一种用于半胱氨酸和microRNA生物标志物的检测方法及应用

一种用于半胱氨酸和microrna生物标志物的检测方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种半胱氨酸和microrna含量检测方法。


背景技术：

2.半胱氨酸(cys)是一种生物体内重要的氨基酸，其对人体正常的生理功能非常重要，参与细胞的还原过程和体内肽和蛋白质的合成，还可以用于氨基酸类解毒药。生物体内cys的含量异常常与多种疾病的发生和发展密切相关。cys的缺乏会导致生物体造血功能下降，产生水肿、肝损伤等不良影响，但过量的cys也会导致多种神经系统疾病的发生，如阿尔茨海默氏病。因此，cys含量的准确和快速测定对于相关疾病的早期诊断及预后评估非常重要。
3.microrna(mirna)是一类包含在生物体内的非编码rna，通常由20-24个核苷酸组成，在生物体内参与基因表达的调节及多个生理过程的控制，如细胞分化调节、增殖、代谢、凋亡以及免疫等过程。mirna的异常表达与多种生理功能异常或疾病的发生发展有着密切的联系。当前，多种mirna已被用于疾病早期诊断的生物标志物，如mir-21、mir-26a、mir-27a、mir-122、mir-192、mir-223、mir-801等。在多种癌症病变组织中，均发现不同种mirna过度表达的现象，如胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等。
4.当前，已有多种方法应用于cys和micro rna的含量测定，如高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学法、质谱法和荧光光谱法等。上述仪器分析法不仅需要昂贵的仪器，还需要复杂的样品前处理及准备工作，而荧光光谱法具有灵敏度高，样品预处理简单等优势，有望应用于实际样品中cys和micro rna的快速检测。


