一种肉苁蓉提取物在制备缓解白内障的外用制剂中的应用的制作方法

1.本发明属于眼部外用制剂领域，具体是一种肉苁蓉提取物在制备缓解白内障的外用制剂中的应用。


背景技术：

2.白内障的主要症状表现为视力减退和视物模糊，并出现逐渐加重的视力下降。白内障比较严重时会出现视物模糊、怕光、看物体颜色较暗或呈黄色等情况。白内障是一种致盲性眼病，目前是世界首位的致盲因素。白内障的发病可能与下列因素有关：营养素代谢，阳光与紫外线，长时间在高温条件下工作，缺氧，体液或内分泌紊乱；但是目前为止，尚未对白内障的发病机理产生共识。目前，手术是治疗白内障的主要方法，但是，手术治疗的费用高、要求高，使得很多白内障患者不能很好的得到治疗。因此，从中药中提取活性组分防治白内障是一种值得探究的途径，现有技术中也公开了一些可用于防治白内障的中药组合物：
3.专利cn101361892b公开了一种用于治疗白内障的中药制剂及其制备方法，它是由芦荟、紫翅藤(盒果藤)、玫瑰花、诃子肉、乳香、西红花、司卡摩尼亚脂、叶黄素经加工制成的药物活性成分与药物可接受的载体按一定的配比经加工制成的，该药物载体是单糖浆及淀粉。与现有技术相比：本发明提供的制剂用于治疗黄斑变性及异常黑胆质和胆液汁所引起的白内障；后发性白内障；疗效显著。
4.专利cn103405609b公开了一种治疗目赤翳障的中药制剂，其特征是用下列重量份的中药原料制成：决明子13-17；枸杞子13-17；蒲公英18-22；菊花13-17；山药13-17；鹅不食草14-18；青黛4-6；川芎101-14；赤芍12-15；密蒙花12-15；木贼草12-14；苍术11-14；熊胆4-6。本发明对肝肾两亏、精血不足或脾虚失运及肝经郁热等引起的老年性白内障有特效。
5.专利cn103040974b公开了一种防治白内障的中药复方滴眼剂及其制备方法，该中药复方滴眼剂的制备原料包括以下重量份数的成分：决明子45～60份，密蒙花25～40份，灯盏花30～55份，蕤仁20～50份，冰片1份。本发明由决明子、密蒙花、冰片、灯盏花、蕤仁等中药制成的中药复方滴眼剂，它具有祛翳明目之功效，用于改善并治疗视力模糊和老年性白内障。在选方上具有一定创新性，本发明具有一定的社会经济价值。目前西药治疗白内障的药主要用白内停(吡诺克辛钠)滴眼液，而中药领域防治白内障的制剂药典收载的还没有。本发明既可发挥中医药组方的优势，又可发挥细微液滴给药的特点。本方制成的滴眼剂将改变老年性白内障治疗无特效药物的历史。
6.但是，截止目前，能够获得临床应用并在实际应用中能够对白内障具有良好的治疗效果且毒副作用低的药剂依然很少。因此，开发更多效果显著且无副作用的缓解白内障的药物迫在眉睫。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肉苁蓉提取物在制备缓解白内
障的外用制剂中的应用，并提供一种缓解白内障的外用制剂及其制备方法；本发明的外用制剂成分简单、无明显细胞毒性，对细胞的划痕具有一定的修复能力；对于白内障的预防和/或治疗具有良好的应用前景。而且本发明的外用制剂制备方法简单、生产成本低。
8.本发明的目的通过以下技术方案来实现：
9.第一方面，本发明提供了一种肉苁蓉提取物在制备缓解白内障的外用制剂中的应用。
10.在本发明的一些实施方式中，所述肉苁蓉提取物选自以下任意一种或多种：酒炙肉苁蓉水提取物、新鲜肉苁蓉多糖、清蒸肉苁蓉水提取物。
11.在本发明的一些实施方式中，所述酒炙肉苁蓉水提取物的提取方法包括如下步骤：
12.(1)将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥、粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h；
13.(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得。
14.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥、粉碎是将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥，然后粉碎至粒径小于10μm。
15.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥、粉碎包括将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥，然后先粉碎为粗粉，再对粗粉进行气流粉碎，过孔径为10μm的筛网，得到粒径小于10μm的粉末。
16.在本发明的一些实施方式中，所述新鲜肉苁蓉多糖可采用水提醇沉法提取得到，优选地，所述新鲜肉苁蓉多糖的提取方法包括如下步骤：
17.(1)将肉苁蓉鲜干片粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h，过滤分离得到提取液；
