加兰他敏联用组合物及其应用

1.本发明属于天然药物技术领域，具体涉及加兰他敏联用组合物及其应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默症(alzheimer
′
s disease，ad)是一种以记忆力丧失、认知能力下降为主要特征，并伴有不可逆转的神经元丧失的神经元退行性疾病，多发于65岁以上的老人。乙酰胆碱酯酶(ache)作为生物神经传导中的关键酶，能催化神经递质乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸，从而阻断神经信号的传递。所以ache活力升高会导致乙酰胆碱水平降低，而乙酰胆碱水平降低是ad的关键病因，因此抑制ache活力、提高乙酰胆碱水平是治疗ad的重要方法。目前美国食品药品监督管理局批准用于治疗ad的乙酰胆碱酯酶抑制剂(achei)主要有他克林(tacrine)，多奈哌齐(donepezil)，利凡斯的明(rivastigmine)和加兰他敏(galantamine)。这几种药物除加兰他敏外，其他三种均为合成药物，合成类药物虽有一定的治疗效果，但是存在活性较低、选择性低、副作用大等问题。与合成药物相比，来源于天然植物的加兰他敏能选择性抑制ache，选择性强，作用时间长，但是其存在抑酶作用弱等缺点。而且，单一药物的持续使用，也会产生一定副作用和耐受性，致使加兰他敏在长久使用中的治疗效果变低。
3.当前，关于阿尔茨海默症的新药研发速度较慢。在无更多更优的新药可供选择的情况下，讨论活性分子的联用具有重要意义。活性分子联用的最终目的是为了提高效果、减小剂量、降低毒副作用以及避免或延缓抗性的产生。然而，目前关于活性分子间的协同增效作用，尤其涉及加兰他敏的联用方案，其报道尚少。因此，关于加兰他敏联用方案的开发，对于改善人类阿尔茨海默症疾病具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种加兰他敏组合物，由加兰他敏和化合物a组成；其中，化合物a选自egcg或萹蓄苷；当化合物a为egcg时，egcg和加兰他敏的质量比选自80∶0.2～100∶0.1；当化合物a为萹蓄苷时，萹蓄苷和加兰他敏的质量比选自150∶0.2～200∶0.1。
5.上述加兰他敏组合物对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用，基于此，本发明提供了上述加兰他敏组合物在制备具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的药物中的应用。
6.本领域技术人员知晓，乙酰胆碱酯酶与阿尔茨海默症密切相关，基于此，本发明提供了上述加兰他敏组合物在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。
7.在上述加兰他敏组合物中，当egcg和加兰他敏在质量比为80∶0.2～80∶0.1时，两者之间在乙酰胆碱酯酶抑制方面存在协同作用；当萹蓄苷和加兰他敏的质量比为150∶0.2～150∶0.1时，两者之间在乙酰胆碱酯酶抑制方面存在协同作用。基于此，在具体的实施方案中，本发明提供的加兰他敏组合物，是由egcg和加兰他敏按质量比80∶0.2～80∶0.1组成；或者，是由萹蓄苷和加兰他敏按质量比150∶0.2～150∶0.1组成。
8.在一个具体的实施方案中，本发明所述的加兰他敏组合物，是由egcg和加兰他敏
按质量比80∶0.1组成；或者，是由萹蓄苷和加兰他敏按质量比150∶0.1组成。
9.根据上述内容，可相应地提供一种具有乙酰胆碱酯酶协同抑制作用的药物，该药物含有上述加兰他敏组合物。所述药物包含药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质，并可以按需求的不同制备成相应的粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液以及片剂等剂型。
10.本发明的有益效果为：
