一种通道式单分子检测方法与流程

1.本发明涉及一种单分子检测方法，具体涉及一种通道式单分子检测方法，属于分子检测技术领域。


背景技术：

2.在疾病的诊断、污染物的含量测定等过程中，都涉及到某种或某些特定物质的检测，传统的测定方法如免疫层析、化学发光、酶联免疫等都是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的，如果信号强度越高，则被测定目标物的浓度越高，但此测定方式要求目标物的浓度较高。而单分子检测（smd）技术是一种超灵敏的检测技术，可以对单个分子进行检测和成像，在smd定量方法中，对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性和精度。
3.如申请号201180021686.7、名称为“扩大用于检测分子或颗粒的测定法中的动态范围的方法和系统”的发明专利，和申请号201510256620.6、名称为“使用珠或其他捕获物对分子或颗粒的超灵敏检测”的发明专利，都是美国匡特里克斯公司公开的单分子检测技术，且在“使用珠或其他捕获物对分子或颗粒的超灵敏检测”的发明专利中，提到了将分析物包裹在液滴中以后注入柱子通过光学检测系统进行光拾取。但此方案由于是将分析物注入柱子，因此每次只能对一个分子进行计数，效率较低。


技术实现要素：

4.本发明针对上述问题，提出了一种通道式单分子检测方法，采用光敏感应器同时对多个分子进行计数，快速实现分子数量的检测。
5.本发明为解决上述问题所采用的技术手段为：一种通道式单分子检测方法，大量微珠先与分析物进行免疫反应，至少部分微珠与分析物结合，且分析物结合有发光物，然后将包含微珠的液体分至多个通道中，使微珠依次从通道中流过，同时在通道外侧设置光敏感应器对从各通道流过的结合有分析物的微珠进行计数，统计出结合有分析物的微珠的总数，而确定分析物的浓度。
6.进一步地，具体地，包含微珠的液体被加入到检测芯片的盛样槽内，检测芯片上设有多条与盛样槽连通的通道，通道外侧设有光敏感应器，微珠从盛样槽流经通道时光敏感应器对结合有分析物的微珠进行计数，且微珠在流经通道时每次仅有一个微珠经过一条通道位于一个光敏感应器处的位置。
7.进一步地，一个光敏感应器的一个光敏元件对准检测芯片的一个通道，且每个光敏元件对应输出一串脉冲信号，通过对这一串脉冲信号的波的数量进行统计，即可得出流经此通道的分析物的数量。
8.进一步地，分析物为一种以上，光敏感应器也为一个以上，当光敏感应器数量为两个以上时，每个光敏感应器均有一个光敏元件对准检测芯片的一个通道。
9.进一步地，当分析物为两种以上时，不同类型的分析物结合不同颜色的发光物，不
同的光敏感应器对不同颜色的发光物分别计数。在同一个检测芯片中可以一次性对多种分析物的浓度进行检测。
10.进一步地，光敏感应器的光敏元件处装有滤波片，滤波片的种类与发光物颜色的种类相同，检测时，一个光敏感应器对应一种滤波片，一个通道外一种滤波片处的光敏元件对应输出一串脉冲信号，一个光敏感应器对一种分析物进行计数。
11.进一步地，检测芯片为两端开口的具有中空内部的片状结构，在其一端处设置盛料孔，盛料孔与中空内部之间设有y型连接支流，y型连接支流的分支端朝向中空内部，微珠从盛料孔流经y型连接支流后进入中空内部形成一条条通道，且y型连接支流的一个分支末端每次只有一个微珠经其进入中空内部。使每条通道每次都只有一个微珠流动，进而能够统计微珠的数量。
12.进一步地，通道为检测芯片内部与盛样槽连通的通孔。
13.进一步地，每个通道靠近光敏感应器的面上设有光线强放大结构，如凸透镜等将光线进行聚焦加强以供光敏感应器更好地识别。
14.进一步地，每个通道在设置光线强放大结构的对面的壁上设有反光层，进一步将光线反射聚焦加强至光敏感应器处。
15.进一步地，每个通道至少在光敏感应器处的宽度大于一个微珠最大外径且小于两个微珠最大外径。
16.进一步地，每个通道至少在光敏感应器处的宽度等于1.5倍微珠最大外径。
17.进一步地，检测芯片在与盛料孔相对的另一个开口端处设有废料回收池。
18.进一步地，废料回收池设有出液口。
19.进一步地，检测芯片靠近光敏感应器的一面采用无颜色的透明材料，其他部位采用不同于发光物颜色的深色材料。
20.本发明的有益效果是：1. 本发明采用微珠从检测芯片的通道中经过，在通道外设置光敏感应器感应的方式来对结合有特定发光物（也即特定分析物）的微珠数量进行统计，进而得出特定分析物的浓度，此方式可以对样品进行快速检测分析。
