兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球及其制备方法与应用，能够用于内源性退变组织再生，尤其是对椎间盘退变组织的内源性再生。


背景技术：

2.干细胞在特殊诱导分化的调节下，具有向多种细胞增殖分化的潜能，从而有望弥补或代替退变细胞或组织的功能。然而，退变组织中异常的机械微环境诱发了细胞命运的错误定向，导致体外培养的干细胞在体内难以实现高效的内源性再生。
3.内源性再生策略一般是使用功能性生物材料激活组织内源性的祖/干细胞迁移到受损部位，内源性细胞通过分化来替代凋亡的细胞，同时分泌抗炎的细胞因子来实现组织重建。然而，在组织修复的过程中，即使生物材料成功募集到了足够的内源性细胞，也难以完全恢复正常的组织功能，往往导致内源性修复失败。
4.内源性修复失败的机制缘于损伤组织的恶劣微环境会影响内源性细胞的存活和分化，而未经训练的细胞缺乏向目标谱系定向分化和炎症调节的能力。因此，往往需要对内源性祖/干细胞进行合适地训练，以达到指导其分化为治疗性细胞来实现精准的内源性修复。
5.基于生物材料的细胞训练策略已经被应用于祖/干细胞的定向分化，这些训练策略主要可分为两类：生化诱导和物理刺激。生化诱导包括采用诱导性生化因子和基因工程方法。诱导性生化因子，例如bmp-2和tgf-β3能够促进干细胞的骨和软骨分化，然而这些诱导生化因子的使用剂量一直充满争议，为了保证干细胞的有效分化，通常需要添加高剂量的诱导生化因子，而高剂量的诱导生化因子在体内可能会激活炎症和额外的骨赘形成。基因工程方法，是通过调控特定的兴趣基因来精确训练干细胞行为，然而基因转染效率与细胞毒性之间很难取得平衡。物理刺激与生化诱导相比具有更高的生物安全性，诸如电磁刺激的物理信号训练已经被证实能在体外促进干细胞的神经和心脏分化，但是作为外源性的物理激励手段，不稳定的信号输入和能源供应问题限制了其在体内的应用。
6.细胞外基质(ecm)传递的机械信号被证明是调控干细胞行为和命运的巨大因素。细胞的整合素受体与ecm配体结合来实现稳定的粘附，细胞的肌动蛋白产生骨架来反馈ecm的机械信号，并通过yes相关蛋白(yap)将机械信号转录至核内，从而激活下游的信号通路调控自身的行为。在再生过程中，受损的组织会经历一系列的基质重塑和ecm模量的转变，以促进内源性干细胞的增殖和迁移、实现早期的自我修复。这一现象提示了ecm的弹性模量是训练干细胞行为模式的重要机械线索。
7.然而，在严重的组织损伤和长期的退行性疾病中，异常变化的基质模量会导致内源性干细胞池的耗竭和失控的分化，导致修复失败。例如，骨关节炎患者的软骨表现出远高于健康软骨的弹性模量；眼部组织的硬化与眼部神经退行性疾病的进程密切相关。
8.许多实验已经证明，模拟组织特异性模量的基质可以促进干细胞向特定的组织谱系分化。例如，tian等
1.的研究表明：软基质(《5kpa)抑制肌动蛋白丝形成，促进干细胞向脂肪和内皮细胞分化；而硬基质(》10kpa)促进干细胞的扩散及肌动蛋白聚合，从而激活yap的核定位，继而反映出更高的成骨、心肌的分化趋势。又如，engler
2.等发现，在较低弹性模量的水凝胶上(1kpa左右)，多能干细胞向神经细胞方向分化；在中等弹性模量的水凝胶上(10kpa左右)，由于与肌肉组织弹性模量相近，则细胞向肌细胞方向分化；在较高硬度的水凝胶上(100kpa左右)，则更适合成骨细胞方向分化。再如，李岳等
3.发现，材料本身的弹性模量增大，更利于肠道细胞的分化。可见，材料的弹性模量可显著影响细胞黏附、迁移、增殖和分化等行为，且不同组织的特异性模量与细胞分化密切相关。
9.椎间盘退变可归因于髓核(np)细胞的衰老和过度凋亡，导致细胞外基质(ecm)的合成/代谢失衡，最终导致ecm降解。研究证明从退化椎间盘中分离的髓核间充质干细胞具有较强的增殖能力和分化潜能。
10.近年来，多项研究证明在椎间盘的软骨终板、纤维环和髓核区域存在原生的祖/干细胞壁龛，并且这些细胞同样具备成骨、软骨和脂肪分化的全能性。因此，激活这些内源性细胞从壁龛区迁移到髓核是有望治疗椎间盘退变的新方法。
11.但是，由于退变椎间盘的髓核具有局部硬化的特征，较高的弹性模量将会传递不良的机械信号导致内源性细胞错误分化，加重椎间盘的纤维化和退变。因此，对于椎间盘而言，现有的具有机械训练的植入物往往会牺牲相应的弹性模量，以保证椎间盘源祖/干细胞向髓核细胞分化，但这对植入材料的使用性能造成了不利影响。由于椎间盘属于关节活动的应力组织，决定了椎间盘植入材料需要足够的力学性能和生物学要求，有些支架的模量和强度甚至达到了几十兆帕