18.(2)将提取液进行浓缩后加入乙醇使浓缩液在体积分数为75～85％的乙醇中进行沉淀，沉淀结束后分离出沉淀并进行冷冻干燥得到固体粉末，即得。
19.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将肉苁蓉鲜干片粉碎是将肉苁蓉鲜干片粉碎至粒径小于10μm。
20.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将肉苁蓉鲜干片粉碎包括将肉苁蓉鲜干片先粉碎为粗粉，再对粗粉进行气流粉碎，过孔径为10μm的筛网，得到粒径小于10μm的粉末。
21.在本发明的一些实施方式中，所述清蒸肉苁蓉水提取物的提取方法包括如下步骤：
22.(1)将清蒸肉苁蓉粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h；
23.(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得。
24.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将清蒸肉苁蓉粉碎是将清蒸肉苁蓉粉碎至粒径小于10μm。
25.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将清蒸肉苁蓉粉碎是将清蒸肉苁蓉先粉碎为粗粉，再对粗粉进行气流粉碎，过孔径为10μm的筛网，得到粒径小于10μm的粉末。
26.在本发明的一些实施方式中，所述应用包括将肉苁蓉提取物与葡萄籽提取物复合应用于制备缓解白内障的外用制剂。
27.在本发明的一些实施方式中，所述葡萄籽提取物是葡萄籽的水溶性提取物；更优选地，所述葡萄籽提取物在外用制剂中的浓度不超过1mg/ml。
28.在本发明的一些实施方式中，所述葡萄籽提取物的提取方法包括如下步骤：
29.(1)取干燥葡萄籽加入15～25倍质量的水，在50～70℃下提取1.5～2.5h；
30.(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得。
31.优选地，所述提取用的水是蒸馏水。
32.在本发明的一些实施方式中，所述外用制剂包括眼部护理液和/或眼部外用药剂，优选地，所述眼部护理液的溶剂为世罕泉。
33.在本发明的一些实施方式中，所述外用制剂包括但不限于滴眼液、眼膜剂、眼膏剂、眼丸剂、眼用凝胶剂。
34.在本发明的一些实施方式中，所述缓解白内障是指预防和/或治疗白内障。
35.第二方面，本发明提供了一种缓解白内障的外用制剂，所述外用制剂含肉苁蓉提取物。
36.在本发明的一些实施方式中，所述肉苁蓉提取物选自以下任意一种或多种：酒炙肉苁蓉水提取物、新鲜肉苁蓉多糖、清蒸肉苁蓉水提取物。
37.在本发明的一些实施方式中，所述酒炙肉苁蓉水提取物的提取方法包括如下步骤：
38.(1)将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥、粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h；
39.(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得。
40.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥、粉碎是将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥，然后粉碎至粒径小于10μm。
41.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥、粉碎包括将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥，然后先粉碎为粗粉，再对粗粉进行气流粉碎，过孔径为10μm的筛网，得到粒径小于10μm的粉末。
42.在本发明的一些实施方式中，所述新鲜肉苁蓉多糖可采用水提醇沉法提取得到，优选地，所述新鲜肉苁蓉多糖的提取方法包括如下步骤：
43.(1)将肉苁蓉鲜干片粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h，过滤分离得到提取液；
44.(2)将提取液进行浓缩后加入乙醇使浓缩液在体积分数为75～85％的乙醇中进行沉淀，沉淀结束后分离出沉淀并进行冷冻干燥得到固体粉末，即得。
45.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将肉苁蓉鲜干片粉碎是将肉苁蓉鲜干片粉碎至粒径小于10μm。