21.2. 本发明可以同时对多种分析物进行检测，大大提高了检测速度。
附图说明
22.图1为实施例一检测芯片和光敏感应器示意图；图2为实施例二检测芯片和光敏感应器示意图；图3为实施例三检测芯片和光敏感应器示意图；图4为实施例三另一检测芯片和光敏感应器示意图；图中：1.检测芯片，11.通道，12.盛样槽，13.进样口，14.废料回收池，15.出液口，16.y型连接支流，2.光敏感应器，3.微珠。
具体实施方式
23.下面结合附图对本发明进一步说明。
24.本发明中的光敏感应器是指在感应光线后能够输出信号的器件，如线阵ccd、光电
传感器等，且一个光敏感应器设置有多个光敏元件，每个光敏元件对一个通道内的分析物进行计数，一个光敏感应器对所有通道内的分析物数量进行统计。
实施例一
25.一种通道式单分子检测方法，如图1所示，采用微珠3从检测芯片1的通道11流过、检测芯片1外侧的光敏感应器2感应的方式对特定微珠3进行计数的方式对分析物进行检测。其中微珠3可以是目前常规使用的微粒，如磁珠等，本实施例中以磁珠为例进行描述。先使大量微珠3与分析物进行免疫反应，至少部分微珠3与分析物结合，且分析物结合有发光物，然后未与微珠3结合的分析物以及发光物被清洗掉，微珠3及结合在其上的分析物以及发光物被用来进行检测。
26.本实施例中，如图1所示，检测芯片1包括进样口13、盛样槽12、通道11、废料回收池14和出液口15，盛样槽12和废料回收池14分设在纵向两端处，检测芯片1整体为两端开口、中间在内部连通的薄片状，光敏感应器2设置在检测芯片1通道11的外侧。其中通道11有多条，每条通道11两端分别与盛样槽12和废料回收池14连通，而盛样槽12和废料回收池14分别设有与外界连通的进样口13和出液口15（当然，进样口13和出液口15都可以设置成不需要突出其所在平面的结构，如直接在盛样槽12或废料回收池14的一个壁上开孔。而且盛样槽12也可以是在一个端部敞开的结构，此时盛样槽12即为一种开放式结构，进样口13为盛样槽12端部的敞口）。检测芯片1可以采用基板和盖板结合的方式，在基板上加工出进样口13、盛样槽12、通道11、废料回收池14和出液口15，盖板上也加工出相应需要的结构后盖在基板上，而光敏感应器2设置在盖板一侧，为了保证检测的效果，可以将基板设置成与发光物的光不同色的深色材料，盖板采用无色透明材料。本实施例为每次只能检测一种分析物的结构，一个光敏感应器2的多个光敏元件分别对准多个通道11，也即一个通道11对应一个光敏元件，输出一串脉冲信号。
27.检测时，包含微珠3的待测样品（待测液体）从进样口13加入后，填充到盛样槽12，并且为了保证检测的准确性，在加样时，可以先封闭出液口15，样品加完后再打开出液口15，同时在进样口13处施加一个推力、或者在出液口15处施加一个吸力、或者在检测芯片1外施加一个能带动微珠3前进的磁场等等，使微珠3从盛样槽12流经通道11后进入废料回收池14，当微珠3从光敏感应器2处流过时，若微珠3结合有分析物和发光物，则光敏感应器2的光敏元件被触发，发出一个信号，对此微珠3进行计数，若微珠3没有结合分析物和发光物，则光敏感应器2不会对此微珠3进行计数，检测完成后，所有通道11内被计数的微珠3的总数即为待测样品中分析物的数量。
28.为了准确得出分析物的浓度，必须对通道11的宽度进行较准确的设计，使一个通道11内每次仅能够保证一个微珠3顺利通过，而不能够是有两个以上微珠3同时从一个光敏感应器的一个光敏元件处经过，本实施例中，为了方便加工，通道11为宽度大于一个微珠3最大外径且小于两个微珠3最大外径的通孔，如1.2倍微珠3最大外径、1.3倍微珠3最大外径、1.5倍微珠3、1.8倍微珠3最大外径等等。
29.本实施例中，采用了多个独立的通孔作为通道11，引导微珠3依次经过光敏感应器2处。而包含微珠3的溶液经过通道11后落入废料回收池14，然后从出液口15流出，保证检测能够持续进行。同时，可以通过出液口15处控制微珠3在通道11中的流速，使微珠3的流速与
光敏感应器2的检测速度相匹配，具体方式可以是：改变出液口15与外界连通的面积来控制微珠3的流速，调节出液口15处施加的吸力的大小来控制微珠3的流速等等，还可以在出液口15处施加推力阻止微珠3流入通道11。
30.此外，由于单个微珠3所结合的发光物发出的光线强度较弱，不利于光敏感应器2读取，因此，在靠近光敏感应器2处的通道11的壁上进行了工艺处理，每个通道11靠近光敏感应器2一侧的壁上设有光线强放大结构对光线进行聚焦增强，如设置微型凸透镜以使光线最大限度地被光敏感应器2感应到。同时还可以在通道11远离光敏感应器2一侧的壁上设置反光层，如涂敷反光材料等将光线进一步反射聚焦至光敏感应器2。
