一种纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法

1.本发明属于植物快繁技术领域，更具体地说，涉及一种纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法。


背景技术：

2.木兰科，鹅掌楸属包含鹅掌楸和北美鹅掌楸两个种，杂交鹅掌楸是以二者为亲本通过人工控制授粉获得的杂交种，在生长发育和抗逆性上具有显著的杂种优势。2003年，南京林业大学陈金慧教授创建的杂交鹅掌楸体胚发生与植株再生技术体系推动了杂交鹅掌楸优异种质的规模化生产和推广应用。而杂交鹅掌楸四倍体品种“司金香”则表现出比二倍体更强的光合能力，其树体高大、叶片宽厚、生物量显著增加，同时具有杂种优势和倍性优势。创制优异四倍体种质或能实现杂交鹅掌楸性状的直接改良，而通过四倍体与二倍体杂交创制三倍体种质也具有重要研究意义。因此，建立高效稳定的杂交鹅掌楸四倍体诱导技术体系势在必行。
3.目前，杂交鹅掌楸四倍体的诱导方法以秋水仙素处理胚性愈伤块为主，该方法虽能诱变成功，但体胚发生效率和四倍体诱导率相对较低，仍需进一步优化和完善。通过建立胚性愈伤液体培养悬浮系，并在此基础上施加秋水仙素诱变处理有望解决以上问题。该方法可灵活控制愈伤和培养基质的比例，便于准确摸索秋水仙素的处理周期、稳定诱变效果，且相较于秋水仙素处理愈伤块后进行体胚诱导的方法，液体培养处理获得的胚性细胞容易控制萌发密度，具有更好的体胚发生效果，能保证体胚和再生植株的足量供应，便于染色体加倍材料的筛选和收获。因此，该方法具有较高的应用性和创新性，且在鹅掌楸属的多倍体育种研究中未见报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，满足纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快速繁殖需求。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法：将杂交鹅掌楸胚性愈伤接种到液体愈伤增殖培养基中进行预培养，建立愈伤预培养悬浮系；将预培养后的悬浮细胞接种到含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基中诱导悬浮细胞染色体加倍，建立秋水仙素处理悬浮系；将秋水仙素处理后的悬浮细胞接种到固体体胚诱导培养基中进行体胚诱导，得到四倍体子叶胚；将四倍体子叶胚接种至植株再生培养基中进行植株再生培养，得到纯合同源四倍体杂交鹅掌楸。
7.所述的液体愈伤增殖培养基配方为3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+0.2mg/l ba+0.5g/l ch+30g/l蔗糖，ph 5.75。
8.所述的杂交鹅掌楸胚性愈伤与液体愈伤增殖培养基的体积比为1∶9。
9.所述的含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基配方为3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+
0.2mg/l ba+0.5g/l ch+30g/l蔗糖+0.1-0.3％秋水仙素，ph 5.75。
10.所述的含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基配方优选为3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+0.2mg/l ba+0.5g/l ch+30g/l蔗糖+0.2％秋水仙素，ph 5.75。
11.所述的固体体胚诱导培养基配方为3/4ms+5mg/l vc+0.2g/l lh+2g/l活性炭+40g/l蔗糖+2.5g/l水晶洋菜，ph 5.75。
12.所述的植株再生培养基配方为1/2ms+5mg/l vc+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.75。
13.所述的诱导悬浮细胞染色体加倍的培养条件为将预培养7d后的悬浮细胞接种到含0.2％秋水仙素的液体愈伤增殖培养基中诱导20d。
