一种与苦瓜果皮颜色相关联的分子标记及其应用

1.本技术涉及苦瓜技术领域，具体涉及一种与苦瓜果皮颜色相关联的分子标记及其应用。


背景技术：

2.苦瓜(momordica charantia l.)为葫芦科苦瓜属的一年生蔓性草本植物，广泛分布亚热带、热带及温带地区，是重要的食药兼用园艺作物。苦瓜果实属于瓠果，果实形状为纺锤形、长棒状或大顶形等，幼嫩的果实呈现深绿色、浅绿色或白色，成熟后橙黄色。
3.果实的外观特征属于感观品质性状，常常影响其市场接受度。不同地方消费习惯不同，通常习惯选择某种类型的苦瓜，因此种植者在选择品种时非常重视果实外观特征，通常会基于目标市场进行品种选择。颜色是苦瓜育种过程非常重要的品质性状，通过对苦瓜果皮颜色相关基因的定位及开发的分子标记可以为育种者提供快速、准确的筛选方法，减少与育种筛选有关的土地、人力及经济成本，促进苦瓜育种进程。
4.目前对苦瓜育种材料的果实性状的评价是肉眼观察法，需要在合适的生长季节栽培，并等到植株长到结果期、果实膨大之后才能进行观察。为了筛选得到具有目标性状的个体，需要种下大量的群体，占用较大面积的土地，种植成本和管理成本较高。另外该方法只是对材料当代表型的鉴定，无法鉴定出目标性状位点杂合的材料，从而无法预测深绿色果皮材料(显性)后代该性状是否分离情况，需要继续种植下一代才能得到稳定的表型。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术能够早期对苦瓜果皮颜色进行预测，以便在苦瓜苗期即可筛选得到具有深绿色或浅绿或白色的苦瓜，以实现早期筛选的目的，实现快速筛选，节省筛选成本。为此，本技术实施例至少公开了以下技术方案：
6.第一方面，本技术实施例公开了一种与苦瓜果皮颜色相关联的分子标记，所述分子标记包括如seq id no.1所示的dna分子和/或如seq id no.2所示的dna分子；或者所述分子标记包括如seq id no.5所示的dna分子和/或如seq id no.6所示的dna分子。
7.第二方面，本技术实施例公开了用于扩增第一方面所述的分子标记的引物对，包括如seq id no.3～4所示的dna分子，或如seq id no.7～8所示的dna分子。
8.第三方面，本技术实施例公开了用于检测或预测苦瓜果皮颜色的试剂盒，包括第二方面所述的引物对，以及用所述引物对进行pcr扩增的相关试剂。
9.第四方面，本技术实施例公开了一种检测或预测苦瓜果皮颜色的方法，包括：
10.提取苦瓜材料的基因组dna；
11.采用第二方面所述的引物对对所述基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；
12.电泳检测所述扩增产物，根据所述扩增产物的长度大小检测或预测所述苦瓜果皮颜色。
13.第五方面，本技术实施例公开了第一方面所述的分子标记、或第二方面所述的引
物对或第三方面所述的试剂盒在苦瓜果皮颜色鉴定中的应用。
14.第六方面，本技术实施例公开了第一方面所述的分子标记、或第二方面所述的引物对或第三方面所述的试剂盒在苦瓜分子标记辅助育种中的应用。
15.第七方面，本技术实施例公开了第一方面所述的分子标记、或第二方面所述的引物对或第三方面所述的在苦瓜种质资源改良中的应用。
16.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：
17.实施例提供的分子标记、引物对、试剂盒及方法是在植物生长早期(如苗期)利用与果皮颜色相关联的分子标记进行早期筛选，鉴定技术在苗期进行，占地面积不大，后期只需要种植筛选得到目标单株即可，可以节省筛选成本。另外，可以鉴定出目标性状遗传位点的纯合或杂合状况，从而可对后代表型进行较准确的预测，为特定颜色的苦瓜材料选育提供快速筛选标记。
附图说明
18.图1为本技术实施例提供的在seq id no.1所示的第776与777之间的位置处存在15个碱基插入/缺失突变展示图。
19.图2为本技术实施例的杂合型(het)与正常型(ref)在目标位点呈双峰的测序峰图。
20.图3为本技术实施例中提供的8个商品种(c1,l2,c11,c6,c7,a8,l1和yns2)和8个自交系苦瓜(apple2,kg4,kg3-1-5s,kg3-3-3,y9,yns,kg8)的果皮颜色的示意图。
21.图4为本技术实施例提供的利用indel标记2f/2r预测苦瓜果皮颜色的电泳图。泳道1～16依次为：c1,c6,c7,l1,l2,yns,yns2,c11,a8,apple2,kg4,kg3-1-5s,kg3-3-3,y9,kg8,2020-1。
具体实施方式
22.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
23.分子标记位点的获得
24.1、遗传分离群体构建和极端池混池测序
25.选择浅绿或白色果皮苦瓜自交系和深绿色果皮苦瓜自交系，通过杂交后自交构建f2遗传分离群体，根据单株果实的颜色，分别挑选15株深绿色或浅绿或白色的单株混合构建深绿色果皮池和浅绿或白色果皮池，通过全基因组重测序对两个混池样本进行测序，通过生物信息学分析，得到与苦瓜果皮颜色相关的定位区间。
