一种基于数字微滴PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物探针组合及其应用

一种基于数字微滴pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物探针组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及病毒分子检测技术领域，特别是涉及一种基于数字微滴pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物探针组合及其应用。


背景技术：

2.牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis,ibr)，又称“坏死性鼻炎”、“红鼻病”，由牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,bohv-1/ibrv)感染引起的，oie称为牛传染性鼻气管炎/牛传染性脓疱性阴户阴道炎，被世界动物卫生组织列为必须上报疫病之一，我国将其列为二类传染病。本病最早于1955年在美国的科罗拉多州肉牛中报道。在自然感染条件下，病毒主要感染牛，尤其以肉牛多见，其次是奶牛，临床表现形式多样，以呼吸道为主，伴有结膜炎、流产、乳腺炎，有时诱发小牛脑炎等。感染牛临床主要表现为体温升高，食欲减退和精神沉郁，随后伴有脓性鼻液和眼结膜炎，病毒感染也可导致产奶量下降和流产。急性ibrv呼吸道感染还可以继发细菌性肺炎。此病目前在世界范围内流行，对乳牛的产奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有较大影响。在自然交配地区，生殖器感染能导致外阴阴道炎和龟头包皮炎，是造成养牛业经济损失的重要疫病之一。因为ibrv感染后一般发生病毒潜伏，在牛群内长期排毒，所以，鉴定血清学中阳性动物筛查动物感染状态是较为理想的指标。
3.bohv-1是带有囊膜的球形病毒"病毒粒子直径130nm-180nm，病毒由囊膜&衣壳和核心三部分组成"核心由蛋白质与双股线状dna缠绕而成。bohv-1病毒基因组dna为双股线性分子。g+c含量为72％。基因组外包有核衣壳，形成正二十面体立体对称结构，外观呈六角形，有162个壳粒，周围为一层含脂质的囊膜。bohv-1对温度很敏感，在37℃经10h有一半病毒失去活性，在56℃经21min可使病毒灭活。病毒在ph4.5～5不稳定，4℃以下病毒较稳定，保存30d感染滴度几乎无变化。在－70℃保存的病毒经过几年仍能保持活力年。病毒对丙酮、酒精和乙醚等脂溶剂敏感，5％naoh、1％漂白粉、1％酚0.01％hcl2可使病毒在数秒钟内灭活。bohv-1病毒只有一个血清型，通过病毒dna酶切图谱可以区分各亚型或病毒之间的差异。据测bohv-1基因组可编码大约70个蛋白质，其主要蛋白有gb、gc、gd和ge四个主要糖蛋白及tk基因，结构和功能目前大部分已知。通常情况下鉴定血清学中阳性动物是检查动物感染状态非常有用而且理想的指标，抗体阳性动物可认为是病毒携带动物和潜在的排毒者，国内目前大型养牛场有使用牛传染性鼻气管炎灭活疫苗，或者幼畜通过吸食初乳获得母源抗体，所以依靠血清抗体对疫病筛查需结合具体情况进行分析，最后的临床诊断仍需要病原的检测。ibr是牛场临床常见病，属于多发病，另外bohv-1感染还会造成免疫抑制，增加了牛继发感染其他病毒或细菌的几率，给养牛业造成综合性影响。牛群中bohv-1的筛查及疫病的净化对于牛场健康良性发展尤为重要。bohv-1基因组gc含量平均75％左右，常规pcr方法对的病原检测具有一定局限性。为了及时发现牛群中病毒携带者，尤其是隐性带毒动物，有效控制病毒在牛群中的传播，建立快速、敏感、准确的牛传染性鼻气管炎病毒检测
方法十分必要。目前临床上用于检测bohv-1病毒核酸的方法主要为pcr、实时荧光pcr，依赖于taqman探针技术的实时荧光pcr虽然具有高特异性和敏感性，但定量准确性易受样本基质及干扰物质的影响，同时其检测下限仍很高，暂时不能检测出微量的病毒。
4.数字pcr其技术原理是利用数字pcr系统核心的微滴化技术将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量pcr的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化pcr(droplet digital pcr，ddpcr)。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的pcr反应器。随后微滴转移至96孔pcr板上，开展终点pcr扩增。采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量pcr相比，数字pcr的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字pcr技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量凭借数字的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1,000,000的靶分子。
5.因此，开发相关利用数字微滴pcr对牛传染性鼻气管炎病毒(bohv-1)进行绝对定量的检测方法和试剂盒对流行病学调查、疫情监控、口岸检验检疫、疫病净化及动物卫生生物安全保障领域具有重大意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种基于数字微滴pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物探针组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种基于数字微滴pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物组，所述引物组由如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物组成。
