一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法与流程

1.本发明涉及分析化学技术领域，具体而言，涉及一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法。


背景技术：

2.司美格鲁肽属于胰高血糖素样肽-1受体激动剂（glp-1受体激动剂）类降糖药物，这种药物以葡萄糖依赖的形式增加胰岛素分泌，抑制胰高糖素分泌，并可促进胃排空，可以中枢性抑制食欲，减少进食量，进而减少葡萄糖的吸收，达到降低血糖的作用。
3.司美格鲁肽在国内外均已能够大规模生产，其中酸性底物2,5-dioxopyrrolidin-1-yl(6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate为其关键侧链，该关键侧链在合成过程中经常使用到胺类溶剂作为缩合剂/缚酸剂。上述酸性底物制备过程中使用了胺类溶剂物料，可能有残留，从而带入最终药品中，增加患者用药风险。
4.因此，建立一种酸性底物中测定胺类溶剂方法，完善酸性底物的质量控制，对于提升酸性底物质量，减少终产品风险，是非常有必要的。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法，旨在更精确地检测酸洗底物中胺类溶剂的含量。
7.本发明是这样实现的：第一方面，本发明提供一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法，包括：将酸性底物与有机溶媒和碱性反应液混合得到供试品溶液；将胺类溶剂对照品、有机溶媒和碱性反应液混合得到对照品储备溶液；采用气相色谱法对供试品溶液和对照品储备溶液进行检测，利用外标一点法计算酸性底物中胺类溶剂的含量；其中，碱性反应液选自氨水和氢氧化钠溶液中的至少一种。
8.在可选的实施方式中，有机溶媒选自二甲基亚砜、n-n二甲基乙酰胺和异丙醇中的至少一种；优选地，有机溶媒为二甲基亚砜。
9.在可选的实施方式中，在供试品溶液中，酸性底物的浓度为50mg/ml-200mg/ml；优选为80mg/ml-120mg/ml。
10.在可选的实施方式中，每0.2g酸性底物对应碱性反应液的用量为0.01ml-0.50ml；优选为0.08ml-0.15ml；优选地，经碱性反应液处理之后，供试品溶液的ph值为7.5-8.0；
优选地，供试品溶液的制备过程包括：先将酸性底物和部分有机溶媒混合，再与碱性反应液混合，然后再与剩余有机溶媒混合；优选地，采用外标一点法计算酸性底物中胺类溶剂的含量，具体公式如下：式中：ai表示供试品溶液色图谱中溶剂i的峰面积；as表示对照品溶液色图谱中溶剂i的峰面积；ms表示对照品中溶剂i的称样量，mg；vs表示对照品溶液稀释体积，ml；m
供
表示供试品称样量，mg；v
供
表示供试品溶液稀释体积，ml；pi表示溶剂i对照品的含量，%。
11.在可选的实施方式中，在对照品储备溶液中，胺类溶剂对照品的浓度为0.20mg/ml-1.00mg/ml；优选为0.20mg/ml-0.30mg/ml。
12.在可选的实施方式中，酸性底物选自2，5-二氧代吡咯烷-1-基（6s，12s）-12-（3-（叔丁氧基）-3-氧代丙基)-2,2,9,9,9-四甲基-4，7，10，13-四氧代-6-（（1-三丁基-1h-咪唑-4-基）甲基）-3-氧杂-5，8，11，14-四氮杂十六烷-16-酸酯、(s)-22-羧基-1-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1，10，19，24-四氧代-3，6，12，15-四氧杂-9，18，23-三氮杂四十一烷酸、(s)-2-（2-叔丁氧羰基)氨基)-3-（1-三苯甲基
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1h-咪唑-4-基)丙酰胺)-2-甲基丙酸中的至少一种；优选地，胺类溶剂选自三乙胺、n-甲基吗啉和n,n-二异丙基乙胺中的至少一种。
13.在可选的实施方式中，按质量分数计，所采用的色谱柱的固定相包括：氰丙基苯基5%-7%和二甲基聚硅氧烷93%-95%；优选地，采用agilent8860气相色谱仪进行检测；优选地，采用顶空进样器进行加热，从而使有机溶媒悬浮于顶空瓶上端；优选地，采用分流进样的方式时，控制分流进样比为（5-50）:1；更优选为（10-20）:1。
14.在可选的实施方式中，测试过程中的升温程序如下：控制初始温度为30℃-60℃，保持1min-18min，然后控制以5℃/min-25℃/min的升温速率升温至110℃-130℃，保持3min-10min，再以10℃/min-20℃/min的升温速率升温至190℃-210℃，保持3min-15min；优选地，控制初始温度为35℃-45℃，保持4min-6min，然后控制以7℃/min-9℃/min的升温速率升温至115℃-125℃，保持8min-10min，再以18℃/min-22℃/min的升温速率升温至195℃-205℃，保持4min-6min。
15.在可选的实施方式中，控制进样口温度为180℃-240℃，fid检测器温度为220℃-270℃；控制色谱柱流速为2.0ml/min-3.5ml/min，氢气流量为30ml/min-50ml/min；空气流量为300ml/min-500ml/min，尾吹气流量为25ml/min-50ml/min；定量环体积为1.0ml，顶空平衡温度为70℃-90℃，传输线温度为80℃-120℃，定量
