一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的引物、试剂盒以及方法与流程

一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的引物、试剂盒以及方法
技术领域
1.本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的引物、试剂盒以及方法。


背景技术：

2.单核细胞增生李斯特菌(listeria monocy togenes，简称单增李斯特菌)是一种重要的兼性厌氧革兰氏食源性致病菌，可引起败血症、脑膜炎、脑膜脑炎、胸肌炎和等严重李斯特菌病，孕妇甚至导致流产等严重后果，敏感人群主要为老年人、新生儿、孕妇和免疫力低下者，致死率为20％-30％。近年来，我国部分城市有报道偶发李斯特菌病病例，主要人群为孕妇、新生儿等，对我国居民身体健康造成一定的威胁。
3.单核细胞增生李斯特菌遗传多样性丰富，具有14种血清型，分别为1/2a，1/2b，1/2c，3a，3b，3c，4a，4b，4c，4ab，4d，4e，4h和7。脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis，pfge)是单增李斯特菌分子分型的“金标准”，但随着dna测序技术的发展，目前多位点序列分型(multilocus sequence typing，mlst)是单增李斯特菌遗传多样性分析的流行方法，其分辨力、稳定性均可与pfge媲美，比血清分型具有更高的分辨力和可靠性。据法国巴斯德研究所bigsdb-lm数据库统计，目前单增李斯特菌已发现2331序列型(sequence types，sts)(截至2020年12月15日)。单增李斯特菌具有耐受低温、低水活度、宽范围ph和高盐等能力，因此广泛存在于食品加工、水体和土壤等环境中。目前，我国许多学者报道在食品样品和临床源样本中，克隆复合群(clonal complex，cc)8型菌株均为优势型别，可能与其能够耐受一定剂量的消毒剂、强生物膜形成能力、抗氧胁迫能力等特征相关；同时有研究表明cc8型菌株是长期持续性污染食品生产加工的主要基因型，对食品安全带来严重的潜在威胁。因此，迫切需要开发一种快速检测食品和食品加工环境中cc8菌株的方法。
4.目前已有多种方法用于鉴定单增李斯特菌亚型，包括分子生物学方法和传统的菌落计数法。但这些方法存在一些限制，例如需要较长的操作时间、高昂的成本和较低的通量。采用mlst技术可以准确鉴定单增李斯特菌的cc型别，但目前dna序列测定成本较高、耗时相对较长、且测序的准确性也直接影响mlst分型结果的准确性。因此，开发一种快速、高通量和低成本的方法作为单增李斯特菌亚型鉴定的替代方法是必要的。随着微生物全基因组测序技术的发展，基于比较基因组学分析获得cc型特异性dna检测靶标，可以开发快速高通量、廉价、灵敏度高的pcr鉴定技术。
5.多重pcr是在同一个反应体系中利用多对特异性引物同时扩增多段特异性dna序列靶标的pcr技术。目前已广泛应用于微生物血清分型、分子分型、病原体检测、转基因鉴定、遗传疾病诊断等生物、医学领域。多重pcr具有以下优势：(1)高通量，在一次操作中可对多达384个样品进行鉴定；(2)廉价高效，同一pcr扩增体系可同时检测多个特异性靶标，且无需进行dna序列测定，根据靶标序列dna条带扩增结果即可判断；(3)易于操作、耗时短，在
同一pcr反应中实现多个靶标一步法同时扩增，150min内即可获得准确结果；(4)准确性高，实现多个靶标的同步特异性扩增，大大降低了假阳性的可能性。随着引物对数量的增加，引物间的抑制作用降低了多重pcr的检测通量，在多重pcr技术的实际应用过程中，由于在同一反应管内添加多对引物，引物的非特异性扩增、引物间二聚体形成、pcr反应体系优化以达到每个靶标dna序列都能有效扩增等问题限制了多重pcr技术的应用。
6.hrm qpcr是在同一个反应体系中利用多对特异性引物同时扩增多段特异性dna序列靶标，并利用高分辨熔解曲线，一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的分析方法，同时检测多个基因的qpcr技术。hrm qpcr技术具有以下优势：(1)操作简单，同一hrm qpcr反应中实现多个靶标的同步特异性扩增及分析，实现真正的闭管操作，降低污染风险；(2)分析时间短，70min内即可获得准确结果；(3)灵敏度和特异性高，相比于pcr，hrm qpcr检测限低10至100倍，灵敏度更高。
7.由于目前市面上的单增李斯特菌分子检测试剂盒应用的特异性位点是基于有限的单增李斯特菌基因组数量分析得到的，我们的分析证实，在cc269和st1197中也发现了作为cc8特异性位点的目的基因序列，而ncbi数据库中的部分cc8菌株不携带该特异性位点。因此，本专利选择了1928个属于442个st型(123个cc型)和111个单一st型的基因组进行更深入的全基因组分析，获得单增李斯特菌cc8型菌株特异性基因，开发高通量、高灵敏度和准确可靠的单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株多重pcr和hrm qpcr检测技术及其相应的试剂盒，对食品生产企业、检验检疫部门检测/监测单增李斯特菌污染具有重要的价值。