46.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将肉苁蓉鲜干片粉碎包括将肉苁蓉鲜干片先粉碎为粗粉，再对粗粉进行气流粉碎，过孔径为10μm的筛网，得到粒径小于10μm的粉末。
47.在本发明的一些实施方式中，所述清蒸肉苁蓉水提取物的提取方法包括如下步骤：
48.(1)将清蒸肉苁蓉粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h；
49.(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得。
50.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将清蒸肉苁蓉粉碎是将清蒸肉苁蓉粉碎至粒径小于10μm。
51.在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中将清蒸肉苁蓉粉碎是将清蒸肉苁蓉先粉碎为粗粉，再对粗粉进行气流粉碎，过孔径为10μm的筛网，得到粒径小于10μm的粉末。
52.在本发明的一些实施方式中，所述外用制剂包括眼部护理液和/或眼部外用药剂，优选地，所述眼部护理液的溶剂为世罕泉。
53.在本发明的一些实施方式中，所述外用制剂包括但不限于滴眼液、眼膜剂、眼膏剂、眼丸剂、眼用凝胶剂。
54.在本发明的一些实施方式中，所述缓解白内障是指预防和/或治疗白内障。
55.在本发明的一些实施方式中，所述眼部护理液中酒炙肉苁蓉水提取物干重的浓度不超过5mg/ml。
56.在本发明的一些实施方式中，所述眼部护理液中新鲜肉苁蓉多糖干重的浓度不超过3mg/ml。
57.在本发明的一些实施方式中，所述眼部护理液中清蒸肉苁蓉水提取物干重的浓度不超过5mg/ml。
58.在本发明的一些实施方式中，所述外用制剂还包括葡萄籽提取物，优选地，所述葡萄籽提取物是葡萄籽的水溶性提取物；更优选地，所述葡萄籽提取物在外用制剂中的浓度不超过1mg/ml。
59.在本发明的一些实施方式中，所述葡萄籽提取物的提取方法包括如下步骤：
60.(1)取干燥葡萄籽加入15～25倍质量的水，在50～70℃下提取1.5～2.5h；
61.(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得。
62.优选地，所述提取用的水是蒸馏水。
63.在本发明的一些实施方式中，所述葡萄籽提取物中的原花青素的浓度范围是0～15％；原花青素在外用制剂中的浓度不超过150μg/ml。
64.第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的缓解白内障的外用制剂的制备方法，所述制备方法包括将肉苁蓉提取物加入到溶剂中，使其完全溶解后过滤除菌。
65.在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括往溶剂中加入葡萄籽提取物，使其在溶剂中完全溶解。
66.在本发明的一些实施方式中，可对加入肉苁蓉提取物和/或葡萄籽提取物的液剂进行超声处理促进肉苁蓉提取物和/或葡萄籽提取物的溶解。
67.在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括在过滤除菌之前加入渗透压调节剂调节外用制剂的渗透压为1～100mosmol/bg。
68.在本发明的一些实施方式中，所述过滤的滤膜孔径为0.2～0.3μm。
69.在本发明的一些实施方式中，所述除菌包括在紫外灯光下照射1～3h。
70.在本发明的外用制剂中，各成分及其主要功效介绍如下：
71.肉苁蓉(cistanche deserticola ma)是列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉的干燥肉质茎，又名疆芸、寸芸、苁蓉。素有“沙漠人参”之美誉，具有极高的药用价值，是中国传统的名贵中药材。肉苁蓉在历史上就被西域各国作为上贡朝廷的珍品，也是历代补肾壮阳类处方
中使用频度最高的补益药物之一。肉苁蓉味甘、咸；性温；归肾；大肠经。功能主治：补肾阳；益精血；润肠道。主肾阳虚衰；精血不足之阳痿；遗精；白浊；尿频余沥；腰痛脚弱；耳鸣目花；月经衍期；宫寒不孕；肠燥便秘。现有研究表明，肉苁蓉具有抗衰老、增强免疫能力、抗疲劳、保护肝脏等作用。肉苁蓉中含有多糖、苯乙醇苷、多酚类物质。现代医学研究表明，肉苁蓉提取物有抗炎、抗氧化、降低血糖和抑制癌细胞等作用，其在活体内能保持sod、gsh和gsh-px含量。sod、gsh和gsh-px与白内障相关；因此，肉苁蓉提取物很有可能对于缓解白内障具有疗效。