实施例二
31.本实施例中，检测原理与实施例一相同，不同之处在于检测芯片1的结构。如图2所示，本实施例的检测芯片1其盛样槽12在横向上的宽度比实施例一中盛样槽12的宽度小，且其通道11不是由通孔构成，而是由包含微珠3的溶液在检测芯片1内部的平面上流过时形成的，因此，在盛样槽12和通道11之间设有y型连接支流16，将从盛样槽12流出的待测样品逐级分成较细的支流，在每个支流的最末端处每次仅有一个微珠3能够经过，从每个支流处经过的微珠3流入检测芯片1内部的平面形成一条条通道11，光敏感应器2同样在通道11外侧对分析物进行计数。本实施例中，由于没有通孔作为微珠3流动的引导，因此，微珠3仅靠支流末端处的导向而形成一个个通道11，如果微珠往前移动的距离较大，有可能不会是一直沿直线前进，而会分散到各处形成无序状态，所以光敏感应器2最好是设置在靠近支流末端的位置处，以保证检测结果的准确性。
实施例三
32.上述实施例一和实施例二中每次都只能对一种分析物进行检测，本实施例是对上述实施例进行的改进，能够同时对两种以上的分析物进行检测，如图3和图4所示，在检测芯片2的通道11外侧设置两个或多个光敏感应器2，而在微珠3和分析物进行免疫反应时，同种分析物结合同种发光物，不同的分析物结合不同的发光物，每个光敏感应器2的光敏元件处都装有滤波片，一个光敏感应器2装一种滤波片，与发光物的颜色匹配，因此，一个光敏感应器2对一种分析物进行计数。比如，在对两种分析物a和b进行检测时，a结合黄色发光物，b结合绿色发光物，一部分微珠结合a，一部分微珠结合b，还有一部分微珠没有结合分析物，使用两个并排设置在通道11外侧的光敏感应器 x和y，光敏感应器 x在其光敏元件处装有能透过黄光的滤光片，光敏感应器 y在其光敏元件处装有能透过绿光的透光片，检测芯片1的基板采用黑色材料，盖板采用无色透明材料，当微珠从通道经过光敏感应器时，x仅对结合a的微珠进行计数，而对另外的微珠不计数；y仅对结合b的微珠进行计数，对另外的微珠不计数。由此同时测出a和b的浓度。当分析物有三种或者更多种时，相应增加发光物和光敏感应器的数量即可同时测出多种分析物的浓度。
33.上述实施例中，与分析物结合的发光物可以是荧光标记物，此时，需要在通道11附近设置激发光源对荧光标记物进行照射以使其发出荧光，为了准确测出分析物的浓度，荧光标记物最好是选取激发光波长与发射光波长差异较大的物质，当分析物有多种时，荧光标记物也需要多种，所有激发波长与所有发射波长都需要相差较大，同时各发射波长之间
也需相差较大。
34.当然，与分析物结合的发光物也可以是自发光的化学物质等，同样地，当分析物有多种时，各自发光物质之间的发射波长也最好相差较大。
35.由于上述分析物的浓度是根据测出的带分析物的微珠的数量与所有微珠数量的比值来得出的，因此，与一种分析物进行免疫反应的微珠总数也需要统计，可以采用以下方式得出：（一）在通道处设置激光，当微珠经过时微珠将激光光源挡住，根据激光被挡住的次数来对微珠总数进行统计。当在一个检测芯片内同时对多种分析物进行检测时，由于此种计数方式无法区别不同分析物对应的微珠总数，因此适合在对一种分析物进行检测时使用。
36.（二）在通道处设置磁感应接收器，如线圈等，利用电磁感应原理对从通道处经过的全部微珠数量进行统计，由于此方式也无法区别不同分析物对应的微珠总数，因此也适合在对一种分析物进行检测时使用。
37.（三）微珠在与分析物进行免疫结合之前先在微珠表面包被基础光物质，当然，此基础光物质发生出的光的波长与分析物结合的发光物的波长不同，同样地，此基础光物质既可以是发出荧光的物质也可以是化学发光物质等，若是发荧光的物质同样需要在检测芯片设置相应的激发光。此时，一种分析物需要两个光敏感应器进行检测，一个用于统计结合有分析物的微珠的数量，另一个用于统计与此分析物进行免疫反应的全部微珠的数量。因此，此方式可以同时对多种不同的分析物进行检测，只需将与不同的分析物进行免疫反应的位置包被不同的基础光物质即可。
38.当然，还可以采用其他方式对全部微珠的数量进行统计，如在将含有微珠的溶液加入盛样槽之前先对微珠数量进行统计等等。
39.以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化或变换，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的保护范围，本发明的保护范围应该由各权利要求限定。