4.。因此，人们一方面渴望椎间盘植入材料能够满足其较高的力学性能要求，另一方面又希望材料具有相对低的弹性模量以促进椎间盘源祖/干细胞向髓核细胞分化，成为现阶段椎间盘植入材料开发的一大矛盾。
12.例如，navaro等
5.合成了一种水凝胶，为了更有利于髓核干细胞的粘附并促进髓核相关基因aggrecan和sox9的表达，其研究结果表明选择具有较低剪切储能模量(1kpa)的水凝胶比具有较高剪切储能模量(2kpa)的水凝胶效果更佳。因此，现有研究得出的结论是：想要实现髓核干细胞更好的定向分化，促进相关分化基因的表达，更倾向于制备剪切储能模量为1kpa的水凝胶。显然，人们希望水凝胶材料的模量更高来满足其在体内的性能。
13.现阶段，对于如何解决椎间盘内源性干细胞在定向分化时需要较低的模量，但在体内应用时需要较高的强度的矛盾，极少有文献报道，该问题成为椎间盘植入材料研究的一大难题。
14.因此，在实现内源性治疗椎间盘再生过程中，如何提供一种既具有相对较高的弹性模量，能够更好满足椎间盘体内的应用，同时还能很好训练干细胞向髓核细胞分化的体内植入材料，成为亟待解决的技术问题。
15.引用的参考文献如下：
16.[1]k.-k.tian,s.-c.huang,x.-x.xia,z.-g.qian,biomacromolecules 2022,23,1777.
[0017]
[2]engler a j,sen s,sweeney h l,et al.matrix elasticity directs stem cell lineage specification[j].cell,2006,126(4):677-89.
bb缓释超过28天，在体外能促进髓核干细胞的增殖和迁移能力。在体内，机械训练微球可以形成一个临时的干细胞生态位，在大鼠针刺椎间盘退变模型中同样观察到了椎间盘祖/干细胞的成功招募和上调的ecm合成。
[0032]
进一步的是，步骤(2)中所述微流控方法的步骤如下：将明胶甲基丙烯酸酯预聚物和光引发剂的混合溶液注入微流控通道，在油相的剪切下形成单分散的水凝胶液滴，而后使用365nm蓝光交联液滴，形成固化的水凝胶微球。
[0033]
进一步的，所述明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球中明胶甲基丙烯酸酯预聚物的浓度为7.5wt％，明胶甲基丙烯酸酯材料中光基团甲基丙烯酸酯的取代度为20％。
[0034]
进一步的，步骤(3)中所述纤连蛋白溶液的浓度为2μg/ml。
[0035]
进一步的，步骤(3)中所述纤连蛋白与明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球的重量比为1:3。
[0036]
进一步的，步骤(3)中是于37℃下振荡孵育1小时。
[0037]
进一步的，步骤(4)中所述血小板源生长因子-bb和纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球的质量比为1:200000～250000。
[0038]
进一步的，步骤(4)中是将稀释后的血小板源生长因子-bb溶液与纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球于4℃下振荡孵育12小时。
[0039]
本发明的目的之二是提供一种如上所述方法制备得到的兼具力学性能和促分化的水凝胶微球，所述水凝胶微球的弹性模量为2kpa，所述水凝胶微球的平均粒径为80-200μm。
[0040]
本发明的目的之三是提供如上所述方法制备得到的水凝胶微球在制备治疗椎间盘退变的植入材料中的应用。
[0041]
进一步的，本发明还提供了如上所述方法制备得到的水凝胶微球在制备治疗椎间盘内源性再生的药物中的应用。
[0042]
本发明的有益效果如下：
[0043]
本发明构建了一种兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球，其结合了内源性细胞招募和指导细胞分化的特性，以修复椎间盘退变。本发明提供的水凝胶微球能够独立且灵活地调节弹性模量和ecm配体密度，并能动员内源性干细胞的迁移并训练细胞、指导其分化命运。体外和体内实验表明，本发明的水凝胶微球能有效地通过机械信号传导来训练干细胞分化成髓核样细胞，实现最大的髓核修复能力。同时，该水凝胶材料的弹性模量与现有技术相比得到了提升，能够更好地用于体内应用。