72.葡萄籽是葡萄的种子，经晒干后分离葡萄皮、葡萄梗后所得产物。葡萄籽含有白藜芦醇、氨基酸、维生素及矿物质等。葡萄籽在保护眼睛免受辐射损伤、防治红血丝、阻止自由基对晶状体蛋白的氧化、增强夜视力、减少视网膜症等方面具有一定的疗效，可用于预防白内障、视网膜炎。现有研究表明，白藜芦醇可能通过调节sir t1表达，进一步调节下游基因p53、叉头转录因子1、nf-κb的表达，抑制和延缓晶状体上皮细胞凋亡，延缓糖尿病大鼠白内障的发生发展。本发明的发明人在研究中发现，低浓度的葡萄籽提取物可以起到抑制细菌滋生的作用，将其加入到含肉苁蓉提取物的外用制剂中在一定程度上能解决因外用制剂存在肉苁蓉提取物(尤其是肉苁蓉多糖)导致的容易染菌的问题。
73.世罕泉是在中国发现的一种天然天成的小分子弱碱性苏打水，具有弱碱性(ph 8.1～8.5，hco
3-》400mmg/ml)和含有益元素(硼和溶解氧)的特点。本发明的发明人经研究发现世罕泉原液对于细胞无毒性，且能促进rcfbf细胞和rcfc细胞的增殖，对rcfbf细胞和rcfc细胞的划痕修复具有促进作用。世罕泉富含矿物质，适于眼部组织的渗透、溶解、疏通、洗涤，相较于纯净水更适合作为眼部外用制剂的溶剂。
74.本发明的有益效果如下：
75.本发明提出了将肉苁蓉提取物应用在制备缓解白内障的外用制剂中，拓宽了肉苁蓉提取物的用途同时也拓宽了制备缓解白内障的外用制剂的原料来源。肉苁蓉提取物如酒炙肉苁蓉水提取物、新鲜肉苁蓉多糖、清蒸肉苁蓉水提取物均含有肉苁蓉的活性成分如多糖，其具有抗炎、抗氧化的作用效果，将其以适当的浓度应用于制备缓解白内障的外用制剂，对于细胞无毒性，还能激活并修复了眼部受损细胞及退化细胞的活性，在提升中老年人的视力、缓解白内障方面具有极高的应用前景；尤其是将肉苁蓉提取物与葡萄籽提取物复合应用于制备缓解白内障的外用制剂时，对于眼部受损细胞的修复具有更好的效果。
76.另外，本发明在对酒炙肉苁蓉、新鲜肉苁蓉、清蒸肉苁蓉进行提取前，先将酒炙肉苁蓉、新鲜肉苁蓉、清蒸肉苁蓉粉碎至粒径小于10μm，然后再对酒炙肉苁蓉、新鲜肉苁蓉、清蒸肉苁蓉进行提取，可以有效提高提取物中活性成分的含量，如多糖、苯乙醇苷的含量。
附图说明
77.图1表示不同浓度的酒炙肉苁蓉水提取物对于rcfbf细胞的毒性作用。
78.图2表示不同浓度的葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对于rcfbf细胞的毒性作用。
79.图3表示不同浓度的清蒸肉苁蓉水提取物对于rcfbf细胞的毒性作用。
80.图4表示不同浓度的新鲜肉苁蓉多糖对于rcfbf细胞的毒性作用。
81.图5表示不同浓度的酒炙肉苁蓉水提取物对于rcfc细胞的毒性作用。
82.图6表示不同浓度的葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfc细胞的毒性作用。
83.图7表示不同浓度的清蒸肉苁蓉水提取物对于rcfc细胞的毒性作用。
84.图8表示不同浓度的新鲜肉苁蓉多糖对于rcfc细胞的毒性作用。
85.图9表示不同浓度的酒炙肉苁蓉水提取物对rcfbf细胞划痕的修复作用，图中，a、b分别表示500μg/ml酒炙肉苁蓉水提取物对rcfbf细胞作用0h和24h的结果，c、d分别表示1000μg/ml酒炙肉苁蓉水提取物对rcfbf细胞作用0h和24h的结果。
86.图10表示不同浓度的葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfbf细胞划痕的修复作用，图中，a、b分别表示500μg/ml葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfbf细胞作用0h和24h的结果，c、d分别表示1000μg/ml葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfbf细胞作用0h和24h的结果。
87.图11表示不同浓度的清蒸肉苁蓉水提取物对rcfbf细胞划痕的修复作用，图中，a、b分别表示500μg/ml清蒸肉苁蓉水提取物对rcfbf细胞作用0h和24h的结果，c、d分别表示1000μg/ml清蒸肉苁蓉水提取物对rcfbf细胞作用0h和24h的结果。
88.图12表示不同浓度的新鲜肉苁蓉多糖对rcfbf细胞划痕的修复作用，图中，a、b分别表示100μg/ml新鲜肉苁蓉多糖对rcfbf细胞作用0h和24h的结果，c、d分别表示500μg/ml新鲜肉苁蓉多糖对rcfbf细胞作用0h和24h的结果。
89.图13表示不同浓度的酒炙肉苁蓉水提取物对rcfc细胞划痕的修复作用，图中，a、b、c分别表示500μg/ml酒炙肉苁蓉水提取物对rcfc细胞作用0h、24h和48h的结果，d、e、f分别表示1000μg/ml酒炙肉苁蓉水提取物对rcfc细胞作用0h、24h和48h的结果。