技术特征：
1.一种通道式单分子检测方法，大量微珠先与分析物进行免疫反应，至少部分微珠与分析物结合，且分析物结合有发光物，其特征在于：然后将包含微珠的液体分至多个通道中，使微珠依次从通道中流过，同时在通道外侧设置光敏感应器对从各通道流过的结合有分析物的微珠进行计数，统计出结合有分析物的微珠的总数，从而确定分析物的浓度。2.如权利要求1所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：包含微珠的液体被加入到检测芯片的盛样槽内，检测芯片上设有多条与盛样槽连通的通道，通道外侧设有光敏感应器，微珠从盛样槽流经通道时光敏感应器对结合有分析物的微珠进行计数，且微珠在流经通道时每次仅有一个微珠经过一条通道位于一个光敏感应器处的位置。3.如权利要求1所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：一个光敏感应器的一个光敏元件对准检测芯片的一个通道。4.如权利要求3所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：分析物为一种以上，光敏感应器也为一个以上，当光敏感应器数量为两个以上时，每个光敏感应器均有一个光敏元件对准检测芯片的一个通道。5.如权利要求4所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：当分析物为两种以上时，不同类型的分析物结合不同颜色的发光物，不同的光敏感应器对不同颜色的发光物分别计数。6.如权利要求4所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：光敏感应器的光敏元件处装有滤波片，滤波片的种类与发光物颜色的种类相同，一个光敏感应器对应一种滤波片。7.如权利要求1所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：通道为检测芯片内部与盛样槽连通的通孔。8.如权利要求1所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：每个通道靠近光敏感应器的面上设有光线放大结构。9.如权利要求8所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：每个通道在设置光线放大结构的对面的壁上设有将光线反射聚焦的反光层。10.如权利要求1所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：每个通道至少在光敏感应器处的宽度大于一个微珠最大外径且小于两个微珠最大外径。11.如权利要求1所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：检测芯片在与盛料孔相对的另一个开口端处设有废料回收池。12.如权利要求11所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：废料回收池设有出液口。13.如权利要求1所述的通道式单分子检测方法，其特征在于：检测芯片靠近光敏感应器的一面采用无颜色的透明材料，其他部位采用不同于发光物颜色的深色材料。

技术总结
一种通道式单分子检测方法，属于单分子检测技术领域。大量微珠先与分析物进行免疫反应，至少部分微珠与分析物结合，且分析物结合有发光物，然后将包含微珠的液体分至多个通道中，使微珠依次从通道中流过，同时在通道外侧设置光敏感应器对从各通道流过的结合有发光物的微珠进行计数，统计出结合有发光物的微珠的总数，而确定分析物的浓度。所述检测方法采用光敏感应器读取结合有发光物的微珠的数量，能够同时对大量分析物进行计数，因而能够快速准确检测出分析物的浓度。准确检测出分析物的浓度。准确检测出分析物的浓度。


技术研发人员：谢成昆 李朝辉 何峰 黄欣 陶立安
受保护的技术使用者：湖南超亟检测技术有限责任公司
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/1