附图说明
[0044]
图1中：a)明胶和20％、100％ ma取代度gelma的1h nmr谱；b)gelma机械性能和ecm密度变化的示意图；c)微球的形态表征：i)微球的显微镜图像；ii)粒径分布；d)水凝胶的压缩特性：i)水凝胶的应力-应变曲线；ii)水凝胶的弹性模量；(n＝3)；iii)水凝胶的流变学分析；(n＝3)；e)fn-gelma微球的表征：i)gelma和fn相互作用的示意图；ii)fn-gelma微球的免疫荧光图像；iii)微球的命名原则；f)不同密度下ecm配体修饰程度的量化；(n＝3)；g)冻干微球的sem图像；****p《0.0001。
[0045]
图2中：a)微球的机械线索对细胞骨架聚合影响的示意图；b)f-肌动蛋白聚合的共
聚焦免疫荧光图像和肌动蛋白排列；c)npscs的f-肌动蛋白定位的量化；(n＝5)；d)肌动蛋白丝平均直径的量化；(n＝10)；*p《0.05；**p《0.01and****p《0.0001。
[0046]
图3为pscs的np样分化表征；a)机械传导指导细胞命运的示意图；b)检测细胞基因表达的程序示意图；c)yap和col ii的免疫荧光图像；d)yap核定位的量化；(n＝5)与ultrasoft-l组比较；e)col ii的半定量荧光强度；(n＝5)与ultrasoft-l组比较；f)分化基因的表达；与control组比较；(n＝3)；g)分解代谢基因的表达；与control组比较；(n＝3)；*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
[0047]
图4中：a)fn与pdgf-bb的结合示意图；b)gelma微球和fn-gelma微球的释放曲线；(n＝3)c)细胞迁移的评估；i)细胞划痕愈合实验示意图；ii)0、12、24h划痕的显微图像；iii)划痕愈合百分比的量化；(n＝3)d)细胞趋化的评估；i)趋化性实验的示意图；ii)npscs从上室迁移的显微图像；iii)细胞迁移数量的量化；(n＝3)；e)评估微球在三维培养模型中捕获npscs的能力；i)将微球与npscs在非粘附板上进行培养；ii-iv)24小时后捕获和粘附在gelma、fn-gelma和pdgf@fn-gelma微球上的细胞的免疫荧光图像；*p《0.05and****p《0.0001；f)微球招募椎间盘内源性祖/干细胞的示意图。
[0048]
图5为大鼠ivd退变模型的影像学评价；a)大鼠尾椎穿刺模型的建立和影像学考察示意图；b)椎间盘高度变化计算的示意图；c)术后4周和8周ivd的x射线图像；d)术后4周和8周ivd水含量的mri图像和热图；e)术后4周和8周ivd的dhi变化；(n＝6)；f)术后4周和8周水含量的信号密度变化；(n＝6)；*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；and****p《0.0001。
[0049]
图6为动物实验的组织学分析；a-b)术后4w、8w时ivds的h&e和番红固绿染色图像；术后4w(c)和8w(d)时按照四种分类评估的组织学单项评分；术后4w(e)和8w(f)的组织学总分；(n＝6)；**p《0.01and****p《0.0001。
具体实施方式
[0050]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述

技术实现要素：
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0051]
实施例1
[0052]
一、实验材料与方法
[0053]
1.明胶甲基丙烯酸酯(gelma)合成
[0054]
在60℃搅拌下，将20g a型明胶(猪皮来源)溶解在200ml碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(0.1m)中。将1ml或5ml的甲基丙烯酸酐滴加到明胶溶液中，在50℃下反应3小时，加入过量的pbs停止反应。将稀释后的混合溶液在37℃的去离子水中透析3天，然后将纯化的样品冷冻干燥3天，形成白色的gelma泡沫。将gelma泡沫溶解在氧化氘中，用1h nmr测量甲基丙烯酸酯基团的取代度。
[0055]
2.微流控装置的制作
[0056]
将32g的医用针头同轴插入27g针头来构建简易的微流控装置。水相从32g
[0057]
针注入，在27g针头的空腔部分钻了一个孔以便让油相流入入。其它所有的连接部分都用树脂胶水密封。