90.图14表示不同浓度的葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfc细胞划痕的修复作用，图中，a、b分别表示500μg/ml葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfc细胞作用0h和24h的结果，c、d分别表示1000μg/ml葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfc细胞作用0h和24h的结果。图15表示不同浓度的清蒸肉苁蓉水提取物对rcfc细胞划痕的修复作用，图中，a、b、c分别表示500μg/ml清蒸肉苁蓉水提取物对rcfc细胞作用0h、24h和48h的结果，d、e、f分别表示1000μg/ml清蒸肉苁蓉水提取物对rcfc细胞作用0h、24h和48h的结果。
91.图16表示不同浓度的新鲜肉苁蓉多糖对rcfc细胞划痕的修复作用，图中，a、b、c分别表示100μg/ml新鲜肉苁蓉多糖对rcfc细胞作用0h、24h和48h的结果，d、e、f分别表示500μg/ml新鲜肉苁蓉多糖对rcfc细胞作用0h、24h和48h的结果。
具体实施方式
92.以下通过实施例进一步说明本发明的技术。这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
93.以下实施例所使用的葡萄籽提取物的制备方法为：取干燥葡萄籽加入20倍质量的蒸馏水，于60℃提取2h，离心并过滤除去不溶物，上清液干燥得到葡萄籽提取物。
94.以下实施例所使用的酒炙肉苁蓉水提取物的制备方法为：将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥，先粉碎为粗粉，再对粗粉进行气流粉碎，过孔径为10μm的筛网，得到粒径小于10μm的粉末，加入20倍质量的水，在80℃下提取2h；离心过滤后，滤液经喷雾干燥即得到酒炙肉
苁蓉水提取物。
95.以下实施例所使用的清蒸肉苁蓉水提取物的制备方法为：将清蒸肉苁蓉先粉碎为粗粉，再对粗粉进行气流粉碎，过孔径为10μm的筛网，得到粒径小于10μm的粉末，加入20倍质量的水，在80℃下提取2h；离心过滤后，滤液经喷雾干燥即得到清蒸肉苁蓉水提取物。
96.以下实施例所使用的新鲜肉苁蓉多糖的制备方法为：将肉苁蓉鲜干片先粉碎为粗粉，再对粗粉进行气流粉碎，过孔径为10μm的筛网，得到粒径小于10μm的粉末，加入20倍质量的水，在80℃下提取2h，过滤分离得到提取液；将提取液进行浓缩后加入乙醇使浓缩液在体积分数为80％的乙醇中进行沉淀，沉淀结束后分离出沉淀并进行冷冻干燥得到固体粉末，即得新鲜肉苁蓉多糖。
97.实施例1
98.一种缓解白内障的眼部护理液，眼部护理液的制备方法包括：
99.将酒炙肉苁蓉水提取物加入到世罕泉中，对其进行超声处理使其完全溶解，即得到每1l含酒炙肉苁蓉水提取物0.5g的试剂，然后加入2.0g氯化钠调节混合试剂的渗透压为39m0smol/kg，再采用孔径为0.25μm的滤膜进行过滤除杂，最后将其置于紫外灯光下照射2h进行除菌处理，即得眼部护理液1#。
100.实施例2
101.一种缓解白内障的眼部护理液，眼部护理液的制备方法包括：
102.将酒炙肉苁蓉水提取物和葡萄籽提取物加入到世罕泉中，对其进行超声处理使其完全溶解，即得到每1l含酒炙肉苁蓉水提取物0.5g、含葡萄籽提取物0.1g的混合试剂，然后加入2.0g氯化钠调节混合试剂的渗透压为30m0smol/kg，再采用孔径为0.25μm的滤膜进行过滤除杂，最后将其置于紫外灯光下照射1h进行除菌处理，即得眼部护理液2#。
103.实施例3
104.一种缓解白内障的眼部护理液，眼部护理液的制备方法包括：
105.将清蒸肉苁蓉水提取物加入到世罕泉中，对其进行超声处理使其完全溶解，即得到每1l含清蒸肉苁蓉水提取物0.5g的试剂，然后加入2.0g氯化钠调节混合试剂的渗透压为40m0smol/kg，再采用孔径为0.25μm的滤膜进行过滤除杂，最后将其置于紫外灯光下照射2h进行除菌处理，即得眼部护理液3#。
106.实施例4
107.一种缓解白内障的眼部护理液，眼部护理液的制备方法包括：
108.将新鲜肉苁蓉多糖加入到世罕泉中，对其进行超声处理使其完全溶解，即得到每1l含新鲜肉苁蓉多糖0.3g的试剂，然后加入2.0g氯化钠调节混合试剂的渗透压为19m0smol/kg，再采用孔径为0.25μm的滤膜进行过滤除杂，最后将其置于紫外灯光下照射3h进行除菌处理，即得眼部护理液4#。
109.产品性能考察
110.1、理化性质分析
111.测定实施例1-4得到的眼部护理液样品的电导率、ph值、表面张力，得到结果如下表1所示
112.表1各眼部护理液的电导率、ph值、表面张力
113.样品电导率/μs/cmph表面张力/mn/m
眼部护理液1#11654.9166.9眼部护理液2#9965.5358眼部护理液3#8125.13——眼部护理液4#12404.9570
114.2、细胞毒性实验
115.采用兔角膜前基质成纤维细胞(rcfbf)和大鼠成纤维结膜细胞(rcfc)考察不同样品对细胞的毒性作用