9.本发明提供一种基于数字微滴pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒的探针，所述探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述探针的5'端修饰有发光的报告荧光基团fam，3'端修饰有荧光淬灭基团bhq1。
10.优选的是，所述引物组和所述探针用于扩增牛传染性鼻气管炎病毒的gb基因
11.本发明还提供一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组和/或所述的探针。
12.优选的是，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。
13.优选的是，所述试剂盒中还包括酶和反应液。
14.优选的是，所述阳性对照品为拷贝数为(1.14
±
0.19)
×
104copies/μl的牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv-lnm)核酸标准物质；所述阴性对照品为ddh2o。
15.本发明提供的试剂盒配合数字微滴pcr，能够实现对待测样本中目的基因的绝对定量，其定量结果直接为目的基因拷贝数(对应病毒个数)而非ct值，所得结果较为准确，能够为病程和疗效的判读提供量化的核酸水平依据。
16.添加阳性对照标准品和阴性对照品能够进一步验证试剂盒的检测结果是否可靠，确认在使用试剂盒过程中是否有其他元素的干扰。
17.本发明还提供一种非疾病诊断目的的检测牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括：将所述的引物组和/或所述的探针、待测样品、酶和反应缓冲液混合，制备数字微滴，然后将微滴转入pcr仪中进行扩增，再使用微滴分析仪检测扩增后的微滴，得到所述待测样品的检测结果，当检测结果≥3.3个拷贝时，判定为阳性。
18.优选的是，所述pcr扩增反应的反应体系包括：ddpcrsupermix 10μl、ddh2o 5.7μl、引物1.8μl、模板2μl和荧光探针0.5μl；
19.反应程序：95℃10min；94℃30秒，55℃60秒，40个循环；98℃10min；12℃60min。
20.优选的是，所述引物的浓度为900nmol/l；所述探针的浓度为250nmol/l。
21.本发明中，在使用试剂盒时，只有在阳性对照中目的基因(1.14
±
0.19)
×
104copies/μl个拷贝，且阴性对照中目的基因0个拷贝，同时满足上述两个条件才能证明在实验过程中没有遭受其他污染，检测结果具有可靠性。
22.本发明还提供所述的引物组和所述的探针在制备检测牛传染性鼻气管炎病毒产品中的应用。
23.优选的是，所述产品包括试剂或者试剂盒。
24.本发明公开了以下技术效果：
25.(1)本发明提供的引物、探针组合是针对病毒gb基因保守区域设计的特异性引物和探针，能够检测出牛传染性鼻气管炎病毒，对与牛传染性鼻气管炎病毒易引起相同或相似的临床症状、采样部位或易并发的其他微生物如牛呼吸道合胞体病毒(brsv)、牛副流感病毒3型(bpiv3)、牛冠状病毒(bcv)、牛传染性鼻气管炎病毒(bohv-1)病毒等均无交叉反应，检测结果特异性较好；
26.(2)本发明提供的检测试剂盒的检测结果较为可靠，可排除复杂样本对于实验结果的干扰，其检测结果不受pcr抑制物的影响，可避免由于样本复杂性导致的pcr假阴性或假阳性，尤其适用于检测成分复杂的粪便样本或其他复杂样本，也可适用于检测基质成分复杂的环境样本等；
27.(3)本发明所述的检测方法具有高灵敏度，可以对样本进行绝对定量，其定量结果直接为目的基因拷贝数(对应病毒个数)而非ct值，为病程和疗效的判读提供量化的核酸水平依据，本发明所述的方法在4个拷贝的模板量下，可以检测出区别于无模板对照的拷贝数，即所述方法在扩增体系为20μl时，最低可检测到4个拷贝的目的基因。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为实施例1中目的基因gb的引物探针筛选；
30.图2为实施例1中目的基因gb的检测条件优化示意图；
31.图3为实施例1中目的基因gb的检测退火温度优化结果示意图；
32.图4为实施例1中目的基因gb的检测升降温速度优化结果示意图，其中升降温速度摸索了1℃/s(a)，2.5℃/s(b)和5℃/s(c)；
supermix反应缓冲液(规格为500μl/管)，均来伯乐生物科技有限公司；
55.所述阳性对照品中含有牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv-lnm)核酸标准物质；阴性对照品为ddh2o。
56.实施例3
57.验证实施例2中提供的试剂盒的具体操作步骤为：
58.1.数字微滴pcr扩增反应
59.(1)配制数字微滴pcr反应液
60.数字微滴pcr反应液20μl配方为：ddpcrsupermix 10μl，模板2μl，引物1.8μl，探针0.5μl，用水补齐至20μl配制体系，其中引物浓度为900nmol/l和探针的起始浓度均为250nmol/l；
61.(2)在微滴pcr的生成芯片上，加入步骤(1)中的20μl微滴pcr反应体系，再加入50μl的微滴生成用油，启动芯片装载仪涂抹芯片，进行微滴生成步骤，完成后封膜；
62.(3)封膜后将芯片插入到芯片装载机上的紫外固化处固片，然后将芯片二维码朝前，放置于proflex 2x flat pcr sys-tem仪器中进行pcr扩增；
63.反应程序：95℃，10min；94℃30秒，55℃60秒，40个循环；98℃10min；12℃60min。升降温速度2.5℃/s；