[0058]
3.微流控水凝胶微球的生成
[0059]
冻干的gelma泡沫在37℃下溶解在去离子水中，浓度为7.5％wt％。将含有0.25％苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸锂(lap)光引发剂的gelma溶液注入分散相通道中。连续相通道被引入含有5wt％span 80表面活性剂的石蜡油。控制内、外相流速比在为5:1至8:1变化，以调节微球大小在80-200μm变化。gelma流体受到油相的挤压，在同轴针的交界处裂开，形成液滴。随后在低温浴(1～6℃)中收集gelma液滴，并在紫外线照射下(365nm)进行交联。交联后的微球用乙醚和去离子水反复清洗以去除残余的石蜡油和表面活性剂。
[0060]
4.纤连蛋白-gelma微球的制备
[0061]
微球在75％乙醇中浸泡过夜消毒。然后将灭菌后的微球浸泡在无水乙醇中，在超净工作台上吹干，以去除表面残余的水分。然后加入纤连蛋白溶液(2μg/ml)，将微球与纤连蛋白在37℃下振荡孵育1小时。用pbs清洗微球以去除未结合的游离纤连蛋白。
[0062]
5.纤连蛋白-gelma微球的物理表征
[0063]
使用原子力显微镜纳米压痕测量微球的弹性模量，得到微球的应力-应变曲线，水凝胶微球的弹性模量通过计算0％到30％线性应变区域的斜率得出。使用流变仪测量水凝胶微球的储能模量。测量微球在纤连蛋白修饰前后弹性模量是否会发生变化。将微球冷冻干燥，在扫描电子显微镜下观察微观结构。
[0064]
6.髓核干细胞的分离和鉴定
[0065]
从大鼠尾椎椎间盘分离髓核，剪成碎片，在含有0.1％ii型胶原酶的dmem/f12培养基中消化2小时，以分离髓核细胞。分离的细胞在补充有10％胎牛血清的dmem/f12培养基中培养。在6孔板中重新播种细胞(密度为500个/ml)，血清浓度调至2％，直到形成干细胞克隆团。使用流式细胞术鉴定干细胞的表型，包括cd90,cd29,cd44和cd45。
[0066]
7.纤连蛋白-gelma微球调控髓核干细胞的骨架和分化
[0067]
将微球与细胞悬液(1
×
106/ml)在低粘附培养板上混合共培养。培养3天后，使用鬼笔环肽染液和yap抗体考察细胞的骨架形成和yap的表达水平。继续共培养14天，使用qpcr和免疫荧光染色考察细胞分化的水平，考察指标为col ii，acan，sox9和col i。
[0068]
8.血小板源生长因子-bb的负载和释放考察
[0069]
将1ml微球与1ml浓度为300ng/ml的血小板源生长因子-bb(重组人pdgf-bb，分子量24.8kda，sigma-aldrich)在4℃下孵育过夜。然后对微球进行低速离心(500rpm)，收集上清液。用pdgf-bb的elisa试剂盒测量上清液中未结合的生长因子浓度，以确定加载效率。对于释放实验，使用含0.1％ bsa的pbs作为释放介质，在37℃摇床中释放。在指定的时间点收集释放介质上清，测量上清液中释放的pdgf-bb浓度。
[0070]
9.生物相容性和体外募集
[0071]
将微球置于24孔板(0.4μm孔径)的上腔，而髓核干细胞(1
×
106/ml)则被种在下腔共培养。在第3天和第7天，用活死细胞染液考察细胞活性，为了评估细胞增殖，将细胞播种在96孔板上(1
×
104/ml)，加入微球共培养。在第1、2和5天加入cck8溶液孵育1小时，测量450nm处测的吸光度，考察细胞增殖。
[0072]
为了评估细胞体外迁移，微球被放置在上腔，而髓核干细胞被播种在下腔(0.4μm孔)。当细胞达到70-80％汇合度时，用200μl的移液枪枪头划一条直线划痕，替换成无血清培养基继续培养。在0、12和24小时观察划痕愈合情况。对于趋化实验，将微球置于下腔，而
细胞被播种在上腔(8μm孔)。上腔是无血清培养基，下腔则含有10％血清培养基。培养24小时后，收集小室，用4％多聚甲醛固定细胞。然后用0.5％结晶紫染色，用乙酸洗脱结晶紫，测量洗脱液在590nm处的吸光度，以量化细胞迁移的数量。为了评估微球的三维招募能力，将微球和细胞在播种在低粘附培养板上。24小时后，加入活细胞染液，观察微球表面的细胞。
[0073]
10.体内试验
[0074]
选择10周龄的大鼠，腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉后，用18g针头穿刺大鼠尾椎5-6、6-7、7-8和8-9节段的椎间盘。针头穿刺到椎间盘中心，然后旋转360