技术实现要素：

8.本发明基于比较基因组学分析技术开发的多重pcr以及hrm qpcr技术对单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的特异性检测靶标同时进行检测，可直接鉴定单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株。
9.本发明的目的之一：提供一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如seq id no:1～2以及seq id no:5～6所示的引物。本发明的设计引物能够分别扩增出不同位置的目的条带，可以明显地区分单增李斯特菌和cc8型单增李斯特菌。
10.优选地，其中所述如seq id no:1～2所示的引物扩增的目标基因为lm5578_1180；所述如seq id no:5～6所示的引物扩增的目标基因为lm5578_2262。
11.本发明分别针对单增李斯特菌以及单增李斯特菌cc8型菌株的特异性靶标序列设计了特异性扩增引物。本发明之所以选择上述基因作为各型菌株的靶标，是因为基因“lm5578_1180”为cc8型单增李斯特菌株的特异性分子靶标，仅存在于cc8型单增李斯特菌株；基因“lm5578_2262”为单增李斯特菌株的特异性分子靶标。因此，当使用如seq id no:1～2以及seq id no:5～6所示的引物进行多重pcr时，pcr产物会出现两种结果：若同时出现目标基因dpna(855bp)和ycni(187bp)两条扩增条带，则该菌株鉴定为cc8型菌株；若只出现目标基因ycni(187bp)一条扩增条带，则该菌株鉴定为单增李斯特菌。
12.本发明的目的之二：提供一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的qpcr引物组，所述引物组包括核苷酸序列如seq id no:3～4以及seq id no:7～8所示的
引物。本发明的设计引物能够分别获得两个不同温度的融解峰，可以明显地区分单增李斯特菌和cc8型单增李斯特菌。
13.优选地，其中所述如seq id no:3～4所示的引物扩增的目标基因为lm5578_1180；所述如seq id no:7～8所示的引物扩增的目标基因为lm5578_2262。
14.本发明分别针对单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的特异性靶标序列设计了特异性扩增引物。本发明之所以选择上述基因作为各型菌株的靶标，是因为基因“lm5578_1180”为cc8型单增李斯特菌株的特异性分子靶标，仅存在于cc8型单增李斯特菌株；基因“lm5578_2262”为单增李斯特菌株的特异性分子靶标。因此，当使用如seq id no:3～4以及seq id no:7～8所示的引物进行hrm qpcr时，高分辨融解曲线会出现两种结果：若同时出现目标基因dpna(78.5℃)和ycni(80.5℃)两个融解峰，则该菌株鉴定为cc8型菌株；若只出现目标基因ycni(80.5℃)一个融解峰，则该菌株鉴定为单增李斯特菌。
15.本发明的目的之三：提供一种鉴定单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的特异性靶标序列，所述特异性靶标序列包括如seq id no:9～10所示的核苷酸序列。
16.本发明的目的之四：提供一种检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的试剂盒，所述试剂盒包括如seq id no:1～2以及seq id no:5～6所示的引物组。
17.优选地，所述试剂盒还包括：taq dna聚合酶、mgcl2、pcr扩增缓冲液、dntp、去离子水。
18.本发明的目的之五：提供一种非疾病诊断和治疗目的的检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的方法，包括以下步骤：
19.s1、提取待测菌株的基因组dna；
20.s2、进行多重pcr：以待测菌株的基因组dna为模板，利用如seq id no:1～2以及seq id no:5～6所示的引物组扩增目的靶序列；
21.s3、将步骤s2的扩增产物进行判定。
22.优选地，所述判定结果为：若同时出现目标基因dpna(855bp)和ycni(187bp)两条扩增条带，则该菌株鉴定为cc8型菌株；若只出现目标基因ycni(187bp)一条扩增条带，则该菌株鉴定为单增李斯特菌。
23.优选地，所述多重pcr的反应体系包括：浓度为10μm的seq id no:1～2以及seq id no:5～6所示的引物0.5μl，2.5u/μl的taq dna polymerase 0.5μl，25mmol/lmgcl
2 2μl，10mmol/l的dntp 2μl，5
×
pcr扩增缓冲液5μl，dna模板1μl，无菌去离子水12.5μl。
24.优选地，所述多重pcr的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸60s，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。