14.所述的纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，具体步骤包括：
15.1)以杂交鹅掌楸胚性愈伤与液体愈伤增殖培养基的体积比为1∶9的比例，建立50ml愈伤预培养悬浮系，将其置于摇床暗环境下以95rpm的转速增殖培养7d；
16.2)将预培养7d的50ml悬浮系手动摇匀，吸取200-1000μl悬浮细胞吹打至25ml锥形瓶内，静置至细胞沉淀后除去上清液，补充5ml含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基，建立5ml的秋水仙素处理悬浮系，将其置于摇床暗环境下以95rpm的转速增殖培养10-30d，得到秋水仙素处理悬浮系；
17.3)将秋水仙素处理悬浮系用液体愈伤增殖培养基稀释至原浓度的1/3，迅速摇匀后用移液枪吸取1ml悬浮细胞吹打在滤纸上，待棉花充分吸尽滤纸上的水分后，将滤纸轻轻地转移到上述固体体胚诱导培养基平板上，封口后转23℃暗培养10-25d，得到四倍体子叶胚；
18.4)将四倍体子叶胚接种至植株再生培养基上，23℃暗培养2周，然后转光照培养1-2周，光照强度为15μmol
·
m-2
·
s-1
，光照时间为16h/d，培养温度为24℃，得到纯合同源四倍体杂交鹅掌楸。
19.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
20.1)本发明的所有处理组合中，未施加秋水仙素的悬浮系经体胚诱导未能获得四倍体；0.1％的秋水仙素处理20d和30d分别获得了4.0％和5.9％的四倍体，该浓度为诱变的有效浓度，但四倍体诱导率较低；0.2％的秋水仙素处理10d、20d、30d对应的四倍体诱导率分别为9.6％、23.1％、8.6％，其中最优的处理组合为0.2％/20d；在0.3％秋水仙素的处理组中，仅处理10d时获得了2.2％的四倍体，处理20d时体胚诱导率大大降低，处理30d时无法获得正常体胚，暗示该浓度过高或处理周期过长；0.2％的秋水仙素处理20d是本方法最佳的诱变处理组合。
21.2)本发明的四倍体子叶胚含76条染色体，具有明显的“巨大性”特征，在诱变后获得的体胚中容易发现和筛选；而二倍体子叶胚含38条染色体。
22.3)本发明的四倍体根明显加粗、短壮，而二倍体根较细长；将四倍体小植株继代接种至新鲜的再生培养基上，待其真叶抽出后45-60d后四倍体较二倍体真叶更厚更绿，茎粗壮、叶柄短粗、根加粗。
附图说明
23.图1为16-hs
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ga基因型杂交鹅掌楸胚性愈伤组织图(a、b)，预培养悬浮系图(c)和悬浮系内的细胞类型图(d、e)；
24.图2是0.2％/20d处理的诱变悬浮系图(a)和诱变后的胚性细胞分化发育图(b)以及诱导获得的体胚图(c)；
25.图3是未经秋水仙素处理和经过处理后诱导获得的16-hs
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ga基因型子叶胚形态比较图(a、b)及倍性鉴定图(c-f)；
26.图4是16-hs
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ga基因型子叶胚经诱导获得的黄化苗图(a)、光照苗图(b)、二倍体苗图(c)及疑似四倍体苗图(d)；
27.图5是真叶抽出后45天的16-hs
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ga基因型二倍体和四倍体植株(a、b、e、f)及倍性鉴定结果图(g、h)，移栽后4个月的二倍体和四倍体幼苗(c、d)及倍性鉴定结果图(i)；
28.图6是实施例2中杂交鹅掌楸良种“南林金森e1号”胚性细胞未经秋水仙素处理和经过处理后的植株再生情况比较图(a-1，框选部分为“疑似四倍体黄化苗”)、二倍体和四倍体黄化苗形态比较(m)及倍性鉴定结果图(n、o)；
29.图7是实施例2中杂交鹅掌楸良种“南林金森e1号”二倍体和四倍体植株真叶抽出后的形态比较图。
具体实施方式
30.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