11.本发明所述组合物能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性，从而达到治疗阿尔茨海默症的效果。组合物中各成分之间存在协同增效作用。各成分之间的联合用药，能够大大降低各成分在单独用药时的剂量，降低药物的毒副作用，而且可以取得协同治疗的效果。因此，在达到相应治疗阿尔茨海默症效果时，联合用药可以有效降低机体耐药的发生，具有较好的医学应用前景。
附图说明
12.图1为egcg和加兰他敏的组合物(80∶0.1)对乙酰胆碱酯酶的fa-ci趋势图；
13.图2为萹蓄苷和加兰他敏的组合物(150∶0.1)对乙酰胆碱酯酶的fa-ci趋势图。
具体实施方式
14.egcg，分子式为c
22h18o11
；分子量：458.38；cas登录号：989-51-5，结构式为：
[0015][0016]
萹蓄苷(avicularin)，分子式为c
20h18o11
；分子量：434.35；cas登录号：572-30-5，结构式：
[0017][0018]
加兰他敏(galanthamine)，分子式为c
17h21
no3；分子量：287.35；cas登录号：357-70-0，结构式为：
[0019][0020]
本发明中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0021]
实施例1
[0022]
乙酰胆碱酯酶活性的体外抑制试验，步骤如下：
[0023]
将试验对象溶于二甲基亚砜(dmso)，配置成10mg/ml的母液。用pbs对母液进行稀释(稀释后，dmso含量小于5％)，设置浓度梯度。从各梯度取10μl作为待测样品。向待测样品中加入40μl的pbs和10μl的乙酰胆碱酯酶(0.25u/ml)，加样混匀后，加入20μl反应底物硫代碘代乙酰胆碱(1.05mm)，37℃恒温培养30min，每孔加入30μl十二烷基磺酸钠(4％)，再加入100μl的5，5-二硫双(2-硝基苯甲酸)(1.5mm)溶液显色后，在酶标仪405nm波长处进行测定，获取od值。根据od值计算各梯度下的乙酰胆碱酯酶活性抑制率，抑制率＝[1-(od
样品-od
样品空白
)/(od
阴性对照-od
空白
)]
×
100％。根据各梯度下的乙酰胆碱酯酶活性抑制率，计算试验对象的半抑制浓度(ic
50
值)，计算和统计过程采用spss 20.0。
[0024]
上述操作步骤中，具体地，各组表示为，样品组：10μl待测样品+40μl pbs+10μl酶；样品空白组：10μl待测样品+50μl pbs；阴性对照组：50μl pbs+10μl酶；空白组：60μl pbs。
[0025]
试验对象包括egcg、萹蓄苷、加兰他敏以及由egcg和加兰他敏、萹蓄苷和加兰他敏以不同质量比组成的组合物。
[0026]
实验仪器与试剂有：乙酰胆碱酯酶(type v-s ec3.1.1.7，c2888)，5，5-二硫双(2-硝基苯甲酸)[5，5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，d8130]，底物硫代碘代乙酰胆碱(acetylthiocholine iodide，01480)和加兰他敏购自sigma公司；egcg和萹蓄苷(北京索莱宝)；millipore simplicity水纯化系统(millipore，法国)，磷酸钠盐缓冲液(ph 6.8，0.1mol/l)，酶标仪tecan infinite m200 pro(teacan group ltd.，swizerland)。
[0027]
具体地，以egcg、萹蓄苷和加兰他敏为试验对象，采用上述方法测试各试验对象对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，以半抑制浓度ic
50
值表示。
[0028]
各试验对象的浓度梯度设置，如下：egcg：100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml；萹蓄苷：200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml；加兰他敏：0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml。
[0029]
试验结果如表1所示。
[0030]
表1
[0031][0032]
数据源自三次独立实验的结果，表示为“平均值
±
标准差”.