25.本发明的目的之六：提供一种检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的hrm qpcr试剂盒，所述试剂盒包括如seq id no:3～4以及seq id no:7～8所示的引物组。
26.优选地，所述试剂盒还包括：tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)、去离子水。
27.本发明的目的之七：提供一种非疾病诊断和治疗目的的检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的方法，包括以下步骤：
28.s1、提取待测菌株的基因组dna；
29.s2、进行hrm qpcr：以待测菌株的基因组dna为模板，利用如seq id no:3～4以及
seq id no:7～8所示的引物组扩增目的靶序列；
30.s3、将步骤s2的扩增产物进行判定。
31.优选地，所述判定结果为：其特征在于，若在78.5℃与80.5℃位置同时出现两个融解峰，则该菌株鉴定为cc8型菌株；若只在80.5℃位置出现一个融解峰，则该菌株鉴定为单增李斯特菌。
32.优选地，所述hrm qpcr的反应体系包括：浓度为10μm的seq id no:3～4、seq id no:7～8所示的引物0.5μl，tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)10μl，dna模板1μl，无菌去离子水7μl。
33.优选地，所述hrm qpcr的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，扩增40个循环；95℃变性60s，40℃复性60s然后温度从65℃提高到97℃，熔解速率为0.07℃/s，并在15个读数/℃监测荧光信号。
34.本发明的目的之八：提供了本发明的引物组、特异性靶标序列或试剂盒在鉴定单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株中的应用。
35.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
36.(1)本发明利用比较基因组学分析获得的单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株特异性靶标dna序列，采用多重pcr以及hrm qpcr技术扩增实现cc8菌株的快速鉴定，结果准确可靠。
37.(2)本发明公开的同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的多重pcr及hrm qpcr试剂盒，可同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的多个特异性靶标，不仅可以节约试剂使用量和降低检测成本，而且具有高通量特点，提高了检测效率，具有灵敏度高、经济快速、操作简单和准确性高等优点。
38.(3)本发明公开的多重pcr试剂盒进行检测时，只需要进行多重pcr扩增结合琼脂糖凝胶电泳即可准确鉴定单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株，步骤简单快捷，无需进行dna序列测定和比对分析，缩短了鉴定时间的同时降低了因dna序列测定结果准确性影响结果可信度的因素。
39.(4)本发明的多重pcr检测体系特异性强，多重pcr试剂盒检测cc8型菌株的灵敏度分别达到99.1fg/25μl，单管进行，操作简便快捷，具有灵敏度高、经济快速、高通量等优点，可用于开发相关的检测试剂盒，可应用于食品检验、检验检疫等部门。
40.(5)本发明公开的hrm qpcr试剂盒进行检测时，只需要进行hrm qpcr扩增即可准确鉴定单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株，步骤简单快捷，无需进行dna序列测定和比对分析，缩短了鉴定时间的同时降低了因dna序列测定结果准确性影响结果可信度的因素。
41.(6)本发明的hrm qpcr检测体系特异性强，hrm qpcr试剂盒检测cc8型菌株的灵敏度达到0.991fg/20μl，单管进行，操作简便快捷，具有灵敏度高、经济快速、高通量等优点，可用于开发相关的检测试剂盒，可应用于食品检验、检验检疫等部门。
附图说明
42.图1为单增李斯特菌cc8型菌株多重pcr特异性分析结果示意图(m为dl2000 dna标准marker，-为阴性对照，1～85泳道是pcr产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中1～14为单增李
斯特菌cc8型菌株，15～85为其他cc型单增李斯特菌)。
43.图2为单增李斯特菌cc8型菌株多重pcr灵敏度测定结果示意图(m为dl2000 dna标准marker，-为阴性对照；1～9泳道对应的dna模板浓度分别为99.1ng、9.91ng、0.991ng、99.1pg、9.91pg、0.991pg、99.1fg、9.91fg、0.991fg)。