技术实现要素：

5.因此，为了克服现有技术手段中存在的缺点，如测试时间较长、误差较大、测试过程繁琐等问题，本发明要解决的技术问题是，开发一种简便、快速且灵敏度高的生物传感方法，用于半胱氨酸和mirna的检测。
6.本发明的技术方案是，
7.一种用于半胱氨酸的检测的dna@auncs的合成方法，包括dna@auncs的合成：
8.a、将链长为15-30的聚核苷酸配制成10-200μm的储备液，按照3-4:1-2体积比与haucl4溶液混合，搅拌混匀，得到混合溶液；
9.b、向混合溶液中加入100-400mm柠檬酸钠溶液，并混合均匀；然后将所得溶液在室温黑暗中放置12-36h以促进auncs的形成，得到dna@auncs。
10.合成后的dna@auncs在使用前存储在4℃下。
11.根据本发明的一种用于半胱氨酸检测的dna@auncs的合成方法，优选的是，步骤a所述聚核苷酸溶液和氯金酸溶液的体积比是3-4:1；步骤a所述搅拌为磁力搅拌。优选的是，步骤a所述的氯金酸溶液的浓度是0.5-5mm。
12.根据本发明的一种用于半胱氨酸检测的dna@auncs的合成方法，优选的是，步骤b所述柠檬酸钠溶液浓度为100-200mm。
13.本发明还提供了上述方法得到的dna@auncs体系在cys定量检测方面的应用，
14.a.将浓度为50nm-5μm的cys溶液加入至dna@auncs荧光探针中，混合均匀；然后将混合溶液置于36-38℃水浴中孵育0.5-1.5h；最后测定所得溶液在400～750nm范围内的荧光发射光谱；
15.b.用荧光法检测不同浓度的cys标准溶液所对应的荧光强度f，以系列cys标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(f-f0)/f0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程；
16.c.将含有cys的实际样品溶液加入至dna@auncs荧光探针中，测定其在450nm下的荧光强度，将强度值代入至工作曲线，计算得到cys的浓度。步骤a中，测定溶液的“溶液在400～750nm范围内的荧光发射光谱”，指的是400～750nm范围内光谱图形。步骤c中，“测定其在450nm下的荧光强度”，指的是具体强度数值。
17.步骤a中的dna@auncs荧光探针即为上述制备得到的dna@auncs。
18.在上述的应用中，优选的是，加入cys后，dna@auncs的荧光强度降低。
19.本发明还提供了一种用于mirna检测的dna@auncs的合成方法，包括dna@auncs的合成：
20.a、将包含聚核苷酸和相应mirna互补链的dna配制成10-200μm的储备液，按照3-4:1-2体积比与haucl4溶液混合，搅拌混匀，得到混合溶液；
21.b、向混合溶液中加入100-400mm柠檬酸钠溶液，并混合均匀；然后将所得溶液在室温黑暗中放置12-36h以促进auncs的形成，得到dna@auncs。合成后的dna@auncs在使用前存储在4℃下。
22.根据本发明的一种用于mirna检测的dna@auncs的合成方法，优选的是，步骤a所述谷胱甘肽溶液和氯金酸溶液的体积比是3-4:1；步骤a所述搅拌为磁力搅拌。优选的是，步骤a所述的氯金酸溶液浓度为0.5-5mm。haucl4溶液浓度范围为0.5-5mm。
23.根据本发明的的一种用于mirna检测的dna@auncs的合成方法，优选的是，步骤b所述柠檬酸钠溶液浓度为100-200mm。
24.本发明还提供了上述方法得到的dna@auncs体系在mirna定量检测方面的应用，
25.a.将浓度为5nm-5μm的mirna溶液加入至dna@auncs荧光探针中，混合均匀；然后将混合溶液置于36-38℃水浴中孵育0.5-1.5h；最后测定所得溶液在400～750nm范围内的荧光发射光谱；
26.b.用荧光法检测不同浓度的mirna标准溶液所对应的荧光强度f，以系列mirna标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(f-f0)/f0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程；
27.c.将含有mirna的实际样品溶液加入至dna@auncs荧光探针中，测定其在450nm下的荧光强度，将强度值代入至工作曲线，计算得到mirna的浓度。
28.在上述应用中，优选的是，加入mirna后，dna@auncs的荧光强度降低。
29.本发明的有益效果是：
30.(1)本发明开发的聚核苷酸为模板的auncs对cys具有较高的选择性，cys的巯基官
能团与au之间存在配位作用形成au-s键使得体系荧光猝灭。基于此原理，构建了一种dna@auncs传感系统，该体系可用于cys的浓度检测。
31.(2)本发明开发的dna@auncs对mirna具有较高的选择性，mirna与dna中的互补序列结合，使得体系荧光增强。基于此原理，构建了一种dna@auncs传感系统，该体系可用于mirna的浓度检测。
附图说明
32.图1：cys的检测机理示意图。(cys的巯基官能团与au之间存在配位作用形成au-s键使得体系荧光猝灭。)
33.图2：以系列cys标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(f-f0)/f0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线。图2a:加入不同浓度半胱氨酸后体系荧光光谱图；图2b:以系列cys标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(f-f0)/f0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线。
34.图3：mirna的检测机理示意图。(mirna与dna中的互补序列结合，使得体系荧光增强。)
35.图4a:加入不同浓度mirna后体系荧光光谱图；图4b:以系列mirna标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(f-f0)/f0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线。
具体实施方式
36.实施例1：用于cys检测的金纳米簇的制备
37.将聚核苷酸polyc20配制成100μm的储备液，按照4:1体积比与haucl4混合，搅拌混匀，得到混合溶液。向混合溶液中加入100mm柠檬酸钠溶液，并混合均匀。样品在室温黑暗中放置24h以促进auncs的形成。合成后的polyc20@auncs在使用前存储在4℃下。
38.实施例2：金纳米簇用于cys的定量检测
39.将浓度为50nm-5μm的cys溶液加入至polyc20@auncs荧光探针中，混合均匀；然后将混合溶液置于37℃金属浴中孵育1h；最后测定所得溶液在400～750nm范围内的荧光发射光谱。用荧光法检测不同浓度的mirna标准溶液所对应的荧光强度f，以系列cys标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(f-f0)/f0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程。将含有cys的实际样品溶液加入至polyc20@auncs荧光探针中，测定其在450nm下的荧光强度，将强度值带入至工作曲线，计算得到cys的浓度。
40.实施例3：用于mirna-21检测的金纳米簇的制备
41.将序列中包含聚核苷酸polyc20和相应mirna-21互补链的dna-21(序列为ccc ccc ccc ccc ccc ccc cct caa cat cag tct gat aag cta)配制成100μm的储备液，按照4:1体积比与haucl4混合，搅拌混匀，得到混合溶液。向混合溶液中加入100mm柠檬酸钠溶液，并混合均匀。样品在室温黑暗中放置24h以促进auncs的形成。合成后的dna-21@auncs在使用前存储在4℃下。
42.实施例4：dna-21@auncs用于mirna-21的定量检测
43.将浓度为5nm-5μm的mirna溶液加入至dna@auncs荧光探针中，混合均匀；然后将混合溶液置于37℃金属浴中孵育1h；最后测定所得溶液在400～750nm范围内的荧光发射光
谱。用荧光法检测不同浓度的mirna标准溶液所对应的荧光强度f，以系列mirna-21标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(f-f0)/f0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程。将含有mirna-21的实际样品溶液加入至dna-21@auncs荧光探针中，测定其在450nm下的荧光强度，将强度值带入至工作曲线，计算得到mirna-21的浓度。