环温度85℃-120℃，顶空平衡时间为15min-50min，进样持续时间为0.1min-1.0min。
16.在可选的实施方式中，控制进样口温度为190℃-210℃，fid检测器温度为240℃-260℃；控制色谱柱流速为2.3ml/min-2.7ml/min，氢气流量为30ml/min-35ml/min；空气流量为300ml/min-350ml/min，尾吹气流量为25ml/min-30ml/min；定量环体积为1.0ml，顶空平衡温度为85℃-90℃，传输线温度为105℃-115℃，定量环温度100℃-110℃，顶空平衡时间为40min-50min，进样持续时间为0.3min-0.7min。
17.本发明具有以下有益效果：利用酸性底物与有机溶媒和碱性反应液混合制备供试品溶液，利用碱性反应液和酸性底物中的游离酸反应，防止游离酸会干扰测定过程，减少或避免基质效应，提高检测的准确性。本发明提供的检测方法线性范围宽、精密度好、简捷快速高效，能够很好地控制酸性底物的质量。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
19.图1是本发明实施例的空白溶液图谱；图2是本发明实施例的定位溶液图谱；图3是本发明做示例性说明的胺类溶剂的线性溶液图谱；图4是本发明除示例性外可测定的其余典型胺类溶剂图谱。
具体实施方式
20.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
21.本发明实施例提供一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法，包括：s1、配制供试品溶液供试品溶液的制备过程包括：将酸性底物与有机溶媒和碱性反应液混合，通过碱性反应液对酸性底物进行极性处理，与游离酸反应，防止游离酸干扰胺类溶剂含量的测定，减少或避免基质效应，实现有机胺溶剂的准确分析。
22.在一些实施例中，酸性底物选自2,5-dioxopyrrolidin-1-yl(6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate、(s)-22-carboxy-1-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-1,10,19,24-tetraoxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-triazahentetracontan-41-oic acid、(s)-2-(2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(1-trityl-1h-imidazol-4-yl)propanamido)-2-methylpropanoic acid中的至少一种，可以为以上任意一种或几种，但不限于此，本发明实
施例所提供的检测方法适用于任意含有胺类溶剂的酸性底物的检测，只要酸性底物可以溶解于本发明实施例中的有机溶媒，均能够准确分析出酸性底物中胺类溶剂的含量。胺类溶剂选自三乙胺、n-甲基吗啉和n,n-二异丙基乙胺中的至少一种，可以为以上任意一种或几种。
23.酸性底物名称为：2,5-dioxopyrrolidin-1-yl(6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate，中文名称为2，5-二氧代吡咯烷-1-基（6s，12s）-12-（3-（叔丁氧基）-3-氧代丙基)-2,2,9,9,9-四甲基-4，7，10，13-四氧代-6-（（1-三丁基-1h-咪唑-4-基）甲基）-3-氧杂-5，8，11，14-四氮杂十六烷-16-酸酯；结构式为：；酸性底物名称为：(s)-22-carboxy-1-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-1,10,19,24-tetraoxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-triazahentetracontan-41-oic acid，中文名称为：(s)-22-羧基-1-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1，10，19，24-四氧代-3，6，12，15-四氧杂-9，18，23-三氮杂四十一烷酸；结构式为：；酸性底物名称为：(s)-2-(2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(1-trityl-1h-imidazol-4-yl)propanamido)-2-methylpropanoic acid，中文名称为：(s)-2-（2-叔丁氧羰基)氨基)-3-（1-三苯甲基
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1h-咪唑-4-基)丙酰胺)-2-甲基丙酸；结构式为：。
24.在一些实施例中，有机溶媒选自二甲基亚砜、n-n二甲基乙酰胺和异丙醇中的至少一种，可以为以上任意一种或几种；优选地，有机溶媒为二甲基亚砜，通过对有机溶媒进行优选，能够进一步提高检测的准确性。
25.在一些实施例中，碱性反应液选自氨水、氢氧化钠溶液（质量分数可以为0.1%）中的至少一种，可以为以上任意一种或几种，均能够与游离酸进行充分反应。