[0033]
实施例2
[0034]
以egcg和加兰他敏的组合物为试验对象，采用实施例1中的方法测试各试验对象对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，以半抑制浓度ic
50
值表示。
[0035]
各试验对象具体为：egcg和加兰他敏(80∶0.2)、egcg和加兰他敏(80∶0.1)以及egcg和加兰他敏(100∶0.1)，上述比例均为质量比。
[0036]
各试验对象的浓度梯度设置，如下：egcg和加兰他敏(80∶0.2)：(80+0.2)μg/ml、(40+0.1)μg/ml、(20+0.05)μg/ml、(10+0.025)μg/ml；egcg和加兰他敏(80∶0.1)：(80+0.1)μg/ml、(40+0.05)μg/ml、(20+0.025)μg/ml、(10+0.0125)μg/ml；egcg和加兰他敏(100∶0.1)：(100+0.1)μg/ml、(50+0.05)μg/ml、(25+0.025)μg/ml、(12.5+0.0125)μg/ml。
[0037]
浓度梯度设置原则：以egcg和加兰他敏(80∶0.1)为例，将组合物初始浓度设置为80.1μg/ml，即，组合物样品溶液中egcg的初始浓度为80μg/ml，加兰他敏的初始浓度为0.1μg/ml。在初始浓度80.1μg/ml的基础上，对组合物样品溶液依次进行2倍稀释，依次为80.1μg/ml、40.05μg/ml、20.025μg/ml、10.0125μg/ml。同理，在egcg和加兰他敏(80∶0.2)的组合物中，组合物初始浓度设置为80.2μg/ml，依次稀释2倍形成浓度梯度。其它组合物亦遵循这一原则。
[0038]
试验结果如表2所示。
[0039]
表2
[0040][0041]
数据源自三次独立实验的结果，表示为“平均值
±
标准差”。
[0042]
由表1和表2可知：egcg和加兰他敏的联合使用，在达到相似抑制率的情况下，能够显著降低各成分在单独用药时的剂量，提高对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。尤其是两者的质量比为80∶0.1时，效果更为明显。
[0043]
实施例3
[0044]
以萹蓄苷和加兰他敏的组合物为试验对象，采用实施例1中的方法测试各试验对象对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，以半抑制浓度ic
50
值表示。
[0045]
各试验对象具体为：萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.2)、萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.1)以及萹蓄苷和加兰他敏(200∶0.1)，上述比例均为质量比。
[0046]
各试验对象的浓度梯度设置，如下：萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.2)：(150+0.2)μg/ml、(75+0.1)μg/ml、(37.5+0.05)μg/ml、(18.75+0.025)μg/ml；萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.1)：(150+0.1)μg/ml、(75+0.05)μg/ml、(37.5+0.025)μg/ml、(18.75+0.0125)μg/ml；萹蓄苷和加兰他敏(200∶0.1)：(200+0.1)μg/ml、(100+0.05)μg/ml、(50+0.025)μg/ml、(25+0.0125)μg/ml。
[0047]
浓度梯度设置原则：以萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.1)为例，将组合物初始浓度设置为150.1μg/ml，即，组合物样品溶液中萹蓄苷的初始浓度为150μg/ml，加兰他敏的初始浓度为0.1μg/ml。在初始浓度150.1μg/ml的基础上，对组合物样品溶液依次进行2倍稀释，依次为150.1μg/ml、75.05μg/ml、37.525μg/ml、18.7625μg/ml。同理，在萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.2)的组合物中，组合物初始浓度设置为150.2μg/ml，依次稀释2倍形成浓度梯度。其它组合物亦遵循这一原则。
[0048]
试验结果如表3所示。
[0049]
表3
[0050][0051]
数据源自三次独立实验的结果，表示为“平均值
±
标准差”.
