一种DC-CIK细胞和用于制备肿瘤细胞治疗药物的用途的制作方法

一种dc-cik细胞和用于制备肿瘤细胞治疗药物的用途
技术领域
1.本发明属于细胞治疗领域，涉及dc-cik细胞，具体涉及一种dc-cik细胞和用于制备肿瘤细胞治疗药物的用途。


背景技术：

2.树突状细胞(dendritic cell，dc)是人体内功能强大的抗原提呈细胞，细胞因子诱导的杀伤(cytokine-inducedkiller，cik)细胞是具有强大抗瘤、杀瘤活性的免疫细胞，将dc与cik细胞共同培养可获得dc-cik细胞，两者在共同培养过程中互相促进成熟，且dc能增强cik细胞的杀瘤活性。dc-cik细胞已经成为细胞治疗疗法的一种重要细胞。
3.为了更好地发挥dc-cik细胞对肿瘤细胞的抑制活性，研究人员通过多种策略进行了研究。比如，与化疗等传统治疗方法联合应用，与中药提取物联合应用。还有的研究人员通过先对dc细胞负载，再与cik细胞联合培养，负载后的dc细胞与cik细胞共培养可以获得杀瘤能力更强的dc-cik细胞。还有的研究人员通过对dc细胞从基因水平进行改造，敲低或高表达某种基因获得一种抗原提呈能力更强的dc细胞，进而与cik细胞培养后获得对肿瘤细胞抑制作用更强的dc-cik细胞。
4.微小rna(microrna，mirna)是一类短的单链内源性非编码rna，可与靶mrna的3'非编码区部分序列不完全或完全互补配对，引起靶向mrna的翻译抑制或特异性降解，调控基因表达，从而调节细胞增殖、分化，凋亡等生命过程。
5.目前，已有多向研究通过改变dc细胞中mirna水平获得抗原提呈能力增强的dc细胞。更多的mirna还在陆续发现中。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种dc-cik细胞和用于制备肿瘤细胞治疗药物的用途。
7.本发明目的通过下面的技术方案实现：
8.一种dc-cik细胞，由cik细胞与高表达mir-324-3p的dc细胞共培养得到。
9.上述dc-cik细胞用于制备抗肿瘤药物的用途，所述肿瘤为肺癌。
10.本发明取得的有益效果：
11.本发明发现，由cik细胞与高表达mir-324-3p的dc细胞共培养得到的dc-cik细胞比由cik细胞与常规dc细胞共培养得到的dc-cik细胞对肿瘤具有更明显的抑制作用。因此，由cik细胞与高表达mir-324-3p的dc细胞共培养得到的dc-cik细胞可以用于制备抗肿瘤药物，如抗肿瘤细胞治疗生物制剂。
附图说明
12.图1中a为dc、cik细胞流式鉴定结果，b为琼脂糖凝胶电泳图，c为各组裸鼠移植瘤比较。
具体实施方式
13.为了更好地介绍本发明，下面通过具体实施例详细阐述本发明的实质性内容，但需要注意并不以此限定本发明的保护范围。
14.实施例1：
15.一、实验材料
16.人淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司。
17.rpmi-1640培养基购自gibco公司。
18.胎牛血清购自gibco公司。
19.rhg-csf、rhil-4、rhtnf-α、rhifn-γ、cd3 mcab和rhil-2购自碧云天生物。
20.mir-324-3p-mimics、mir-324-3p-nc、pcr引物由广州锐博生物设计提供。
21.trizol试剂盒、逆转录试剂盒和pcr扩增试剂盒购自碧云天生物。
22.雄性balb/c裸鼠(四周龄)购自北京维通利华动物科技有限公司。
23.二、实验方法
24.1、dc细胞、cik细胞培养和流式鉴定
25.用淋巴细胞分离液分离健康成人外周静脉血中的外周血单个核细胞，接种于含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中，于37℃、5％co2、饱和湿度培养箱中培养2h，收集贴壁细胞和非贴壁细胞。贴壁细胞用于dc细胞培养，非贴壁细胞用于cik细胞培养。将贴壁细胞用含10％胎牛血清、1000u/ml rhg-csf和500u/ml rhil-4的rpmi-1640培养基培养，每3d换液一次；培养6d时，加入1000u/mlrhtnf-α继续培养2d，诱导成熟，得到dc细胞(流式细胞术检测表面标志物cd11c和cd86)。将非贴壁细胞用含10％胎牛血清和1000u/ml rhifn-γ的rpmi-1640培养基培养，24h后加入50ng/ml鼠抗人cd3 mcab和1000u/ml rhil-2，每3d换液一次，培养10d左右得到cik细胞(流式细胞术检测表面标志物cd3和cd56)。
26.2、dc细胞分组和转染
27.实验分为mir-324-3p mimics组、negative control组和正常对照组，处理方法如下：
28.(1)mir-324-3p mimics组(mimics组)：dc细胞加入mir-324-3p-mimics转染；
29.(2)negative control组(nc组)：dc细胞加入mir-324-3p-nc转染；
30.(3)正常对照组(control组)：dc细胞不予任何处理。
31.细胞转染：将dc细胞以每孔2
×