31.以下实施例中所用的培养基如下所示：
32.液体愈伤增殖培养基：3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+0.2mg/l ba+0.5g/l ch+30g/l蔗糖，ph 5.75。
33.含0.1％(w/v)秋水仙素的液体愈伤增殖培养基：3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+0.2mg/l ba+0.5g/l,ch+30g/l蔗糖+0.1％秋水仙素，ph 5.75。
34.含0.2％(w/v)秋水仙素的液体愈伤增殖培养基：3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+0.2mg/l ba+0.5g/l ch+30g/l蔗糖+0.2％秋水仙素，ph 5.75。
35.含0.3％(w/v)秋水仙素的液体愈伤增殖培养基：3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+0.2mg/l ba+0.5g/l ch+30g/l蔗糖+0.3％秋水仙素，ph 5.75。
36.固体体胚诱导培养基：3/4ms+5mg/l vc+0.2g/l lh+2g/l活性炭+40g/l蔗糖+2.5g/l水晶洋菜，ph 5.75。
37.植株再生培养基：1/2ms+5mg/l vc+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.75。
38.实施例1
39.1、本实施例中使用的材料16-hs
×
ga基因型杂交鹅掌楸为[chen t，yang d，fan r，et al.γ-aminobutyric acid a novel candidate for rapid induction in somatic embryogenesis of liriodendron hybrid[j].plant growth regulation，2022(3).]公开的材料16-6301(目前已对该材料名称进行系统规范命名，16-hs
×
ga基因型即为该材料的系统名称)。该基因型胚性愈伤由未成熟合子胚经脱分化诱导获得，诱导方法参考[陈金慧，施季森，诸葛强，黄敏仁.杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生研究.林业科学，2003(04)：49-53.]。如图1所示，该基因型的胚性愈伤颗粒细腻、颜色淡黄、增殖速度快、体胚发生能力强，适用于多倍体诱导研究。
[0040]
2、胚性愈伤预增殖培养
[0041]
以胚性愈伤(图1a、b)与液体愈伤增殖培养基的体积比为1：9的比例，建立50ml愈伤预培养悬浮系(图1c)，将其置于摇床内(暗环境，23℃)以95rpm的转速增殖培养7d，此步骤是为了增强悬浮细胞的增殖活性，利于提升后续秋水仙素诱变的成功率。悬浮细胞包括直径小于100μm的单细胞(图1d)和大于100μm的细胞团(即愈伤颗粒，图1e)，二者皆具极强的分化为体胚及再生植株的能力。
[0042]
3、秋水仙素诱导悬浮细胞染色体加倍
[0043]
以下过程均在无菌条件下操作：以不施加秋水仙素的对照组为例，将预培养7d的50ml悬浮系手动摇匀，迅速用量程为100-1000ml的移液枪(提前将枪头剪去5mm尖端，防止愈伤颗粒堵塞)分别吸取1000μl、500μl、200μl悬浮细胞(含单细胞、细胞团及愈伤大颗粒)吹打至25ml锥形瓶内，将锥形瓶倾斜静置30s、待大部分细胞(团)沉淀后，用10-100μl量程的移液枪缓缓吸除上清液，然后补充5ml新鲜的液体愈伤增殖培养基，建立5ml的对照悬浮系，悬浮培养条件同步骤1，以上三组对照悬浮系分别写作ck1(1000μl)、ck2(500μl)、ck3(200μl)。
[0044]