64.(4)反应结束后，将芯片取出，置于qs 3d仪器中自动读取芯片结果，最后利用qs 3d analysissuit software软件对二级数据进行分析
65.实施例4
66.验证实施例2中提供的试剂盒的检测特异性。具体操作步骤为：
67.本实施例中使用的待测样本包括：
68.牛呼吸道合胞体病毒(brsv)、牛副流感病毒3型(bpiv3)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)病毒核酸提取物进行检测，上述病毒均为与牛传染性鼻气管炎病毒具有引起相同或相似的临床症状、采样部位相同或易并发的病毒；同时设置阴性对照和阳性对照。最终检测结果如图5所示，阳性标准品对照和bohv-1扩增后有阳性微滴，而阴性对照、brsv、bpiv3、bvdv基因组均呈阴性反应。
69.通过实施例3中给出的检测方法进行检测。本实施例中仅在阳性对照标准物及阳性样品中检测到阳性微滴，其余组均无扩增信号，说明本发明提供的bohv-1数字微滴pcr引物和探针具备很强的特异性。
70.实施例5
71.验证实施例2中提供的试剂盒的检测敏感性和重复性。具体操作步骤为：
72.通过实施例3中给出的检测方法进行检测。将10倍倍比稀释的已制备好的含有bohv-1阳性标准物质病毒核酸梯度稀释10-0
，10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，每个浓度做3个重复检测，分别进行微滴式数字pcr检测。在同一份样品中，重复取样8次，每次2μl，使用数字pcr检测。最后计算变异系数为0.70％。结果表明，数字pcr方法重复性好，检测结果稳定、可靠，最终检测结果如图6所示。
73.实施例6
74.检测临床样本检测。
75.对于牛传染性鼻气管炎病毒(bohv-1)核酸提取采用如下方法：
76.使用天根生化科技北京有限公司生产的病毒基因组dna/rna提取试剂盒(货号：dp315)对牛鼻咽拭子样本进行核酸提取。取200μl样本处理液，按照提取试剂盒的说明书进行病毒核酸提取，最终溶解于50μl无rna酶水中，并对该阳性样品进行梯度稀释。
77.通过实施例3中给出的检测方法进行检测。
78.检测结果如图7所示，结果显示，在数字微滴pcr反应液20μl配方下，当阳性样品中含有3.3个拷贝的模板量下，可以检测出区别于无模板对照的拷贝数，即本数字微滴pcr的检测方法在扩增体系为20μl时，最低可检测到为3.3个拷贝。检测结果如图7所示。
79.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种基于数字微滴pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物组，其特征在于，所述引物组由如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物组成。2.一种基于数字微滴pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述探针的5'端修饰有发光的报告荧光基团fam，3'端修饰有荧光淬灭基团bhq1。3.一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和/或权利要求2所述的探针。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为拷贝数为(1.14
±
0.19)
×
104copies/μl的牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv-lnm)核酸标准物质；所述阴性对照品为ddh2o。6.一种非疾病诊断目的的检测牛传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的引物组和权利要求2所述的探针、待测样品、酶和反应缓冲液混合，制备数字微滴，然后将微滴转入pcr仪中进行扩增，再使用微滴分析仪检测扩增后的微滴，得到所述待测样品的检测结果，当检测结果≥3.3个拷贝时，判定为阳性。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增反应的反应体系包括：ddpcrsupermix 10μl、ddh2o 5.7μl、引物1.8μl、模板2μl和荧光探针0.5μl；反应程序：95℃10min；94℃30秒，55℃60秒，40个循环；98℃10min；12℃60min。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物的浓度为900nmol/l；所述探针的浓度为250nmol/l。9.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的探针在制备检测牛传染性鼻气管炎病毒产品中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或者试剂盒。

技术总结
本发明公开了一种基于数字微滴PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物探针组合及其应用，属于病毒分子检测技术领域。本发明所述引物由如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的引物和探针是针对病毒gB基因保守区域设计的特异性引物和探针，特异性好、灵敏度高，尤其适用于检测成分复杂的粪便样本或其他复杂样本，也可适用于检测基质成分复杂的环境样本，在扩增体系为20μL时，最低可检测到为3.3个拷贝的目的基因。因。因。


技术研发人员：郭利 赵立峰 薛力刚 钟伟 叶京飞 陈强 孙娜 张妍
受保护的技术使用者：吉林农业科技学院
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/1