105个接种于6孔板中，培养24h后，mimics组、nc组用lipofectamine 2000分别转染mir-324-3p-mimics和mir-324-3p-nc，转染方法按照lipofectamine 2000试剂盒说明书。
32.3、琼脂糖凝胶电泳测定mir-324-3p表达水平
33.取转染48h后的dc细胞，按照trizol试剂盒说明书提取总的rna并测定rna浓度，按照逆转录试剂盒说明书逆转录rna得到cdna，按照pcr扩增试剂盒说明书进行扩增。内参为gapdh。引物序列如下。pcr扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳及biotium gelred染液染色，凝胶影像分析仪分析，比较各dc细胞荧光强度。
34.mir-324-3p f：5'-actgccccaggtgctgctgg-3'
35.mir-324-3p r：5'-gcgagcacagaattaatacgac-3'
36.gapdh f：5'-gtgaaccatgagaagtatg-3'
37.gapdh r：5'-cggccatcacgccacagtttc-3'
38.4、dc-cik细胞培养
39.分别收集cik细胞和转染48h后的dc细胞，pbs洗涤3次，分别用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基重悬，按dc细胞：cik细胞＝1:5的数量比混合(dc细胞初始浓度为1
×
105个/ml)。共培养7d得到dc-cik细胞。
40.5、测定dc-cik细胞对肿瘤杀伤力
41.将雄性balb/c裸鼠在spf条件下适应性喂养1周后，在裸鼠腋窝皮下接种0.1ml肿瘤a549细胞悬液(含2
×
106个对数生长期的细胞)。待肿瘤生长至约50mm3大小时，将20只肿瘤大小基本一致的雄性balb/c裸鼠随机分为4组，每组5只，按如下方法给药：
42.生理盐水组：腹腔注射0.2ml生理盐水；
43.dc-cik-a组：腹腔注射0.2ml共培养7d的dc-cik细胞，媒介为生理盐水；其中，dc细胞为“dc细胞分组和转染”中不予任何处理的dc细胞；
44.dc-cik-b组：腹腔注射0.2ml共培养7d的dc-cik细胞，媒介为生理盐水；其中，dc细胞为“dc细胞分组和转染”中转染mir-324-3p-nc的dc细胞；
45.dc-cik-c组：腹腔注射0.2ml共培养7d的dc-cik细胞，媒介为生理盐水；其中，dc细胞为“dc细胞分组和转染”中转染mir-324-3p-mimics的dc细胞。
46.一周给药一次，接种五周后，对所有小鼠实施安乐死，测量肿瘤体积和重量。肿瘤体积使用以下公式计算：(l
×
w2)/2，其中l为肿瘤长度，w为肿瘤宽度。
47.6、统计学分析
48.所有数据采用均数
±
标准差(x
±
s)表示，多组之间比较采用anova分析方法，两组间差异的比较采用t检验方法，p＜0.05具有显著差异，采用spss 20.0进行相关数据统计分析。
49.三、实验结果
50.使用常规分离培养方法即可从人外周静脉血中分离培养得到dc细胞和cik细胞。图1中a左图为dc细胞流式鉴定结果，cd11c和cd86双阳性表达符合dc细胞表型特点。图1中a右图为cik细胞流式鉴定结果，cd3和cd56双阳性表达符合cik细胞表型特点。
51.琼脂糖凝胶电泳结果如图1中b所示，mimics组mir-324-3p明显高表达，说明转染成功，高表达mir-324-3p的dc细胞成功制备。
52.各组裸鼠移植瘤图片以及肿瘤体积和重量如图1中c所示(**表示p＜0.05)，dc-cik-c组肿瘤被抑制的程度明显高于生理盐水组、dc-cik-a组、dc-cik-b组，表明由cik细胞与高表达mir-324-3p的dc细胞共培养得到的dc-cik细胞比由cik细胞与常规dc细胞共培养得到的dc-cik细胞对肿瘤具有更明显的抑制作用。
53.综上可见，由cik细胞与高表达mir-324-3p的dc细胞共培养得到的dc-cik细胞可以用于制备抗肿瘤药物，如抗肿瘤细胞治疗生物制剂。
54.上述实施例的作用是为了详细阐述本发明的实质性内容，但需要强调的是，本领域技术人员不应将本发明的保护范围局限于上述具体实施例。

技术特征：
1.一种dc-cik细胞，其特征在于：该dc-cik细胞由cik细胞与高表达mir-324-3p的dc细胞共培养得到。2.权利要求1所述的dc-cik细胞用于制备抗肿瘤药物的用途，所述肿瘤为肺癌。

技术总结
本发明公开了一种DC-CIK细胞和用于制备肿瘤细胞治疗药物的用途，请求保护一种DC-CIK细胞，该DC-CIK细胞由CIK细胞与高表达miR-324-3p的DC细胞共培养得到。本发明发现，由CIK细胞与高表达miR-324-3p的DC细胞共培养得到的DC-CIK细胞比由CIK细胞与常规DC细胞共培养得到的DC-CIK细胞对肿瘤具有更明显的抑制作用。因此，由CIK细胞与高表达miR-324-3p的DC细胞共培养得到的DC-CIK细胞可以用于制备抗肿瘤药物，如抗肿瘤细胞治疗生物制剂。如抗肿瘤细胞治疗生物制剂。如抗肿瘤细胞治疗生物制剂。


技术研发人员：谷文中 张文祥 谷青峰
受保护的技术使用者：南京思睿克医药科技有限公司
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/1