结果如表1所示，在三种对照悬浮系中，1000μl细胞组仅能连续增殖10d，而500μl和200μl细胞组分别能够连续增殖20d和30d，即接种到5ml液体悬浮系中的细胞越多，营养消耗越快，可增殖的有效时间越短，超过有效时间细胞将逐渐褐化、死亡。同理，分别吸取1000μl、500μl、200μl悬浮细胞、除去上清液后，补充5ml新鲜的含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基，即建成9种诱变悬浮系，秋水仙素浓度和处理时间的组合分别为0.1％/10d、0.1％/20d、0.1％/30d、0.2％/10d、0.2％/20d、0.2％/30d、0.3％/10d、0.3％/20d、0.3％/30d。通过以上悬浮系处理，胚性细胞将在含秋水仙素的液体培养环境里连续增殖10d或20d或30d，有利于达到良好的诱变效果，便于确定最佳的诱变处理组合。图2a为5ml0.2％/20d的诱变悬浮系的整体外观。
[0045]
4、诱变处理后胚性细胞的体胚诱导
[0046]
准备直径9cm的滤纸、去掉尖端的1ml枪头、脱脂棉(修剪平整后嵌于直径10cm培养皿内)，高温高压灭菌后待用，提前配制固体体胚诱导培养基。无菌环境下，用镊子将滤纸转移至棉花上、铺平，将秋水仙素处理后的悬浮细胞用液体愈伤增殖培养基稀释至原浓度的1/3，迅速摇匀后用移液枪吸取1ml细胞吹打在滤纸上，待棉花充分吸尽滤纸上的水分后，将滤纸轻轻地转移到上述固体体胚诱导培养基平板上，封口后转23℃暗培养。以0.2％/20d的处理组合为例，暗培养10d后开始出现球形胚，暗培养25d后出现大量子叶胚(图2b)，且子叶胚具有明显的形态和大小差异，箭头指示的子叶胚个体巨大(图2c)，发生了染色体加倍。
[0047]
5、子叶胚期的倍性鉴定与四倍体筛选
[0048]
体胚诱导25d后，对上述各处理组合随机选取至少30个子叶胚用于倍性鉴定(染色体压片法，改良卡宝品红(市售)染色)，变异统计如表1所示：在所有处理组合中，未施加秋水仙素的悬浮系经体胚诱导未能获得四倍体；0.1％的秋水仙素处理20d和30d分别获得了4.0％和5.9％的四倍体，该浓度为诱变的有效浓度，但四倍体诱导率较低；0.2％的秋水仙素处理10d、20d、30d对应的四倍体诱导率分别为9.6％、23.1％、8.6％，其中最优的处理组合为0.2％/20d；在0.3％秋水仙素的处理组中，仅处理10d时获得了2.2％的四倍体，处理20d时体胚诱导率大大降低，处理30d时无法获得正常体胚，暗示该浓度过高或处理周期过
长。
[0049]
表1秋水仙素处理后四倍体子叶胚诱导率(16-hs
×
ga)
[0050][0051][0052]
综上所述，0.2％/20d是本方法最佳的诱变处理组合。为了便于后续四倍体材料的收集，有必要在子叶胚时期对四倍体进行初步筛选，筛选标准依据对照组子叶胚和0.2％/20d处理下子叶胚的形态差异。经鉴定(染色体压片法)，二倍体子叶胚(图3a)含38条染色体(图3c)，形态较均匀，而四倍体子叶胚(图3b标记)含76条染色体(图3d-f)，具有明显的“巨大性”特征，在诱变后获得的体胚中容易发现和筛选。
[0053]
6、植株再生与四倍体筛选
[0054]
将按步骤5中方法初步筛选获得的“疑似四倍体子叶胚”接种至植株再生培养基上，23℃暗培养2周至下胚轴伸长(图4a)，然后转光照培养1-2周至子叶变绿(图4b)，光照强度为15μmol
·
m-2
·
s-1
，光照时间为16h/d，培养温度为24℃，此时可根据根系特征对四倍体进一步筛选：二倍体根较细长(图4c)，而四倍体根明显加粗、短壮(图4d)。将上述“疑似四倍体小植株”继代接种至新鲜的再生培养基上，待其真叶抽出后45-60d(移栽前)可作进一步筛选，四倍体较二倍体真叶更厚更绿，茎粗壮、叶柄短粗(图5a、b)、根加粗(图5e、f)。
[0055]
7、再生植株移栽与倍性鉴定
[0056]
再生植株真叶抽出45-60d后，即可将其移栽至土壤(腐殖质营养土∶珍珠岩＝7∶3)，移栽前取其幼嫩根尖用于染色体压片(改良卡宝品红染色法)。鉴定结果显示二倍体植株含38条染色体(图5g)，四倍体含76条染色体(图5h)，未发现混倍体或嵌合体。待幼苗在土壤环境中生长2-4个月(图5c、d)后，取其幼嫩叶片进行流式细胞鉴定，鉴定结果显示：以同批二倍体材料为对照，四倍体相对荧光参数值是其2倍，且无杂峰(图5i)，证明染色体加倍成功。
[0057]
综上，本技术方法以全能性细胞为诱变材料，通过构建适于秋水仙素处理的小型
悬浮系(5ml)，确定了高效诱导染色体加倍的处理组合(0.2％/20d)，成功诱导获得四倍体体胚和再生植株，并在胚后发育至植株再生阶段能够进行“三步法”筛选，大大降低了杂交鹅掌楸多倍体育种的工作量，有望获得大规模推广和应用。