°
并停留30秒。随后，用1毫升注射器将10微升材料(pdgf@fn soft-lms、pdgf@fn stiff-h ms、游离pdgf-bb和pbs)注射到椎间盘。
[0075]
在术后4周和8周，使用x射线测量椎间盘高度，使用0.5t mri测量椎间盘的含水量。随后处死大鼠，收集椎间盘组织并在4℃下用4％多聚甲醛固定并脱钙。将样本嵌入石蜡中，切成5um的切片，并进行h&e、safranin o/fast green和aggrecan染色。
[0076]
二、实验结果
[0077]
1、可调机械性能的微球的制备与表征
[0078]
对通过同轴微流控技术制备的可调机械模量的gelma微球进行表征。1h nmr光谱结果如图1中a部分，在5.4ppm和5.6ppm处出现的新信号表明了ma的成功改性，通过比较2.9ppm处gelma相比于明胶峰值的减少来计算甲基丙烯酸化程度，最终确定所合成gelma的取代度分别为20％和100％。
[0079]
为了制备微流控微球，由不同甲基丙烯酸度的7.5％ gelma前体溶液构成的水相和油相被分别注入同轴微流控装置中以形成油包水乳液的水凝胶液滴，随后通过uv交联固化。所制备的微球表现出良好的尺寸分布(系数变化《5％)，平均直径小于150μm，能够进行注射给药(图1中b部分，i-ii)。
[0080]
原子力显微镜的结果显示，通过调控交联条件成功制作了弹性模量为1kpa(命名为ultrasoft)、2kpa(命名为soft)和10kpa(命名为stiff)的微球(图1中c部分，i-ii；图1中d部分)。
[0081]
接下来，纤连蛋白以低密度和高密度的形式修饰在微球上，纤连蛋白的浓度分别设置为2μg/ml(命名为l)和10μg/ml(命名为h)。通过与不同浓度的纤连蛋白结合，微球的配体密度可以轻松调整(图1中e部分，i)。经纤连蛋白结合的gelma的储能模量不会受纤连蛋白修饰的影响。
[0082]
使用fitc标记的纤连蛋白抗体来观察fn涂层，证明了gelma和纤连蛋白之间的紧密结合，而在未修饰的gelma微球上没有观察到荧光信号(图1中e部分，ii)。各组的详细命名方案在图1中e部分，iii中总结。同时，荧光强度随着纤维蛋白密度的增加而增加，且在同一密度下，不同弹性模量的gelma微球与纤维蛋白的结合没有显著差异(图1中f部分)。六种fn-gelma微球的sem图像显示在图1中g部分。可以观察到，所有组的微球都表现出光滑的表面和多孔的微结构，具有较低模量的微球还表现出更大的孔径。此外，当微球与纤连蛋白结合后，可以看到盐晶体在微球的表面形成。
[0083]
2、髓核衍生干细胞的分离和表征
[0084]
髓核干细胞(npscs)被用作代表性的ivd祖/干细胞用于后续实验。用单克隆方法从大鼠尾椎间盘的髓核组织中提取npscs，髓核衍生的细胞以非常低的密度播种，其中有一
部分细胞能附着在培养板上，然后进行快速分裂。经过一周的培养，单细胞能够形成细胞克隆团。
[0085]
观察发现所提取的细胞呈现出间充质干细胞特有的纺锤形，并以平行或涡流模式生长。相比之下，髓核细胞表现出多边形的形态和随机的生长模式。收集细胞克隆团，并使用流式细胞分析来检查其表面标志物的表达。结果显示，npscs对典型的msc标志物cd29、cd44和cd90呈高度阳性，而对造血干细胞标志物cd45呈阴性。相比之下，髓核细胞对msc标志物的表达水平较低(《50％)。这些结果表明高度纯化的npscs成功地从髓核衍生细胞中分离出来。
[0086]
3、微球训练指导干细胞分化的评估
[0087]
首先关注微球的机械训练对于npscs细胞骨架形成的影响(图2中a部分)。npscs在微球上培养了3天，所有材料分组都支持细胞的粘附和扩散，以及肌动蛋白丝的聚集(图2中b部分)。此外，肌动蛋白应力纤维的形成被证明能由微球的弹性模量和配体密度调节。与其他组相比，在ultrasoft-l微球上培养的npscs表现出明显更宽的肌动蛋白前缘。同时可以观察到肌动蛋白的组装主要在细胞的前缘产生，表明纤维网络主要沿干细胞的质膜聚合。通过计算肌动蛋白在细胞内/皮层免疫荧光密度的比值，可以发现相对柔软的基质与低ecm配体密度可以保持f-actin沿细胞膜边界的低表达,ultrasoft组和soft-l内/皮层荧光比没有统计学差异(图2中c部分)。
[0088]
通常情况下，如果肌动蛋白内/皮层比率较低，则表明间充质干细胞向脂肪和软骨分化，而肌动蛋白在整个细胞质内的聚合和纤维延伸则与成骨和纤维环细胞的分化高度相关。与软骨细胞类似，肌动蛋白倾向于聚集在髓核细胞的外围。因此，在ultrasoft组和soft-l组上培养的npscs表现出分化成髓核样细胞的潜力。