26.2、位点的获得
27.利用定位区间内的单核酸多态性设计caps标记，对分离群体单株进行基因型分析，根据相应单株的表现型(浅绿或白色果皮、深绿色果皮)筛选重组单株，最后定位到控制苦瓜果皮颜色的候选基因，浅绿或白色和深绿色果皮自交系的在苦瓜基因组如seq id no.1所示的由5’端起始的第776与777位之间存在15-bp的indel差异。
28.分子标记的验证
29.1.种植材料
30.将经过催芽的苦瓜种子样品播于50孔穴盘，正常进行苗期管理，在苗期取样用于dna提取。
31.2.dna提取
32.采用ctab法或试剂盒提取各样品单株的dna，稀释到50ng/μl用于后续pcr。
33.3.目标位点的pcr扩增。
34.pcr体系总体积为20μl：包括10μl pcr mix，0.5μl f引物，0.5μl r引物，8μl ddh2o，1μl dna。用于扩增的引物为1f/1r引物对，引物1f序列如seq id no.3所示和引物1r序列如seq id no.4所示；
35.pcr程序设置如下：95℃预变性4min；94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸1分钟，共循环36次；最后72℃延伸5min。
36.4.pcr扩增产物的检测
37.利用1％的agar gel检测pcr产物，挑选扩增产物条带大小符合预期目标大小的样品进行测序。
38.5.pcr产物测序及目标位点分析
39.将pcr产物送至生物测序公司进行测序，以本技术提供的ref序列(如seq id no.1所示)为参考核苷酸序列进行分析，目标位点在ref序列的第776-777位点，测序结果采用序列分析软件进行分析(如geneious软件)。
40.结果：样品序列在ref序列的第776到777位点间基因型可能有三种类型：与ref相同(见图1，同ref)，与ref相比存在15个碱基插入(见图1，同mut，其序列如seq id no.2所示)，或者杂合型(het，见图2)。
41.6.目标位点基因型与表型的关系
42.根据该位点的序列情况，可以预测材料嫩果的表皮颜色特征。苦瓜嫩果颜色可分为以下2类(图3)，a浅绿或白色：b深绿色。
43.如果样品序列与ref序列相同，则颜色可能为深绿色；如果在第776和777碱基间存在15bp序列插入，则颜色可能为浅绿或白色；样品序列在目标位点为杂合状态，则果皮表皮可能为深绿色。
44.为此，本技术实施例公开了一种与苦瓜果皮颜色相关联的分子标记，所述分子标记为如seq id no.1所述的dna分子和/或如seq id no.2所述的dna分子。例如，采用1f和1r作为引物对对来自苦瓜的基因组dna样本进行pcr扩增，若扩增条带仅显示了如seq id no.1所述的dna分子，则该苦瓜样品的果皮颜色为深绿色。若扩增条带仅显示了如seq id no.2所述的dna分子，则该苦瓜样品的果皮颜色为浅绿或白色。若扩增条带同时显示了如seq id no.1和如seq id no.2所述的dna分子，则该苦瓜样品的果皮颜色为深绿色。
45.在一些实施例中，对来自苦瓜的基因组dna样本进行pcr扩增过程中，采用的pcr体系以20μl计包括：10μl pcr mix，0.5μl 1f引物，0.5μl 1r引物，8μl ddh2o，1μl dna。用于扩增的引物为1f/1r引物对，引物1f序列如seq id no.3所示和引物1r序列如seq id no.4所示。pcr程序设置如下：95℃预变性4min；94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸1分钟，共循环36次；最后72℃延伸5min。
46.针对上述变异位点，一些实施例还开发了直接对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检
测的分子标记，根据产物条带大小预测苦瓜样品嫩果果皮颜色。
47.本技术实施例公开了一种与苦瓜果皮颜色相关联的分子标记，所述分子标记为如seq id no.5所述的dna分子和/或如seq id no.6所述的dna分子。例如，若扩增条带仅显示了如seq id no.5所述的dna分子，则该苦瓜样品的果皮颜色为深绿色。若扩增条带仅显示了如seq id no.6所述的dna分子，则该苦瓜样品的果皮颜色为浅绿或白色。若扩增条带同时显示了如seq id no.5和如seq id no.6所述的dna分子，则该苦瓜样品的果皮颜色为深绿色。
48.在一些实施例中，还提供了对如seq id no.5所述的dna分子和/或如seq id no.6所述的dna分子进行pcr扩增的引物，所述引物包括如seq id no.7所示的dna分子(命名为2f)和如seq id no.8所示的dna分子(命名为2r)。