[0058]
实施例2
[0059]
本实施例中使用的材料为杂交鹅掌楸良种“南林金森e1号”(良种号为：闽s-sc-ls-002-2019)胚性愈伤，良种“南林金森e1号”悬浮细胞增殖速度和营养消耗较16-hs
×
ga更快，按实施例1步骤2中的方法预培养后，分别吸取1000μl、500μl、200μl细胞重新建立5ml悬浮系分别仅能维持7d、14d、21d的连续增殖，所有12种处理组合(悬浮系)如表2所示。另外，由于该基因性具有极强的体胚发生能力，按实施例1步骤4的方法将诱变处理后的悬浮细胞接种至固体体胚诱导培养基上可直接诱导获得黄化苗(图6a-m，诱导35d获得的黄化苗)，进而按实施例1步骤6的条件、经光照培养30-45d即可获得再生植株(图7a)。
[0060]
取上述诱导35d获得的黄化苗根尖，通过染色体压片法对其进行鉴定倍性，每个处理组合鉴定50株黄化苗，变异统计结果如表2所示：在该基因型的所有诱变组合中，未施加秋水仙素处理的对照组未能获得四倍体植株；0.05％的秋水仙素处理7d也未能获得四倍体，但0.05％的秋水仙素处理14d和21d分别获得了2％和6％的四倍体植株；0.1％的秋水仙素处理7d、14d、21d分别获得了4％、12％、32％的四倍体植株，0.2％的秋水仙素处理7d、14d、21d分别获得了10％、26％、6％的四倍体植株，其中0.1％/21d和0.2％/14d诱变率接近，但0.1％/21d的组合秋水仙素浓度低、对细胞毒害小，为该基因型的最佳处理组合。
[0061]
表2秋水仙素处理后四倍体植株诱导率(南林金森e1号)
[0062]
处理组合浓度(w/v)时间(d)鉴定植株数四倍体数四倍体诱导率(％)10(ck1)7500020(ck2)14500030(ck3)21500040.05％7500050.05％14501260.05％21503670.1％7502480.1％145061290.1％21501632100.2％750510110.2％14501326120.2％215036
[0063]
该基因型的四倍体筛选可分两步：将秋水仙素处理的悬浮细胞诱导35d后获得黄化苗，四倍体黄化苗的根较二倍体显著变短增粗(图6e-1，框选部分为疑似染色体加倍的黄化苗)，可按此性状进行第一步筛选(图6m显示了二倍体和四倍体的表型差异，图6n、o为对m图中2x和4x的倍性鉴定结果，分别含38条和76条染色体)；当真叶抽出后，可进行第二轮筛选，筛选依据为四倍体叶片更绿、更厚、肉质化、叶脉纹路更浅(图7a-c)，根、茎、叶柄更短粗(图7d-i)。
[0064]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，其特征在于：将杂交鹅掌楸胚性愈伤接种到液体愈伤增殖培养基中进行预培养，建立愈伤预培养悬浮系；将预培养后的悬浮细胞接种到含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基中诱导悬浮细胞染色体加倍，建立秋水仙素处理悬浮系；将秋水仙素处理后的悬浮细胞接种到固体体胚诱导培养基中进行体胚诱导，得到四倍体子叶胚；将四倍体子叶胚接种至植株再生培养基中进行植株再生培养，得到纯合同源四倍体杂交鹅掌楸。2.根据权利要求1所述的纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，其特征在于，所述的液体愈伤增殖培养基配方为3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+0.2mg/l ba+0.5g/l ch+30g/l蔗糖，ph 5.75。3.根据权利要求1所述的纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，其特征在于，所述的杂交鹅掌楸胚性愈伤与液体愈伤增殖培养基的体积比为1∶9。4.根据权利要求1所述的纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，其特征在于，所述的含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基配方为3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+0.2mg/l ba+0.5g/l ch+30 g/l蔗糖+0.1-0.3％秋水仙素，ph 5.75。