116.以下细胞毒性实验不同样品是指将实施例中所述的酒炙肉苁蓉水提取物、酒炙肉苁蓉水提取物和葡萄籽提取物的混合物、清蒸肉苁蓉水提取物、新鲜肉苁蓉多糖加入至世罕泉中，对其进行超声处理使其完全溶解后配制得到的；其中：
117.酒炙肉苁蓉水提取物的浓度设置为：0、100、500、1000、2000、5000μg/ml；
118.酒炙肉苁蓉水提取物和葡萄籽提取物以1：1混合得到的混合物的浓度设置为：0、100、500、1000、2000、5000μg/ml；
119.清蒸肉苁蓉水提取物的浓度设置为：0、100、500、1000、2000、5000μg/ml；
120.新鲜肉苁蓉多糖的浓度设置为：0、50、100、500、1000、3000μg/ml；
121.2.1、兔角膜前基质成纤维细胞(rcfbf)细胞毒性实验
122.将rcfbf细胞在含5％胎牛血清(fcs)的f12培养基中于37℃(5％co2和饱和湿度)培养48～72h。收集对数期的细胞，并将细胞悬液浓度调节至1
×
105细胞/ml。将细胞添加至96孔板(边缘孔中充满无菌pbs)，在37℃下培养12h，然后用不同浓度的样品处理。孵育24h后，按每孔100μl将经不同浓度的样品处理后得到的细胞添加到12孔板中，培养12h后，再添加不同浓度的样品进行处理。处理4h后，移出培养基，并向每个孔中添加100μlmtt(0.5mg/ml)，继续培养4h。然后将上清液吸出，并将150μl的二甲基亚砜(dmso)添加到96孔板中，将其置于摇床上，以低速完全溶解晶体。通过酶标仪测量570nm处的吸光度。细胞存活率按以下公式计算：
123.细胞存活率(％)＝abs
样品
/abs
对照
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100
124.不同浓度的酒炙肉苁蓉水提取物对于rcfbf细胞的毒性作用如图1所示；从图中可以看出，酒炙肉苁蓉水提取物有助于rcfbf细胞培养，在低浓度时毒性较小，当浓度增加到一定程度后再增加浓度对于rcfbf细胞的毒性增加，但是浓度在5000μg/ml内细胞存活率在80％以上。
125.不同浓度的葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对于rcfbf细胞的毒性作用如图2所示；从图中可以看出，在浓度为100μg/ml时，葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfbf细胞的增殖具有较大的促进作用，且浓度在5000μg/ml内细胞存活率在90％以上；将图2与图1进行对比可以看出，葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物对于rcfbf细胞的增殖具有协同促进作用。
126.不同浓度的清蒸肉苁蓉水提取物对于rcfbf细胞的毒性作用如图3所示；从图中可以看出，清蒸肉苁蓉水提取物有助于rcfbf细胞培养，在低浓度时毒性较小，当浓度增加到一定程度后再增加浓度对于rcfbf细胞的毒性增加，但是浓度在5000μg/ml内细胞存活率在80％以上；将图3与图1进行对比可以看出，清蒸肉苁蓉水提物的毒性与酒炙肉苁蓉水提物的毒性趋势相同，说明肉苁蓉提取物对于rcfbf细胞的毒性与肉苁蓉的炮制方式没有关系。
127.不同浓度的新鲜肉苁蓉多糖对于rcfbf细胞的毒性作用如图4所示；从图中可以看出，新鲜肉苁蓉多糖对rcfbf细胞的增殖起促进作用，尤其是在新鲜肉苁蓉多糖浓度为100、500μg/ml时，对rcfbf细胞的增殖促进作用最大，在较低浓度和较高浓度时存活率较低。说明在较低浓度时，对细胞增殖促进作用不明显；在较高浓度时，细胞毒性较大，但是浓度在3000μg/ml内细胞存活率在90％以上。
128.2.2、大鼠成纤维结膜细胞(rcfc)细胞毒性实验
129.将rcfc细胞在含5％胎牛血清(fcs)的f12培养基中于37℃(5％co2和饱和湿度)培养48～72h。收集对数期的细胞，并将细胞悬液浓度调节至1
×
105细胞/ml。将细胞添加至96孔板(边缘孔中充满无菌pbs)，在37℃下培养24h，然后用不同浓度的样品处理。孵育24h后，按每孔100μl将经不同浓度的样品处理后得到的细胞添加到12孔板中，培养12h后，再添加不同浓度的样品进行处理。处理4h后，移出培养基，并向每个孔中添加100μlmtt(0.5mg/ml)，继续培养4h。然后将上清液吸出，并将150μl的二甲基亚砜(dmso)添加到96孔板中，将其置于摇床上，以低速完全溶解晶体。通过酶标仪测量570nm处的吸光度。细胞存活率按以下公式计算：
130.细胞存活率(％)＝abs
样品
/abs
对照
×
100
131.不同浓度的酒炙肉苁蓉水提取物对于rcfc细胞的毒性作用如图5所示；从图中可以看出，酒炙肉苁蓉水提取物对rcfc细胞的增殖促进效果随浓度的增加而增加，说明酒炙肉苁蓉水提取物对rcfc细胞的增殖起促进作用。
