一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的组合物及应用

1.本发明涉及酸土脂环酸芽孢杆菌培养技术领域，更具体地说是涉及一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的组合物及应用。


背景技术：

2.酸土脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus acidoterrestris)主要存活于土壤及酸性果汁产品中，在低ph和高温条件下能够生存，可污染果汁生产中的半成品和生产材料，包括果汁和加工用水等，导致酸性果汁在货架期发生腐败变质，该菌的代谢产物会使产品产生药味和腐败味等异味，影响果汁风味，从而使产品丧失原有的商品价值。1998年的美国食品加工商协会(nfpa)报告显示，35％的果汁污染与嗜酸芽孢杆菌有关，而引起酸性果汁腐败的嗜酸芽孢杆菌主要是酸土脂环酸芽孢杆菌。该菌属最早在巴氏灭菌苹果汁中发现，随后相继在橙汁、菠萝汁、西番莲汁、葡萄汁、芒果汁及罐装番茄丁等产品中检出酸土脂环酸芽孢杆菌。所以，为了研究酸土脂环酸芽孢杆菌，对其进行培养是研究该菌株的前提。
3.目前培养酸土脂环酸芽孢杆菌的培养基中含有的酵母浸粉等复杂成分，来源不明，加工工艺混乱，缺乏统一的质量控制标准，导致成品的批间差异较大，可变因素多，质量难以控制，进而会影响对于酸土脂环酸芽孢杆菌营养代谢、蛋白组学、外泌体等诸多试验结果的准确性。
4.因此，研制由分子结构清晰、可溯源的纯化学合成食品微生物参比培养基，构建客观、准确、可操作性强的培养基评价体系是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的组合物及应用，通过单因素试验，运用邓肯多重比较法，研制的培养基由已知分子结构和纯度的化学物质配制而成，用化学物质替代了天然成分，添加多种维生素、氨基酸等生长因子，可有效代替酵母浸粉等复杂成分，为准确研究酸土脂环酸芽孢杆菌的营养代谢、蛋白组学等提供了理论基础。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的组合物，包括：对氨基苯甲酸0.2mg/l、肌醇1mg/l、组氨酸30mg/l、谷氨酰胺600mg/l、谷氨酸20mg/l、羟基脯氨酸20mg/l、蛋氨酸60mg/l、vb1100mgl、vb61mg/l、vb
11
2mg/l。
8.本发明培养基明显的优势是去除了成分复杂的酵母浸粉后酸土脂环酸芽孢杆菌仍能正常，并保持与正常培养基相似的生长趋势，可以减少未知成分对于后续提取细胞生长代谢物等试验结果的影响。
9.上述组分达到的技术效果是：谷氨酰胺能够参与核酸和蛋白质的合成、为细胞提供能源和氮源，是细胞快速增殖优先选择的能量供体，细胞的atp以及核酸和蛋白质的合成需要谷氨酰胺，因此，谷氨酰胺被认为是目前所知道的最重要的氨基酸之一，属于条件性必
需氨基酸。蛋氨酸是真核生物蛋白质合成的起始氨基酸，在蛋白质的结构和新陈代谢中都发挥着独特的作用，是一种常见的含硫氨基酸。从蛋氨酸的分子结构可知，蛋氨酸含有与硫原子共价键合的甲基，甲基和硫基对蛋氨酸结构特征和代谢功能至关重要。脯氨酸化学名称为吡咯烷酮羧酸，是构成蛋白质的20种基本氨基酸中唯一的亚氨基酸，亲水力极强，是一种天然的渗透保护剂和抗氧化剂，或作为分子伴侣保护蛋白质的完整性及多种酶的活性。革兰氏阴性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、克雷伯菌及革兰氏阳性枯草芽孢杆菌均可以用脯氨酸作为唯一氮源或碳源，外源脯氨酸经脯氨酸透性酶(proline permease)催化的na
+
/脯氨酸同向转运，进入细胞后被降解为谷氨酸，进而可以参与重要的生化反应。
10.对氨基苯甲酸(paba)是b族维生素的一种，是氨基芳香酸类维生素，被称为维生素bx。在微生物学领域，其主要的生物学作用是促进微生物的生长，作用机理是微生物利用paba合成四氢叶酸，后者不仅是许多酶促反应的h
+