44.图3为单增李斯特菌cc8型菌株hrm qpcr特异性分析结果示意图(虚线为单增李斯特菌cc8型菌株融解峰，实线为单增李斯特菌其他cc型菌株融解峰)。
45.图4为不同浓度hrm qpcr检测单增李斯特菌cc8型菌株(99.1ng、9.91ng、0.991ng、99.1pg、9.91pg、0.991pg、99.1fg、9.91fg、0.991fg、99.1ag)；图a为hrm qpcr扩增曲线；图b为hrm qpcr归一化熔融峰。
46.图5为应用pcr及hrm qpcr检测食品样品中单增李斯特菌cc8型菌株污染情况示意图；图a为pcr检测结果，m为dl2000 dna标准marker，-为阴性对照，+为阳性对照，泳道1～12、13～24、25～36分别对应12份样品增菌9小时、12小时和24小时的检测结果；图b为hrm qpcr扩增曲线；图c为hrm qpcr归一化熔融峰。
具体实施方式
47.为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
48.实施例1：多重pcr体系特异性检测
49.本实施例提供一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的pcr试剂盒，包括常规pcr组件，还包括针对单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的特异性引物，特异性引物序列如seq id no:1～2以及seq id no:5～6所示，常规pcr组件包括taq dna聚合酶、mgcl2、pcr扩增缓冲液、dntp、去离子水。
50.表1针对单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的特异性引物
[0051][0052]
基因dpna的序列如seq id no:9所示，具体为：
[0053]
ttggcaaagattgaaccaaagatttttgatgagttaaaaatagcattatcttcttttgaccaaaaatattttgttggcgaagaattaaatcgctcaaaactcacggaggatttacggaattatgatgaaacactacttagcaaa
ttatttgaagtggaatttataaagcaaaattttctcaaggaagttgcaggacagaagttatttcaaattgaacagcttgaggaaacgattatgtacaatgattactgggatacaagttacacaaagtatgaaaatcgtgttggattagcttcaaaggggaagttcttacaggatgatcaagacgtggtgttagattttccgttcaaagatggtgtgctcacagcttccatgacaaaggaagataacgaagaaggttatgatgatgccttcttaaacgaggtgattgaaaaggatgagattgaccgtctttttgataagaaaatatttacgaatgtcaaacgcttcggatataattcgtcaaacggtgttgctaatggggatgtttcctttgataaggaaaaagataatctgattatcaaagggaataatttgttggctctacatacattgaaagatatgtattcaggaatgattaaattgatctatattgacccaccatataatacagggaaagattcatttaggtacaatgacaagtttaatcattcaacgtggatgacatttatgaagaaccgtcttgaaattgctaaagagctattatctgaagatggctgtatttggttgaacatagacgatgatgagggacactatcttaaagttcttgcagatggtgtgtttggtagagaaaattttatcaataatgttatttgggaaaaaaagtacactatttcaaatgacgccaaatacttatctgataaccacgaccatctgctattttatgcgaaagataaaaataattggaaacctaatcctttacctcgcactgccgaaatgaataaagcgtataagaatccagataatcatccgaaaggtgtttggaaggcaactcctcttcatgccaagagtggatcgattaaaggagaaagattcatccatacttttagtaacggggttacgtggagtcctccaatcggaacatttcctaggttttcaaaagagacattggaaaggcttgatatggaagatgcaatctattttggcaaggacggaaatgcaattccatctcgaaaaacttttttaagtgagctaaaaaacaaaggaattccagcaaggaccgtttggagatctgatgaagttggacacaatcatgaagccagagaagaaattaagcatttgaatttggaaactgatttcacaactccaaaaccagaaaggctacttcaacgagtcttgacattggggagtttagaaggagatataatcttggatttctttatgggttcggcaacaacacaagctgtggcaatgaagatgaagagacgattcataggcattgagcaaatggactatatcaatagtgtatctattcccagactagaaaaagttattgacggcgaccaaggtggtatttcaaaagccgttaattggcaaggtggaggttcattcgtttatactgaactattagttaagaacatgagttaccttaaggatattatccactcaaaaactaccgaggagcttaattcagtttatgaaagtatgctacaaggaactgatacagatgaacctgcggatatttcctttcgtgttgatttatctaaaattgattgggctcaaggatttgatgacaataagcgcctgttaattaagttacttgataagaatggactttattataactactcagaaattgatgatatgaatgtccgtgatttagtttctcatgaagactacagctttaataaagctttctatgaaggtggtgagtaa。
[0054]
基因ycni的序列如seq id no:10所示，具体为：
[0055]
atgaaaaaaattatgagctccatcgtcgtattattagctgtctttatcattccatttcaagcgagcgcgcatgtctcagtattaccaagcgaatcgaccgtagactcctgggaaacctacacgatgaaagttccatcagaaaaagatgcagcatctaaaaaaatcgttttaaaagtgacaaagggtgtatcgttcgaatcgtatgaaccagttccaggctggacaacgacgatagataagaagaacggaacagtaacatggcaaacagaaggcagcggaattgaaaaaggtcaatttcagcgatttagttttatcgctaaaaatccaagtgaagaaggagaagtcccttggaatgcctatcaatattatgaagatggttccatcgtcgaatgggttggggcagaagattctgaaacaccacatgctacaacaaaaatcgtcaaagagtcttctaaatcagcaactggctcgcacggagaggtagtggcaggagcagagaacacagcaggggatacaagcagcagtggtgataatacgattttattatggaccgcagtagctatcagcgttattgcgcttatcacgggtattcttgctattttaagccgaaaaaaataa。
[0056]
多重pcr体系的特异性检测：采用多引物对+基因组dna模板的pcr扩增方法，扩增单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的靶标dna序列，基因dpna和ycni的模板均来自于各菌的基因组dna，模板dna浓度为20ng/μl。
[0057]
多重pcr采用25μl反应体系，包括：浓度为10μm的seq id no:1～2、seq id no:5～6所示的引物0.5μl，2.5u/μl的taq dna polymerase 0.5μl，25mmol/l mgcl
2 2μl，10mmol/
l的dntp 2μl，5
×
pcr扩增缓冲液5μl，dna模板1μl，无菌去离子水补充至总体积25μl。pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸60s，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。
[0058]
pcr结果如图1所示，m为dl2000 dna标准marker，-为阴性对照，1～85泳道是pcr产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中1～14为单增李斯特菌cc8型菌株，15～85为其他cc型单增李斯特菌。可见，运用本发明的多重pcr体系检测靶标dna，可以从相应基因组dna模板中扩增出与其大小的单一产物，且条带清晰，结果表明本发明的多重pcr引物特异性强。
[0059]
实施例2：多重pcr体系的灵敏度检测
[0060]
采用10倍稀释法对含靶标基因的基因组dna模板进行模板梯度pcr检测，基因dpna和ycni的靶基因分别是lm5578_1180和lm5578_2262。将基因组模板用ddh2o进行10倍梯度稀释，依次得到cc8型菌株99.1ng/μl、9.91ng/μl、0.991ng/μl、99.1pg/μl、9.91pg/μl、0.991pg/μl、99.1fg/μl、9.91fg/μl、0.991fg/μl不同浓度的基因组dna模板。多重pcr采用25μl反应体系，包括：浓度为10μm的seq id no:1～2、seq id no:5～6所示的引物0.5μl，2.5u/μl的taq dna polymerase 0.5μl，25mmol/lmgcl
2 2μl，10mmol/l的dntp 2μl，5
×