132.不同浓度的葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfc细胞的毒性作用如图6所示；从图中可以看出，葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfc细胞的增殖促进效果随浓度的增加而增加。
133.不同浓度的清蒸肉苁蓉水提取物对于rcfc细胞的毒性作用如图7所示；从图中可以看出，清蒸肉苁蓉水提物对rcfc细胞增殖起促进作用。
134.不同浓度的新鲜肉苁蓉多糖对于rcfc细胞的毒性作用如图8所示；从图中可以看出，新鲜肉苁蓉多糖对rcfc细胞的毒性较小，低浓度时，对rcfc细胞有促进作用，浓度增加时，毒性增加不明显。
135.3、细胞划痕实验
136.分别采用兔角膜前基质成纤维细胞(rcfbf)和大鼠成纤维结膜细胞(rcfc)考察不同样品对细胞的修复作用
137.3.1、兔角膜前基质成纤维细胞(rcfbf)划痕实验
138.将rcfbf细胞在含5％胎牛血清(fcs)的f12培养基中于37℃(5％co2和饱和湿度)培养48～72h。收集对数期的细胞，并将细胞悬液浓度调节至1
×
105细胞/ml。将rcfbf细胞传代种植于12孔细胞培养板中在37℃下培养12h，待细胞融合长满。用黑色记号笔于培养板底部画标记线，在无菌环境直视下使用200μl微量移液器，tip头严格按标记线条用力均匀地制成纵划痕损伤，划痕宽度约1mm。然后每孔加入500μl经灭菌的样品进行处理，以完全培养基作为阴性对照组；孵育24h后，观察划痕状态。
139.不同浓度的酒炙肉苁蓉水提取物对rcfbf细胞划痕的修复作用如图9所示。不同浓度的葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfbf细胞划痕的修复作用如图10所示。不同浓度的清蒸肉苁蓉水提取物对rcfbf细胞划痕的修复作用如图11所示。不同浓度的
新鲜肉苁蓉多糖对rcfbf细胞划痕的修复作用如图12所示。从图9可以看出，酒炙肉苁蓉水提取物对rcfbf细胞划痕没有明显的修复作用，且在较高浓度浓度下，有较高的细胞毒性，导致细胞死亡。从图10可以看出，葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfbf细胞划痕在高浓度下有修复效果。从图11可以看出，清蒸肉苁蓉提取物对rcfbf细胞划痕没有修复作用，且存在较强的细胞毒性。从图12可以看出，新鲜肉苁蓉多糖对rcfbf细胞划痕有修复效果，但是该样品较容易染菌，需要注意无菌操作。
140.3.2、大鼠成纤维结膜细胞(rcfc)划痕实验
141.将rcfc细胞在含5％胎牛血清(fcs)的f12培养基中于37℃(5％co2和饱和湿度)培养48～72h。收集对数期的细胞，并将细胞悬液浓度调节至1
×
105细胞/ml。将rcfc细胞传代种植于12孔细胞培养板中在37℃下培养12h，待细胞融合长满。用黑色记号笔于培养板底部画标记线，在无菌环境直视下使用200μl微量移液器，tip头严格按标记线条用力均匀地制成纵划痕损伤，划痕宽度约1mm。然后每孔加入500μl经灭菌的样品进行处理，以完全培养基作为阴性对照组；孵育24h后，观察划痕状态。
142.不同浓度的酒炙肉苁蓉水提取物对rcfc细胞划痕的修复作用如图13所示。不同浓度的葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfc细胞划痕的修复作用如图14所示。不同浓度的清蒸肉苁蓉水提取物对rcfc细胞划痕的修复作用如图15所示。不同浓度的新鲜肉苁蓉多糖对rcfc细胞划痕的修复作用如图16所示。从图13可以看出，酒炙肉苁蓉水提取物对rcfc细胞划痕存在一定修复效果，但是修复效果没有浓度差异。从图14可以看出，葡萄籽提取物和酒炙肉苁蓉水提取物的混合液对rcfc细胞划痕没有显著影响，说明该混合物不能促进rcfc细胞增殖。从图15可以看出，清蒸肉苁蓉水提取物对rcfc细胞划痕影响不大，在细胞培养48小时后，划痕出现了修复趋势，且细胞没有出现死亡。从图16可以看出，新鲜肉苁蓉多糖对rcfc细胞划痕有明显的修复效果，在培养24h后已经出现了明显的修复效果，在培养48h后，划痕进一步缩小。
143.应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

技术特征：