[0089]
此外，还调查了细胞的肌动蛋白丝取向。当在ultrasoft-l微球上培养时，npscs表现出肌动蛋白纤维的随机取向，而随着微球配体密度的增加，可以观察到f-actin的有序定向排列。类似的现象同样能在soft微球中观察到。
[0090]
f-actin的弥散分布与细胞骨架的完整性降低有关，这表明在ultrasoft-l和soft-l微球上产生了更小的细胞骨架张力。此外，随着弹性模量和配体密度的增加，肌动蛋白纤维的平均直径明显增加(图2中d部分)，这也能证明细胞产生了更大的骨架张力。
[0091]
yap的活性依赖于肌动蛋白产生的骨架张力来调节干细胞的命运(图3中a部分)。接下来，考察了由肌动蛋白纤维产生的细胞骨架张力对yap核易位的影响。如图3中c部分所示，yap的细胞质定位是由微球的弹性模量和配体密度操控的。无论ecm密度如何，在ultrasoft微球中都可以观察到yap在细胞质中的保留。有趣的是，当改变soft-l微球的配体密度时，yap发生了明显的易位。此外，强化的yap核定位趋势与微球弹性模量和ecm配体密度的持续增加高度相关(图3中d部分)。
[0092]
在本实验中，soft-h组和stiff组被证明足以支持髓核干细胞中yap的核定位，这可能会阻碍干细胞向髓核样细胞分化，该结果与现有研究结果相似。
[0093]
为了进一步验证适当的机械线索可以指导干细胞的髓核样分化，评估了npsc在不同组微球上培养时的髓核特异性基因表达。所有组别均在完全培养基中培养，没有添加软骨诱导分化剂。col ii的表达水平通过免疫荧光染色进行了可视化(图3中c部分)。在soft-l组观察到最高表达的col ii，而荧光强度随配体密度的增加而轻微降低(图3中e部分)。特
别是，在ultrasoft和stiff微球组中仅能观察到极低的荧光信号。
[0094]
接下来，通过qpcr考察sox9,acan,ncam-1和col i的mrna水平。选择sox9,acan和ncam-1作为髓核特异性基因，而col i则被认为是一种纤维化的标志物。在平皿上培养的npscs被作为对照组。需要指出的是，传统的聚苯乙烯培养板的弹性模量约为1gpa，远高于大多数的自然组织。如图3中f部分所示，在ultrasoft微球组中没有观察到明显的np基因上调，无论纤连蛋白的密度如何改变。这与col ii染色的结果是一致的。因此，在ultrasoft微球上培养的npscs总是产生较少的np基因，这种现象可能归因于它更倾向于脂肪分化谱系。在所有的微球组中，soft-l组呈现出最高的np样分化潜力。有趣的是，对于soft和stiff微球组，随着配体密度的增加，可以观察到np基因表达的明显下降。这与前面实验中细胞骨架形成和yap定位的结果一致，表明过度的细胞骨架张力将可能阻碍npsc向np样分化。col i的表达水平也证明，纤维化趋势与基质模量高度相关。与对照组相比，所有微球组都表现出col i水平的下调。此外，col i的表达可以通过增加弹性模量和ecm密度来强化。
[0095]
ecm重建的过程涉及ecm成分的降解和合成，因此接下来研究了细胞分化早期阶段分解代谢基因的表达水平，包括mmps、adamts和timps(图3中g部分)。除了ultrasoft组，大多数组都可以看到ecm重塑酶的上调。除了ultrasoft组之外，其它实验组中都可以观察到adamts 5的上调。在ultrasoft组中，mmp13和adamts 4的表达没有明显增加，说明该模量范围更有利于脂肪生成。简而言之，npscs中必要分解代谢基因的表达验证了微球对细胞的分化调节能力。
[0096]
基于本发明的目的是修复髓核，因此得出的结论是：soft-l微球是椎间盘干细胞训练的合适备选。另一方面，其他微球组可以根据组织的特点，用于治疗其他的各种疾病。例如，stiff微球有望用作修复纤维环损伤的训练平台。
[0097]
4、构建细胞募集微球
[0098]
基于之前的结果，soft-l微球被用于进行后续实验。通过在fn-gelma微球上负载pdgf-bb来制备细胞募集微球(图4中a部分)，对pdgf-bb的浓度进行优化，期望微球在体内形成合成生态位来招募内源性祖/干细胞定植。fn-gelma微球和未修饰的gelma微球上pdgf的负载效率约为97.50％和95.39％。
[0099]