5.根据权利要求5所述的纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，其特征在于，所述的含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基配方优选为3/4ms+5mg/l vc+2mg/l 2，4-d+0.2mg/l ba+0.5g/l ch+30g/l蔗糖+0.2％秋水仙素，ph 5.75。6.根据权利要求1所述的纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，其特征在于，所述的固体体胚诱导培养基配方为3/4ms+5mg/l vc+0.2g/l lh+2g/l活性炭+40g/l蔗糖+2.5g/l水晶洋菜，ph 5.75。7.根据权利要求1所述的纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，其特征在于，所述的植株再生培养基配方为1/2ms+5mg/l vc+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.75。8.根据权利要求1所述的纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，其特征在于，所述的诱导悬浮细胞染色体加倍的培养条件为将预培养7d后的悬浮细胞接种到含0.2％秋水仙素的液体愈伤增殖培养基中诱导20d。9.根据权利要求1-8任一所述的纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，其特征在于，具体步骤包括：1)以杂交鹅掌楸胚性愈伤与液体愈伤增殖培养基的体积比为1∶9的比例，建立50ml愈伤预培养悬浮系，将其置于摇床暗环境下以95rpm的转速增殖培养7d；2)将预培养7d的50ml悬浮系手动摇匀，吸取200-1000μl悬浮细胞吹打至25ml锥形瓶内，静置至细胞沉淀后除去上清液，补充5ml含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基，建立5ml的秋水仙素处理悬浮系，将其置于摇床暗环境下以95rpm的转速增殖培养10-30d，得到秋水仙素处理悬浮系；3)将秋水仙素处理悬浮系用液体愈伤增殖培养基稀释至原浓度的1/3，迅速摇匀后用移液枪吸取1ml悬浮细胞吹打在滤纸上，待棉花充分吸尽滤纸上的水分后，将滤纸轻轻地转移到上述固体体胚诱导培养基平板上，封口后转23℃暗培养10-25d，得到四倍体子叶胚；4)将四倍体子叶胚接种至植株再生培养基上，23℃暗培养2周，然后转光照培养1-2周，光照强度为15μmol
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m-2
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s-1
，光照时间为16h/d，培养温度为24℃，得到纯合同源四倍体杂交鹅掌楸。

技术总结
本发明公开了一种纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，属于植物快繁技术领域。该纯合同源四倍体杂交鹅掌楸的快繁方法，将杂交鹅掌楸胚性愈伤接种到液体愈伤增殖培养基中进行预培养，建立愈伤预培养悬浮系；将预培养后的悬浮细胞接种到含秋水仙素的液体愈伤增殖培养基中诱导悬浮细胞染色体加倍，建立秋水仙素处理悬浮系；将秋水仙素处理后的悬浮细胞接种到固体体胚诱导培养基中进行体胚诱导，得到四倍体子叶胚；将四倍体子叶胚接种至植株再生培养基中进行植株再生培养，得到纯合同源四倍体杂交鹅掌楸。结果表明：使用0.1％的秋水仙素处理21d后四倍体的诱导率高达32％，良种“南林金森E1号”的诱导率优于16-HS


技术研发人员：陈金慧 杨顶杰 殷健超 施季森 翁禹豪 范瑞芳 武鑫茹
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/1