pcr扩增缓冲液5μl，dna模板1μl，无菌去离子水12.5μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸60s，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。
[0061]
结果图2所示，m为dl2000 dna标准marker，-为阴性对照，1～9泳道对应的dna模板浓度分别为99.1ng、9.91ng、0.991ng、99.1pg、9.91pg、0.991pg、99.1fg、9.91fg、0.991fg。结果表明，使用本发明的多重pcr体系检测靶标dna，cc8菌株检测灵敏度最高分别可达99.1fg/25μl，具有较高的灵敏度，可用于单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的检测。
[0062]
可见，本发明筛选获得的靶序列(seq id no:9～10)以及针对所述靶序列设计的扩增引物(seq id no:1～2以及seq id no:5～6)具有较高的特异性，能从单增李斯特菌检测出单增李斯特菌cc8型菌株，且具有高度的灵敏性，cc8型菌株的dna模板浓度低至99.1fg时，仍能扩增出目的条带进行检测。
[0063]
实施例3：hrm qpcr体系特异性检测
[0064]
本实施例提供一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的hrm qpcr试剂盒，包括常规qpcr组件，还包括针对单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的特异性引物，特异性引物序列如seq id no:3～4以及seq id no:7～8所示，常规qpcr组件包括tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)、去离子水。
[0065]
hrm qpcr的反应体系包括：浓度为10μm的seq id no:3～4、seq id no:7～8所示的引物0.5μl，tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)10μl，dna模板1μl，无菌去离子水7μl。hrm qpcr的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，扩增40个循环；95℃变性60s，40℃复性60s然后温度从65℃提高到97℃，熔解速率为0.07℃/s，并在15个读数/℃监测荧光信号。
[0066]
结果如图3所示，虚线为单增李斯特菌cc8型菌株融解峰，实线为单增李斯特菌其他cc型菌株融解峰。可见，运用本发明的hrm qpcr体系检测靶标dna，可以从相应基因组dna模板扩增出相应的靶标基因，且可根据融解峰形状(双峰为单增李斯特菌cc8型菌株)判定产物是否为单增李斯特菌cc8型菌株，结果表明本发明的hrm qpcr引物特异性强。
[0067]
实施例4：hrm qpcr体系的灵敏度检测
[0068]
采用10倍稀释法对含靶标基因的基因组dna模板进行模板梯度pcr检测，基因dpna和ycni的靶基因分别是lm5578_1180和lm5578_2262。将基因组模板用ddh2o进行10倍梯度稀释，依次得到cc8型菌株99.1ng/μl、9.91ng/μl、0.991ng/μl、99.1pg/μl、9.91pg/μl、0.991pg/μl、99.1fg/μl、9.91fg/μl、0.991fg/μl、99.1ag/μl不同浓度的基因组dna模板。hrmq pcr采用20μl反应体系，包括：浓度为10μm的seq id no:3～4、seq id no:7～8所示的引物0.5μl，tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)10μl，dna模板1μl，无菌去离子水7μl。hrm qpcr的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，扩增40个循环；95℃变性60s，40℃复性60s然后温度从65℃提高到97℃，熔解速率为0.07℃/s，并在15个读数/℃监测荧光信号。
[0069]
结果如图4所示，图4为不同浓度hrm qpcr检测单增李斯特菌cc8(99.1ng、9.91ng、0.991ng、99.1pg、9.91pg、0.991pg、99.1fg、9.91fg、0.991fg、99.1ag)；图a为hrm qpcr扩增曲线；图b为hrm qpcr归一化熔融峰。结果表明，使用本发明的hrm qpcr体系检测靶标dna，cc8菌株检测灵敏度最高分别可达0.991fg/20μl，具有较高的灵敏度，可用于单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的检测。
[0070]
可见，本发明筛选获得的靶序列(seq id no:9～10)以及针对所述靶序列设计的扩增引物(seq id no:3～4以及seq id no:7～8)具有较高的特异性，能从单增李斯特菌检测出单增李斯特菌cc8型菌株，且具有高度的灵敏性，cc8型菌株的dna模板浓度低至0.991fg时，仍能扩增出目的融解峰进行检测。