49.在一些实施例中，对来自苦瓜的基因组dna样本进行pcr扩增过程中，采用的pcr体系以20μl计包括：10μl pcr mix，0.5μl 2f引物，0.5μl 2r引物，8μl ddh2o，1μl dna。pcr程序设置如下：95℃预变性4min；94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸30s，共循环36次；最后72℃延伸5min。
50.在一些实施例中，利用2.5％的agar gel检测pcr产物，目标pcr产物在100～500bp的marker之间，可能出现大小116bp(如seq id no.5)或131bp(如seq id no.6)的条带(图4)。如样品具有单一的116bp大小的条带(如图4中，样品6、7、13、14和15)，则该样品的嫩果果皮颜色可能为深绿；如样品具有单一的131bp大小的条带(如图4中，样品1、2、3、5、8、9、10、11、12和16)，则该样品的嫩果果皮颜色可能为浅绿或白色果皮(白色或浅绿)；样品具有两条带，分别为131bp和116bp，如图4中，样品4)，则该样品的嫩果果皮颜色可能为深绿。
51.综合以上分析发现，苦瓜果皮颜色表型与该位点基因型一致，说明该位点可以用来预测苦瓜果皮颜色表型。由此，利用本技术提供的分子标记可在苗期或种子时期对苦瓜果皮颜色(浅绿或白色或深绿色)进行预测，可以鉴定出目标性状遗传位点的纯合或杂合状况，从而可对后代表型进行较准确的预测，使得其在苦瓜果皮颜色鉴定、育种以及种质资源改良中具有重要的应用前景。
52.以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种与苦瓜果皮颜色相关联的分子标记，所述分子标记包括如seq id no.1所示的dna分子和/或如seq id no.2所示的dna分子；或者所述分子标记包括如seq id no.5所示的dna分子和/或如seq id no.6所示的dna分子。2.根据权利要求1所述的分子标记，其中，若所述苦瓜的基因组携带如seq id no.1所示或如seq id no.5所示的核苷酸序列，则苦瓜果皮为深绿色；若所述苦瓜的基因组携带如seq id no.2所示或如seq id no.6所示的核苷酸序列，则苦瓜果皮为浅绿或白色。3.根据权利要求1所述的分子标记，若所述苦瓜的基因组携带如seq id no.1所示的核苷酸序列和如seq id no.2所示的核苷酸序列，则苦瓜果皮为深绿色；若所述苦瓜的基因组携带如seq id no.5所示的核苷酸序列和如seq id no.6所示的核苷酸序列，则苦瓜果皮为深绿色。4.用于扩增如权利要求1～3任一所述的分子标记的引物对，包括如seq id no.4～5所示的dna分子，或如seq id no.7～8所示的dna分子。5.用于检测或预测苦瓜果皮颜色的试剂盒，包括如权利要求4所述的引物对，以及用所述引物对进行pcr扩增的相关试剂。6.一种检测或预测苦瓜果皮颜色的方法，包括：提取苦瓜材料的基因组dna；采用如权利要求4所述的引物对对所述基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；电泳检测所述扩增产物，根据所述扩增产物的长度大小检测或预测所述苦瓜果皮颜色。7.根据权利要求6所述的方法，其中，若电泳结果仅具有单一的如seq id no.1或如seq id no.5所示大小的条带，则对应的苦瓜果皮颜色为深绿；若电泳结果仅具有单一的如seq id no.2或如seq id no.6所示大小的条带，则对应的苦瓜果皮颜色为白色或浅绿；若电泳结果包括的如seq id no.1和如seq id no.2的两个条带或者包括如seq id no.5和如seq id no.6所示大小的两个条带，则对应的苦瓜果皮颜色为深绿。8.权利要求1～3任一所述的分子标记、或权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在苦瓜果皮颜色鉴定中的应用。9.权利要求1～3任一所述的分子标记、或权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在苦瓜分子标记辅助育种中的应用。10.权利要求1～3任一所述的分子标记、或权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在苦瓜种质资源改良中的应用。

技术总结
本申请涉及苦瓜技术领域，具体公开了一种与苦瓜果皮颜色相关联的分子标记及其应用。该分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子，其多态性表现在该核苷酸序列的第776与777位之间是否存在15个碱基的插入。利用本申请提供的分子标记可在苗期或种子时期对苦瓜果皮颜色(浅绿或白色或深绿色)进行预测，可以鉴定出目标性状遗传位点的纯合或杂合状况，从而可对后代表型进行较准确的预测，使得其在苦瓜果皮颜色鉴定、育种以及种质资源改良中具有重要的应用前景。有重要的应用前景。有重要的应用前景。


技术研发人员：杨静 汪李平 汪自松
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/8/1