的传递体，而且也是胸腺嘧啶核苷酸的前体，因此paba是微生物的生长因子。paba是微生物必需的生长因子，具有促进微生物生长的作用，并非含量越多促生长的效果越好。叶酸也称为维生素b11，在嘌呤、胸腺嘧啶、泛酸、甘氨酸、丝氨酸和蛋氨酸的合成过程中作为一种碳转移反应的辅因子，参与了很多重要的代谢反应，如甲基化循环、氨基酸代谢和核苷酸的生物合成等。叶酸参与基本的细胞生命活动，如氨基酸代谢和dna复制修复，对于细胞分裂是必不可少的。又与dna的合成有密切关系，因此在生物生命活动中起着不可或缺的作用。叶酸缺乏会损坏sac网络，从而导致细胞发生有丝分裂的异常与非整倍性，硫胺素(thiamine，ttp)也称维生素b1，是生物体必需的一种维生素，在柠檬酸循环、糖酵解和戊糖磷酸途径等代谢过程中起到辅酶的作用。v
b1
作为生物体内参与能量代谢的多种酶的辅因子，能提升碳代谢途径中酶的活性，在生物体的碳代谢循环中起到了非常重要的作用。
11.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的组合物在制备促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的培养基中的应用。
12.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的培养基，包括基础培养基和所述的组合物。
13.优选地，所述培养基具体包括：葡萄糖4.0g/l、mgso4·
7h2o 1.0g/l、cacl2·
2h2o 0.5g/l、kh2po41.2g/l、mnso4·
4h2o 0.5g/l、(nh4)2so42g/l、对氨基苯甲酸0.2mg/l、肌醇1mg/l、组氨酸30mg/l、谷氨酰胺600mg/l、谷氨酸20mg/l、羟基脯氨酸20mg/l、蛋氨酸60mg/l、vb1100mgl、vb61mg/l和vb
11
2mg/l。
14.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的培养基在培养酸土脂环酸芽孢杆菌中的应用。
15.经由上述的技术方案可知，本发明通过单因素试验，运用邓肯多重比较法，研制的培养基由已知分子结构和纯度的化学物质配制而成，用化学物质替代了天然成分，添加多种维生素、氨基酸等生长因子，探究该培养基对酸土脂环酸芽孢杆菌生长状况的影响，确保该菌在无酵母浸粉的化学合成培养基上仍能生长，相对于正常aam培养的菌，在化学合成培养基里生长的菌生长速度有所下降，对数期延后了6个小时，菌落总数达到6.37lg cfu/ml，而aam培养基菌落总数可达7.81lg cfu/ml。说明化学合成培养基里的菌体浓度不如aam培养基菌体浓度高，但也相差不大。酸土脂环酸芽孢杆菌在化学合成培养基里生长趋势与aam培养基里生长趋势基本一致，而且培养基成分明确，可以成功替代aam培养基。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
17.图1附图为本发明提供的对各种氨基酸的初筛结果图；
18.图2附图为本发明提供的对不同维生素的初筛结果图；
19.图3附图为本发明提供的对不同的生长因子的初筛结果图；
20.图4附图为本发明提供的不同浓度营养物质对酸土脂环酸芽孢杆菌生长的影响图；
21.图5附图为本发明提供的酸土脂环酸芽孢杆菌在分别添加维生素、对氨基苯甲酸、肌醇的化学培养基中的生长情况图；
22.图6附图为本发明提供的酸土脂环酸芽孢杆菌在化学培养基中的生长情况图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例中用到的菌株酸土脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus acidoterrestris dsm 3922
t
)，来源德国菌种保藏中心；
25.实施例中用到的主要仪器与试剂：varioskan flash多功能酶标仪美国赛默飞世尔科技公司；hv85全自动高压灭菌锅平山制作所株式会社(hirayama)；sw-cj-if型单人双面净化工作台苏州净化设备有限公司；dnp-9052型电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司；zqty-70f型振荡培养箱上海知楚仪器。
26.氨基酸和维生素均为分析纯，麦克林生化科技有限公司；未特别指明的氨基酸均为l型氨基酸。葡萄糖、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸锰、硫酸铵试剂均为分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司。