[0052]
由表1和表3可知：萹蓄苷和加兰他敏的联合使用，在达到相似抑制率的情况下，能够显著降低各成分在单独用药时的剂量，提高对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。尤其是两者的质量比为150∶0.1时，效果更为明显。
[0053]
联合用药系数的测定
[0054]
对实施例2和实施例3中组合物的联合用药系数(ci)进行测定，根据软件compusyn计算出ci值，并对药物间的协同作用做出评价。
[0055]
组合物的联合用药系数依赖于组合物在不同浓度梯度下的抑制率，以及组合物中各单体化合物在不同浓度梯度下的抑制率，因此，在测定组合物联合用药系数时，需要对组合物中各单体化合物进行浓度梯度设置，以获取相应的抑制率。
[0056]
以实施例2中egcg和加兰他敏(80∶0.1)为例，组合物初始浓度设置为80.1μg/ml，egcg的初始浓度为80μg/ml，加兰他敏的初始浓度为0.1μg/ml；因此，egcg的梯度浓度设置，是在初始浓度80μg/ml的基础上，依次进行2倍稀释，依次为80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml；加兰他敏的梯度浓度设置，是在初始浓度0.1μg/ml的基础上，依次进行2倍稀释，依次为0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml、0.0125μg/ml。
[0057]
将egcg、加兰他敏、egcg和加兰他敏(80∶0.1)在不同浓度梯度下的抑制率进行统计，结果如下：
[0058]
egcg在浓度梯度下的抑制率依次为14.5
±
1.1％、24.2
±
1.3％、31.5
±
3.1％、49.1
±
2.6％(由低浓度到高浓度)，加兰他敏在浓度梯度下的抑制率依次为12.1
±
1.3％、23.4
±
1.2％、39.2
±
2.2％、51.2
±
2.6％(由低浓度到高浓度)，egcg和加兰他敏(80∶0.1)在浓度梯度下的抑制率依次为32.2
±
2.1％、48.4
±
1.6％、65.8
±
3.3％、82.1
±
5.3％(由低浓度到高浓度)。
[0059]
采用compusyn软件对上述数据进行处理，获得egcg和加兰他敏(80∶0.1)组合物中egcg和加兰他敏的ci值，如表4所示。从而可以得出egcg和加兰他敏(80∶0.1)组合物抑制乙酰胆碱酯酶的fa-ci趋势，如图1所示。
[0060]
以实施例3中萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.1)为例，组合物初始浓度设置为150.1μg/ml，萹蓄苷的初始浓度为150μg/ml，加兰他敏的初始浓度为0.1μg/ml；因此，萹蓄苷的梯度
浓度设置，是在初始浓度150μg/ml的基础上，依次进行2倍稀释，依次为150μg/ml、75μg/ml、37.5μg/ml、18.75μg/ml；加兰他敏的梯度浓度设置，是在初始浓度0.1μg/ml的基础上，依次进行2倍稀释，依次为0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml、0.0125μg/ml。
[0061]
将萹蓄苷、加兰他敏、萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.1)在不同浓度梯度下的抑制率进行统计，结果如下：
[0062]
萹蓄苷在浓度梯度下的抑制率依次为15.3
±
1.1％、21.5
±
1.2％、35.2
±
1.8％、48.5
±
2.2％(由低浓度到高浓度)，加兰他敏在浓度梯度下的抑制率依次为12.1
±
1.3％、23.4
±
1.2％、39.2
±
2.2％、51.2
±
2.6％(由低浓度到高浓度)，萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.1)在浓度梯度下的抑制率依次为25.4
±
1.6％、40.5
±
2.1％、60.2
±
2.5％、72.5
±
3.3％(由低浓度到高浓度)。
[0063]
采用compusyn软件对上述数据进行处理，获得萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.1)组合物中萹蓄苷与加兰他敏的ci值，如表4所示。从而可以得出萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.1)组合物抑制乙酰胆碱酯酶的fa-ci趋势，如图2所示。
[0064]
同理，其它组合物，包括egcg和加兰他敏(80∶0.2)、egcg和加兰他敏(100∶0.1)、萹蓄苷和加兰他敏(150∶0.2)和萹蓄苷和加兰他敏(200∶0.1)，各单体化合物的浓度梯度设置以及ci值的计算等，均以上述原则为标准。
[0065]
测定结果如表4所示：
[0066]
表4
[0067][0068]
数据源自三次独立实验的结果，表示为“平均值
±
标准差”.