在释放实验中，相比于gelma微球，fn-gelma微球支持更慢的pdgf释放，在28天后8.67％的pdgf-bb从微球中释放。相比之下，gelma微球在任何时间点都释放出更多的pdgf，到第28天一共释放14.06％(图4中b部分)。更高的负载能力和更长的释放周期表明，fn强化了gelma微球与pdgf-bb的结合，这是因为fn的12fniii-13fniii-14fniii片段提供的肝素结合位点可以高效结合各种生长因子。
[0100]
体外生物相容性实验显示pdgf@fn-gelma微球可以保持npscs的高活力，活/死染色图像中观察到极少的死细胞。此外，cck8结果表明，pdgf-bb的结合可以促进细胞增殖。因此，鉴于祖细胞的数量十分有限，内源性再生一直充满了挑战，而本发明提出的合成生态位可以在细胞分化之前促进内源性细胞的扩增。
[0101]
为了评估微球的募集能力，用transwell系统构建了一个模拟干细胞龛内细胞迁移的共培养系统。在划痕实验中，微球被放置在上腔室，而npscs被播种在下腔室(图4中c部分，i)。如图4中c部分，ii所示，12小时和48小时后，所有组的迁移面积都有所增加。在pdgf@fn-gelma组中观察到最高的划痕愈合率，48小时后达到81.5％(图4中c部分，iii)。在
transwell迁移试验中，微球被放置在下腔室，npscs被种在上腔室(图4中d部分，i)。与划痕实验的结果不同，fn-gelma微球组和对照组在24h后没有显著差异。然而，在pdfd@fn-gelma微球组中观察到明显增强的细胞迁移(图4中d部分,ii-iii)。
[0102]
为了进一步研究微球招募干细胞的能力，将微球和npscs接种在非粘附的培养板上培养24h，然后使用钙黄绿素am染色(图4中e部分，i)。虽然在gelma和fn-gelma组中也能观察到一些细胞粘附到微球表面，但在pdgf@fn-gelma微球上检测到了大量细胞并形成细胞聚集体(图4中e部分，ii)。以上结果表明，pdgf-bb从微球中的可控释放促进了npscs的迁移。
[0103]
因此，本发明制备的pdfd@fn-gelma微球可用于招募驻留在髓核、纤维环和软骨终板的祖/干细胞到受损区域。
[0104]
5、微球训练体内ivds再生
[0105]
为了进一步研究微球的机械生物训练对体内髓核再生的治疗效果，使用18g针建立了大鼠针刺椎间盘退变模型，并在术后4周和8周记录了放射学评价(图5中a部分)。椎间盘高度指数(dhi)由大鼠尾部x光影像测量得到，它反映了椎间盘空间的变化(图5中b部分)。大鼠分别使用微球和游离的pdgf-bb治疗。为了强调机械传导在体内再生中的重要性，stiff-h微球(简写为stiff ms)也负载相同剂量的pdgf-bb用于治疗，以便与soft-l微球(简写为soft ms)进行对比，因为它们在之前的体外分化实验中表现出最大的差异。术后4周，x光影像显示软微球组的dhi变化与对照组相比没有统计学差异，但其他组的idh却有统计学意义上的下降(图5中c和e部分)。随后，在8周时，软微球组最大程度地维持了dhi水平，而其他治疗组则经历了椎间盘空间的快速塌陷。椎间盘含有70-80％的水，因此磁共振成像(mri)被用来测量水含量的变化，以反映ivd的退变进程。所有组ivd的信号强度在4周和8周后都有所下降，并且可以看到用软微球治疗可以最大程度维持椎间盘的含水量(图5中d和f部分)。这些结果表明，通过合适的机械信号对细胞训练可以进一步促进髓核再生，同时保持椎间盘的结构完整性，减少水含量的损失。
[0106]
术后4周和8周进行了组织学分析。he染色显示，软微球组的椎间盘结构保持完整，术后4和8周时髓核和纤维环有着清晰的边界(图6中a和c部分)。此外，在软微球组观察到最大的髓核面积。然而，在其他治疗组中，可以观察到纤维环和髓核之间的边界被严重中断。safranin o/fast green和免疫组化染色可以用来反映蛋白聚糖的表达。尽管第8周时所有组的染色强度均轻微低于第4周，但是在治疗组中，软微球组在任一时间点均拥有最高的蛋白多糖表达(图6中b和d部分)。
[0107]
根据退行性变化的四个分类来进行组织学评分。详细的分级表在图6中e和f部分可视化，分数越高代表退变越严重。图6中g和h部分展示了术后4周和8周的整体组织学评分，表明软微球组的组织学评分始终都显著低于其他的治疗组。此外，与pdgf组相比，用硬微球治疗也能延缓椎间盘退变，这可能是由于微球中生长因子的控释。然而，由于缺乏适当的机械训练，导致硬凝胶无法实现内源性再生。