1.一种肉苁蓉提取物在制备缓解白内障的外用制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肉苁蓉提取物选自以下任意一种或多种：酒炙肉苁蓉水提取物、新鲜肉苁蓉多糖、清蒸肉苁蓉水提取物；优选地，所述酒炙肉苁蓉水提取物的提取方法包括如下步骤：(1)将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥、粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h；(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得；所述新鲜肉苁蓉多糖的提取方法包括如下步骤：(1)将肉苁蓉鲜干片粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h，过滤分离得到提取液；(2)将提取液进行浓缩后加入乙醇使浓缩液在体积分数为75～85％的乙醇中进行沉淀，沉淀结束后分离出沉淀并进行冷冻干燥得到固体粉末，即得；所述清蒸肉苁蓉水提取物的提取方法包括如下步骤：(1)将清蒸肉苁蓉粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h；(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括将肉苁蓉提取物与葡萄籽提取物复合应用于制备缓解白内障的外用制剂；优选地，所述葡萄籽提取物是葡萄籽的水溶性提取物；更优选地，所述葡萄籽提取物在外用制剂中的浓度不超过1mg/ml。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述葡萄籽提取物的提取方法包括如下步骤：(1)取干燥葡萄籽加入15～25倍质量的水，在50～70℃下提取1.5～2.5h；(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得；优选地，所述提取用的水是蒸馏水。5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述外用制剂包括眼部护理液和/或眼部外用药剂，优选地，所述眼部护理液的溶剂为世罕泉。6.一种缓解白内障的外用制剂，其特征在于，所述外用制剂含肉苁蓉提取物；优选地，所述肉苁蓉提取物选自以下任意一种或多种：酒炙肉苁蓉水提取物、新鲜肉苁蓉多糖、清蒸肉苁蓉水提取物；更优选地，所述酒炙肉苁蓉水提取物的提取方法包括如下步骤：(1)将肉苁蓉经过黄酒闷润后干燥、粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h；(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得；所述新鲜肉苁蓉多糖的提取方法包括如下步骤：(1)将肉苁蓉鲜干片粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h，过滤分离得到提取液；(2)将提取液进行浓缩后加入乙醇使浓缩液在体积分数为75～85％的乙醇中进行沉淀，沉淀结束后分离出沉淀并进行冷冻干燥得到固体粉末，即得；所述清蒸肉苁蓉水提取物的提取方法包括如下步骤：(1)将清蒸肉苁蓉粉碎，加入15～25倍质量的水，在70～90℃下提取1.5～2.5h；
(2)对所得到的提取液的上清液进行干燥即得。7.根据权利要求6所述的外用制剂，其特征在于，所述外用制剂包括眼部护理液和/或眼部外用药剂；优选地，所述眼部护理液的溶剂为世罕泉。8.根据权利要求6所述的外用制剂，其特征在于，所述外用制剂还包括葡萄籽提取物，优选地，所述葡萄籽提取物是葡萄籽的水溶性提取物；更优选地，所述葡萄籽提取物在外用制剂中的浓度不超过1mg/ml。9.权利要求6-8中任一项所述的外用制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将肉苁蓉提取物加入到溶剂中，使其完全溶解后过滤除菌；优选地，所述制备方法还包括往溶剂中加入葡萄籽提取物，使其在溶剂中完全溶解。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在过滤除菌之前加入渗透压调节剂调节外用制剂的渗透压为1～100mosmol/bg；和或所述过滤的滤膜孔径为0.2～0.3μm；和或所述除菌包括在紫外灯光下照射1～3h。

技术总结
本发明涉及一种肉苁蓉提取物在制备缓解白内障的外用制剂中的应用，还提供了一种缓解白内障的外用制剂及其制备方法；所述肉苁蓉提取物选自以下任意一种或多种：酒炙肉苁蓉水提取物、新鲜肉苁蓉多糖、清蒸肉苁蓉水提取物。本发明的外用制剂成分简单、无明显细胞毒性，对细胞的划痕具有一定的修复能力；对于白内障的预防和/或治疗具有良好的应用前景。而且本发明的外用制剂制备方法简单、生产成本低。生产成本低。生产成本低。


技术研发人员：邵德望 赵兵 张洁
受保护的技术使用者：润邦生物科技（北京）有限责任公司
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/1