技术特征：
1.一种用于半胱氨酸的检测的dna@auncs的合成方法，其特征在于：包括dna@auncs的合成：a、将链长为15-30的聚核苷酸配制成10-200μm的储备液，按照3-4:1-2体积比与haucl4溶液混合，搅拌混匀，得到混合溶液；b、向混合溶液中加入100-400mm柠檬酸钠溶液，并混合均匀；然后将所得溶液在室温黑暗中放置12-36h以促进auncs的形成，得到dna@auncs。2.根据权利要求1所述的一种用于半胱氨酸检测的dna@auncs的合成方法，其特征在于：步骤a所述聚核苷酸溶液和氯金酸溶液的体积比是3-4:1；步骤a所述搅拌为磁力搅拌；步骤a所述的氯金酸溶液的浓度是0.5-5mm。3.根据权利要求1所述的一种用于半胱氨酸检测的dna@auncs的合成方法，其特征在于：步骤b所述柠檬酸钠溶液浓度为100-200mm。4.权利要求1所述方法得到的dna@auncs体系在cys定量检测方面的应用，其特征在于：a.将浓度为50nm-5μm的cys溶液加入至dna@auncs荧光探针中，混合均匀；然后将混合溶液置于36-38℃水浴中孵育0.5-1.5h；最后测定所得溶液在400～750nm范围内的荧光发射光谱；b.用荧光法检测不同浓度的cys标准溶液所对应的荧光强度f，以系列cys标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(f-f0)/f0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程；c.将含有cys的实际样品溶液加入至dna@auncs荧光探针中，测定其在450nm下的荧光强度，将强度值代入至工作曲线，计算得到cys的浓度。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：加入cys后，dna@auncs的荧光强度降低。6.一种用于mirna检测的dna@auncs的合成方法，其特征在于：包括dna@auncs的合成：a、将包含聚核苷酸和相应mirna互补链的dna配制成10-200μm的储备液，按照3-4:1-2体积比与haucl4溶液混合，搅拌混匀，得到混合溶液；b、向混合溶液中加入100-400mm柠檬酸钠溶液，并混合均匀；然后将所得溶液在室温黑暗中放置12-36h以促进auncs的形成，得到dna@auncs。7.根据权利要求6所述的一种用于mirna检测的dna@auncs的合成方法，其特征在于：步骤a所述储备液和氯金酸溶液的体积比是3-4:1；步骤a所述搅拌为磁力搅拌；步骤a所述的氯金酸溶液浓度为0.5-5mm。8.根据权利要求6所述的一种用于mirna检测的dna@auncs的合成方法，其特征在于：步骤b所述柠檬酸钠溶液浓度为100-200mm。9.权利要求6所述方法得到的dna@auncs体系在mirna定量检测方面的应用，其特征在于：a.将浓度为5nm-5μm的mirna溶液加入至dna@auncs荧光探针中，混合均匀；然后将混合溶液置于36-38℃水浴中孵育0.5-1.5h；最后测定所得溶液在400～750nm范围内的荧光发射光谱；b.用荧光法检测不同浓度的mirna标准溶液所对应的荧光强度f，以系列mirna标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(f-f0)/f0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程；
c.将含有mirna的实际样品溶液加入至dna@auncs荧光探针中，测定其在450nm下的荧光强度，将强度值代入至工作曲线，计算得到mirna的浓度。10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：加入mirna后，dna@auncs的荧光强度降低。

技术总结
本发明公开了一种用于半胱氨酸和microRNA的金纳米簇(AuNCs)荧光探针检测方法，分别制备适合于两者的DNA@AuNCs，将Cys和miRNA溶液分别加入至DNA@AuNCs荧光探针中，混合均匀。将混合溶液置于36-38℃金属浴中孵育0.5-1.5h。测定所得溶液在400～750nm范围内的荧光发射光谱。用荧光法检测不同浓度的Cys和miRNA标准溶液所对应的荧光强度F，以系列Cys和miRNA标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(F-F0)/F0为纵坐标，绘制浓度-荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程。将含有Cys或miRNA的样品溶液加入荧光探针中，测定其在特定波长下的荧光强度，将强度值代入工作曲线，计算得到Cys或miRNA的浓度。本发明解决了现有方法耗时较长、误差较大、测试方法繁琐等问题，是一种简便、快速、高灵敏度的检测方法。高灵敏度的检测方法。


技术研发人员：于快 周燕 王烨菲 曹君如 叶陈对 章弘扬 胡坪 张敏
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/1