰胺 + 10 mg/l 乙酰丁香酮，ph = 5.2
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0.02。5.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）中，侵染步骤为：首先，28度摇床先摇20-30 min ,再对材料进行超声破碎（振幅60%）40s和抽真空处理3次，每次5 min，之后再28度摇床摇培2 h。6.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（3）中，共培养基为：wpm + 0.5 % 蔗糖 + 8.5 g /l 琼脂 + 0.4 mg/l cppu + 0.8 mg/l iba + 2 mg/l l-谷氨酰胺 + 10 mg/l 乙酰丁香酮，ph = 5.2
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0.02。7.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（4）中，筛选培养基为：wpm +0 .5% 蔗糖 + 8.5 g /l 琼脂+ 0.4 mg/l cppu + 0.8 mg/l iba + 200 mg/l car + 2.0 mg/l l-谷氨酰胺 + 15 mg/l 潮霉素，ph = 5.2
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0.02。8.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的笃斯越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（5）中，生根培养基的配方：wpm + 3 % 蔗糖 + 8.5 g /l 琼脂+ 0.3 mg/l iaa + 1.0 mg/l kt ，ph = 5.2
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0.02。

技术总结
本发明公开了一种笃斯越橘转基因体系的建立方法，该方法包括：以笃斯越橘无菌幼嫩茎叶为外植体，接种到预培养基中培养10-14d；得到生长状况良好的愈伤组织后，以此为侵染材料进行侵染，农杆菌侵染后共培养8天，经过潮霉素筛选后培养40-60d后出现火龙果红色愈伤组织，出现转基因愈伤组织后，调整IBA与Cppu的激素比例，加速出芽，转基因不定芽长到2-3cm，移到生根培养基上诱导生根。本发明针对笃斯越橘，转化率达4.65％，为笃斯越橘的转基因繁殖提供了技术支持。了技术支持。


技术研发人员：崔富强 刘书评
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/8/1