[0069]
由表4可知：(1)egcg和加兰他敏的联合使用，在两者的质量比为80∶0.2时，其联合用药系数ci小于1，表现出了协同作用，说明两者在质量比为80∶0.2时表现出协同作用，联合用药指数均值(ci
avg
)为0.71。在两者的质量比为80∶0.1时，其中，gi
50
、gi
75
和gi
90
均小于0.60，说明两者在质量比为80∶0.1时表现出强协同作用，联合用药指数均值(ci
avg
)为0.45。在两者的质量比为100∶0.1时，其联合用药系数ci大于1，表现出了拮抗作用。(2)萹蓄苷和加兰他敏的联合使用，在两者的质量比为150∶0.2时，其联合用药系数ci小于1，表现出了协同作用，联合用药指数均值(ci
avg
)为0.88。在两者的质量比为150∶0.1时，其中，gi
75
和gi
90
均小于0.75，说明两者在质量比为150∶0.1时表现出较强的协同作用，联合用药指数均值(ci
avg
)为0.71。在两者的质量比为200∶0.1时，其联合用药系数ci大于1，表现出了拮抗作用。
[0070]
对比例
[0071]
除了上述实施案例外，本发明还提供了在组合物联用筛选过程中无法与加兰他敏形成协同作用的其它案例情形，在这些案例情形中，化合物a涉及山奈酚、槲皮素、桑色素和
根皮素。这些案例情形仅仅是本发明在创造之时的工作量的一部分。如下所示：
[0072]
首先，根据上述实施例中的方法测试各单体化合物对乙酰胆碱酯酶的ic
50
值，如下述表5所示：
[0073]
表5
[0074][0075][0076]
然后，取接近于各单体化合物ic
50
值的值，测定其乙酰胆碱酯酶抑制率，如表6所示：
[0077]
表6
[0078]
化合物质量浓度(μg/ml)抑制率山奈酚20048.1
±
1.8％槲皮素20052.2
±
3.4％桑色素2054.2
±
2.8％根皮素5047.2
±
3.2％
[0079]
将上述各单体化合物与加兰他敏组合，测定组合物的乙酰胆碱酯酶抑制率，如下述表7所示：
[0080]
表7
[0081][0082]
由表7可知，上述各单体化合物在与加兰他敏组合后，其组合物抑制率直接低于单个化合物作用抑制率，该组合物实际表现为拮抗作用，无协同作用。
[0083]
此外，本发明还测试了egcg和萹蓄苷在80∶150的质量浓度比例下的乙酰胆碱酯酶抑制率，其结果显示，组合物的抑制率为43.3
±
2.1％，均低于egcg和萹蓄苷单独对乙酰胆碱酯酶的抑制率(分别为49.1
±
2.6％和48.5
±
2.2％)，这说明，egcg和萹蓄苷之间实际也存在拮抗作用。
[0084]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种加兰他敏组合物，其特征在于，由加兰他敏和化合物a组成；其中，化合物a选自egcg或萹蓄苷；当化合物a为egcg时，egcg和加兰他敏的质量比选自80∶0.2～100∶0.1；当化合物a为萹蓄苷时，萹蓄苷和加兰他敏的质量比选自150∶0.2～200∶0.1。2.根据权利要求1所述的加兰他敏组合物，其特征在于，所述egcg和加兰他敏的质量比为80∶0.1；所述萹蓄苷和加兰他敏的质量比为150∶0.1。3.权利要求1或2所述加兰他敏组合物在制备具有乙酰胆碱酯酶协同抑制作用的药物中应用。4.权利要求1或2所述加兰他敏组合物在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。5.一种具有乙酰胆碱酯酶协同抑制作用的药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1或2所述的加兰他敏组合物。6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质。7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。

技术总结
本发明公开了加兰他敏联用组合物及其应用，属于天然药物技术领域。本发明的组合物，由EGCG、加兰他敏，或萹蓄苷、加兰他敏组成，其中，EGCG和加兰他敏的质量比选自80∶0.2～100∶0.1；萹蓄苷和加兰他敏的质量比选自150∶0.2～200∶0.1。本发明的组合物对乙酰胆碱酯酶具有明显的协同抑制作用，从而能够在阿尔茨海默症的治疗中，有效降低各成分在单独用药时的剂量，降低药物的毒副作用，以及降低机体耐药的发生，具有较好的医学应用前景。具有较好的医学应用前景。具有较好的医学应用前景。


技术研发人员：熊鑫 张强 刘亚芳
受保护的技术使用者：江西省、中国科学院庐山植物园
技术研发日：2023.05.06
技术公布日：2023/8/1