[0071]
实施例5：应用试剂盒检测实际样品中的单增李斯特菌cc8型菌株污染情况
[0072]
使用pcr和hrm qpcr试剂盒检测实际样品中的单增李斯特菌cc8型菌株污染情况。在本发明的实施例中，实际样品来自超市和市场的食品样品。
[0073]
对采集的样品使用李氏增菌肉汤lb1(购自广东环凯生物科技有限公司，货号cp0409)在37℃进行培养，以富集单增李斯特菌。分别于9小时、12小时和24小时取1ml富集液提取dna，分别使用pcr及hrm qpcr试剂盒进行检测。
[0074]
结果如图5所示，图5为应用pcr及hrm qpcr试剂盒检测食品样品中单增李斯特菌cc8型菌株污染情况示意图；图a为pcr检测结果，m为dl2000 dna标准marker，-为阴性对照，+为阳性对照，泳道1～12、13～24、25～36分别对应12份样品增菌9小时、12小时和24小时的检测结果；图b为hrm qpcr扩增曲线；图c为hrm qpcr归一化熔融峰。结果表明，在使用本方法进行检测时，目标物可以在9小时内被检出。该方法的高效性和准确性为实际样品的检测提供了有效的解决方案，并可广泛应用于食品行业、公共卫生等领域。
[0075]
可见，本发明试剂盒能从实际样品增菌液中高效检测出单增李斯特菌cc8型菌株的污染，且具有高度的灵敏性和特异性。
[0076]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如seq id no:1～8所示。2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no:1～4所示的引物扩增的目标基因为lm5578_1180；所述核苷酸序列如seq id no:5～8所示的引物扩增的目标基因为lm5578_2262。3.用于检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的特异性靶标序列，其特征在于，所述特异性靶标序列的核苷酸序列如seq id no:9～10所示。4.一种检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核苷酸序列如seq id no:1～2、seq id no:5～6所示的引物组。5.一种非疾病诊断和治疗目的的检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、提取待测菌株的基因组dna；s2、进行多重pcr：以待测菌株的基因组dna为模板，利用核苷酸序列如seq id no:1～2、seq id no:5～6所示的引物组扩增目的靶序列；s3、将步骤s2的扩增产物进行判定。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，若在855bp与187bp位置同时出现两条扩增条带，则该菌株鉴定为cc8型菌株；若只在187bp位置出现一条扩增条带，则该菌株鉴定为单增李斯特菌。7.一种检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的hrm qpcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核苷酸序列如seq id no:3～4、seq id no:7～8所示的引物组。8.一种非疾病诊断和治疗目的的检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤:s1、提取待测菌株的基因组dna；s2、进行hrm qpcr：以待测菌株的基因组dna为模板，利用核苷酸序列如seq id no:3～4、seq id no:7～8所示的引物组扩增目的靶序列；s3、将步骤s2的扩增产物进行判定。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，若在78.5℃与80.5℃位置同时出现两个融解峰，则该菌株鉴定为cc8型菌株；若只在80.5℃位置出现一个融解峰，则该菌株鉴定为单增李斯特菌。10.权利要求1所述的引物组、权利要求3所述的特异性靶标序列或权利要求4或7所述的试剂盒在检测单增李斯特菌和单增李斯特菌cc8型菌株中的应用。

技术总结
本发明公开了一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的引物、试剂盒以及方法。所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～8所示。本发明提供的引物组可同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的特异性靶标，不仅可以节约试剂使用量和降低检测成本，而且具有高通量特点，具有灵敏度高、经济快速、操作简单和准确性高等优点，可以广泛应用于食品行业、公共卫生行业等领域。公共卫生行业等领域。公共卫生行业等领域。


技术研发人员：吴清平 程健恒 陈谋通 陈玲 吴诗 古其会 叶青华 杨美艳 张菊梅 杨宁 陈惠元
受保护的技术使用者：广东环凯生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/8/1