27.实施例1a1培养基制备
28.在前期试验的基础上对aam培养基基础进行改进，去除酵母浸粉，只添加基础化学物质。a1基础培养基配方：葡萄糖4.0g，mgso4·
7h2o 1.0g，cacl2·
2h2o 0.5g，kh2po41.2g，mnso4·
4h2o 0.5g，(nh4)2so42g，无菌水定容至1l，调节ph为4.0，121℃高压灭菌15min。
29.实施例2促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的化学培养基的制备
30.在a1培养基中分别加入化学营养物质如表1，配置成化学合成培养基，记为a2培养基，以a1缺酵母浸粉培养基作为基础培养物质，此时各物质浓度设为l x。根据美国bd公司公布的牛肉膏和蛋白胨组成成分表，确定了28种营养物质的初始浓度(表1)，此浓度设为l x，其他浓度倍数在此浓度基础上进行扩大或缩小。取等体积的单一营养物和基础培养物质混匀，即为合成营养素，经滤膜(0.22μm)过滤除菌，现用现配。
31.表1各营养物质名称及添加量
32.[0033][0034]
实施例3单因素试验
[0035]
利用单因素试验进行初筛和复筛。初筛实验设定单一营养物浓度梯度分别为：0.5x、lx、2x，基础培养物质浓度为lx。初筛时，以a1培养基为对照，分别探讨了添加表1中的单一氨基酸、维生素以及生长因子对酸土脂环酸芽孢杆菌生长状况的影响，结果如图1、图2和图3；对于氨基酸的初筛，在0h时，a1培养基菌悬液和化学培养基菌悬液的od
600
值均为0.04～0.05，在24h时，对照菌悬液的od
600
值平均为0.264，而不同合成营养素的菌悬液od
600
值明显发生变化，图1中的od
600
值为添加单一氨基酸培养基菌悬液od
600
值；图1中添加的单一氨基酸促进菌体生长效果不显著，图1中的a和b图中的14种氨基酸对酸土脂环酸芽孢杆
菌不能起到促进生长的作用，反而抑制了菌体的生长，其中添加半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸的培养基最为明显，菌液od
600
值均低于0.02。而c图添加的6种单一氨基酸促进菌体生长较显著，方差分析表明，随着氨基酸的浓度逐渐增大，添加组氨酸、谷氨酰胺、羟基脯氨酸和蛋氨酸的培养基菌悬液浓度逐渐增大，而添加谷氨酸的培养基菌悬液浓度先增大后减小。
[0036]
图2中，与对照组的菌悬液od
600
相比，除vb2以外，其他四种维生素均能促进酸土脂环酸芽孢杆菌的生长，每种维生素产生的促进效果不同，vb
11
与菌液浓度呈正相关的趋势，而vb3则呈负相关的趋势；随着vb1和vb6的浓度逐渐增加，菌液浓度先增大后减小。
[0037]
图3中，不同的生长因子对酸土脂环酸芽孢杆菌的生长产生不同程度的影响，除去氯化胆碱，对氨基苯甲酸、肌醇和泛酸钙对酸土脂环酸芽孢杆菌的生长都起到促进作用，而随着添加paba、泛酸钙、肌醇浓度的升高，菌液浓度呈现先增长后下降的趋势。
[0038]
综合以上初筛的试验结果，组氨酸、谷氨酰胺、羟基脯氨酸、蛋氨酸以及维生素b
11
需要继续开展复筛试验。
[0039]
将呈正相关的营养物质在原来基础上提高两个浓度梯度4x、8x，将呈负相关的营养物质降低两个浓度梯度0.125x、0.25x，再进行复筛试验，确定每种营养物质最适生长浓度。具体为：为寻找初筛试验中5种营养物质的最适生长浓度，对组氨酸、谷氨酰胺、羟基脯氨酸、蛋氨酸以及维生素b
11
展开了复筛试验，结果如图4所示，当羟基脯氨酸、vb
11
和蛋氨酸的浓度在4x时，谷氨酰胺和组氨酸浓度在2x时，菌液浓度分别达到最大值。因此经过两次筛选试验，得到了10种物质的最适生长浓度，分别是paba1x、肌醇1x、组氨酸2x、谷氨酰胺2x、谷氨酸1x、羟基脯氨酸4x、蛋氨酸4x、vb11x、vb61x、vb
11
2x。
[0040]
实施例4不同培养基对酸土脂环酸芽孢杆菌生长影响
[0041]