[0108]
上述结果表明，soft ms组的机械生物信号转导在体内具有增强的再生效果。

技术特征：
1.一种兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用明胶和甲基丙烯酸酐合成可光交联的明胶甲基丙烯酸酯预聚物；(2)通过微流控方法制备明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球；(3)将纤连蛋白溶液与步骤(2)所得明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球在恒温水浴中振荡孵育，得到纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球；(4)将血小板源生长因子-bb结合到步骤(3)所得纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球上，得到兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将明胶甲基丙烯酸酯预聚物和光引发剂的混合溶液注入微流控通道，在油相的剪切下形成单分散的水凝胶液滴，而后使用365nm蓝光交联液滴，形成固化的水凝胶微球即得明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球中明胶甲基丙烯酸酯预聚物的浓度为7.5wt％，明胶甲基丙烯酸酯材料中光基团甲基丙烯酸酯的取代度为20％。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述纤连蛋白溶液的浓度为2μg/ml，所述纤连蛋白与明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球的重量比为1:3。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中是于37℃下振荡孵育1小时。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述血小板源生长因子-bb和纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯凝胶微球的质量之比为1:200000～250000。7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中是将稀释后的血小板源生长因子-bb溶液与纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球于4℃下振荡孵育12小时。8.一种如权利要求1-7任一项所述方法制备得到的兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球，其特征在于，所述水凝胶微球的弹性模量为2kpa；所述水凝胶微球的平均粒径为80-200μm。9.权利要求8所述的水凝胶微球在制备治疗椎间盘退变的植入材料中的应用。10.权利要求8所述的水凝胶微球在制备治疗椎间盘内源性再生的药物中的应用。

技术总结
一种兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球及其制备方法与应用，该水凝胶微球的制备方法包括：(1)使用明胶和甲基丙烯酸酐合成可光交联的明胶甲基丙烯酸酯预聚物；(2)通过微流控装置制备GelMA水凝胶；(3)将纤连蛋白连接到步骤(2)所得GelMA水凝胶上，得到纤连蛋白修饰的GelMA水凝胶；(4)将血小板源生长因子-BB结合到步骤(3)所得纤连蛋白修饰的GelMA水凝胶上，得到兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球。本发明制备得到的水凝胶解决了现有的水凝胶材料存在的需要较低模量才能更好促进髓核干细胞的分化，但在植入体内应用时又需要较高的力学强度来保证其使用性能之间的矛盾，不仅实现了很好的分化效果，用水凝胶微球的模量得到了提高。得到了提高。得到了提高。


技术研发人员：张煜辉 陈皓 火海钟 崔文国 陈泽昊 吕振东
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属仁济医院
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/1