取保存的酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢悬浮液，接种到aam液体培养基中，45℃，250r/min振荡培养6h活化菌种，经活化后的菌悬液中活菌数约达108cfu/m l。将此菌悬液按1％的接种量分别转接到100m l基础培养基、对氨基苯甲酸培养基、肌醇培养基、vb1培养基、vb6培养基、vb11培养基和本发明的化学培养基中，生长情况见图5。
[0042]
其中：
[0043]
氨基苯甲酸培养基为：基础培养基+对氨基苯甲酸；
[0044]
肌醇培养基为：基础培养基+肌醇；
[0045]
vb1培养基为：基础培养基+vb1；
[0046]
vb6培养基为：基础培养基+vb6；
[0047]
vb11培养基为：基础培养基+vb11。
[0048]
实施例5化学培养基酸土脂环酸芽孢杆菌生长曲线测定
[0049]
取保存的酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢悬浮液，接种到aam液体培养基中，45℃，250r/min振荡培养6h活化菌种，经活化后的菌悬液中活菌数约达108cfu/m l。将此菌悬液按1％的接种量转接到100m l a1号和a2号液体培养基中，45℃，250r/min振荡培养24h。每2h各取出1ml菌液，采用稀释涂布平板法，测定菌体总数。其中1ml菌液进行梯度稀释后涂布平板，测得的菌落总数即为菌体总数；以培养时间为横坐标，菌体总数的对数值为纵坐标，制作菌体生长曲线。结果见图6；酸土脂环酸芽孢杆菌在ck组生长受到限制，生长24h后经测定od
600
值仅为0.264左右，而在添加营养物质后，改善了菌体的生长环境，能够促进菌体的生长，在12h进入对数期，培养至16h后进入稳定期，测定od
600
能够达到0.962，菌落总数达到4.75
×
106，而aam培养基可达1.353，菌落总数达到5.67
×
106。酸土脂环酸芽孢杆菌在a2培养基里生长速度有所下降，对数期与aam培养基相比延后了6个小时，但与aam培养基的总体生长趋势基本一致。
[0050]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0051]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的组合物，其特征在于，包括：对氨基苯甲酸0.2mg/l、肌醇1mg/l、组氨酸30mg/l、谷氨酰胺600mg/l、谷氨酸20mg/l、羟基脯氨酸20mg/l、蛋氨酸60mg/l、vb1100mgl、vb61mg/l、vb
11
2mg/l。2.权利要求1所述的一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的组合物在制备促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的培养基中的应用。3.一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，包括基础培养基和所述的组合物。4.根据权利要求3所述的一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，具体包括：葡萄糖4.0g/l、mgso4·
7h2o1.0g/l、cacl2·
2h2o0.5g/l、kh2po41.2g/l、mnso4·
4h2o0.5g/l、(nh4)2so42g/l、对氨基苯甲酸0.2mg/l、肌醇1mg/l、组氨酸30mg/l、谷氨酰胺600mg/l、谷氨酸20mg/l、羟基脯氨酸20mg/l、蛋氨酸60mg/l、vb1100mgl、vb61mg/l和vb
11
2mg/l。5.权利要求4所述的一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的培养基在培养酸土脂环酸芽孢杆菌中的应用。

技术总结
本发明公开了一种促进酸土脂环酸芽孢杆菌生长的组合物，包括：对氨基苯甲酸0.2mg/L、肌醇1mg/L、组氨酸30mg/L、谷氨酰胺600mg/L、谷氨酸20mg/L、羟基脯氨酸20mg/L、蛋氨酸60mg/L、VB1100mgL、VB61mg/L、VB


技术研发人员：焦凌霞 何承云 冉军舰 梁新红 赵瑞香 梁栋
受保护的技术使用者：河南科技学院
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/1