26.进一步地，在供试品溶液中，酸性底物的浓度为50mg/ml-200mg/ml，优选为80mg/ml-120mg/ml；每0.2g酸性底物对应碱性反应液的用量为0.01ml-0.50ml；优选为0.08ml-0.15ml；经碱性反应液处理之后，供试品溶液的ph值为7.5-8.0。通过对各原料的用量进行优化，以进一步提升检测的准确性。
27.具体地，每0.2g酸性底物对应碱性反应液的用量可以为0.01ml、0.05ml、0.08ml、0.10ml、0.15ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml、0.50ml等。通过控制有机溶媒的用量，使酸性底物在供试品溶液中的浓度为50mg/ml、60mg/ml、80mg/ml、100mg/ml、120mg/ml、150mg/ml、200mg/ml等。
28.2,5-dioxopyrrolidin-1-yl(6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate可以来自于市售，也可以本领域技术人员进行制备，为了便于说明本发明实施例的效果，可以采用市售的试剂级别的胺类溶剂。
29.在一些实施例中，供试品溶液的制备过程包括：先将酸性底物和部分有机溶媒混合，再与碱性反应液混合，然后再与剩余有机溶媒混合。先利用部分有机溶媒（如50%用量的有机溶媒）将酸洗底物溶解，加入碱性反应液混合反应之后再加入剩余有机溶媒。
30.s2、配置对照品储备溶液对照品储备溶液的制备过程包括：将胺类溶剂对照品、有机溶媒和碱性反应液混合，有机溶媒的种类与制备供试品溶液所使用的有机溶媒相同，具体种类可以参照s1中的内容。
31.在一些实施例中，在对照品储备溶液中，胺类溶剂对照品的浓度为0.20mg/ml-1.00mg/ml；优选为0.20mg/ml-0.30mg/ml，可以制备多种浓度的对照品储备溶液，以绘制成标准曲线。具体地，胺类溶剂对照品的浓度可以为0.20mg/ml、0.30mg/ml、0.40mg/ml、0.50mg/ml、0.60mg/ml、0.70mg/ml、0.80mg/ml、0.90mg/ml、1.00mg/ml等。
32.s3、色谱分析采用气相色谱法对供试品溶液和对照品储备溶液进行检测，利用外标法计算酸性底物中胺类溶剂的含量。外标法具体可以为外标一点法，具体公式如下：；式中：ai表示供试品溶液色图谱中溶剂i的峰面积；as表示对照品溶液色图谱中溶剂i的峰面积；ms表示对照品中溶剂i的称样量，mg；vs表示对照品溶液稀释体积，ml；m
供
表示供试品称样量，mg；v
供
表示供试品溶液稀释体积，ml；
pi表示溶剂i对照品的含量，%。
33.在一些实施例中，采用agilent8860气相色谱仪进行检测，但不限于此。按质量分数计，所采用的色谱柱的固定相包括：氰丙基苯基5%-7%和二甲基聚硅氧烷93%-95%，发明人通过对色谱柱的固定相进行优化，以进一步提高检测效果。
34.具体地，色谱柱的固定相中，氰丙基苯基的质量分数可以为5%、6%、7%等，二甲基聚硅氧烷的质量分数可以为93%、94%、95%等。
35.发明人对测试过程的升温程序进行了优化，测试过程中的升温程序如下：控制初始温度为30℃-60℃，保持1min-18min，然后控制以5℃/min-25℃/min的升温速率升温至110℃-130℃，保持3min-10min，再以10℃/min-20℃/min的升温速率升温至190℃-210℃，保持3min-15min。优选地，控制初始温度为35℃-45℃，保持4min-6min，然后控制以7℃/min-9℃/min的升温速率升温至115℃-125℃，保持8min-10min，再以18℃/min-22℃/min的升温速率升温至195℃-205℃，保持4min-6min。通过优化升温程序，采用逐步升温的方式并优化每一步升温的速率和保温时间，使操作更加准确。
36.在优选的实施例中，升温程序如下：初始温度为40℃，保持5min，以8℃/min升温至120℃，保持10min，以20℃/min升温至200℃，保持5min。
37.发明人还优化了检测过程中的其他色谱条件：控制进样口温度为180℃-240℃，fid检测器温度为220℃-270℃；控制色谱柱流速为2.0ml/min-3.5ml/min，氢气流量为30ml/min-50ml/min；空气流量为300ml/min-500ml/min，尾吹气（如氮气）流量为25ml/min-50ml/min；定量环体积为0.5ml-2ml，顶空平衡温度为70℃-90℃，传输线温度为80℃-120℃，定量环温度85℃-120℃，顶空平衡时间为15min-50min，进样持续时间为0.1min-1.0min。优选地，控制进样口温度为190℃-210℃，fid检测器温度为240℃-260℃；控制色谱柱流速为2.3ml/min-2.7ml/min，氢气流量为30ml/min-35ml/min；空气流量为300ml/min-350ml/min，尾吹气流量为25ml/min-30ml/min；定量环体积为1.0ml，顶空平衡温度为85℃-90℃，传输线温度为105℃-115℃，定量环温度100℃-110℃，顶空平衡时间为40min-50min，进样持续时间为0.3min-0.7min。通过对色谱条件优化，有利于进一步提高检测的精确度。使用顶空进样器对产品加热从而使溶剂混悬于顶空瓶上端，从而减少了产品基质对待测胺类溶剂的干扰。
38.在优选的实施例中，色谱条件如下：进样口温度为200℃，fid检测器温度为250℃，色谱柱流速为2.5 ml/min，氢气流量为30ml/min，空气流量为300 ml/min，尾吹气（n2）流量为25 ml/min，分流比为15：1，定量环体积为1 ml，顶空平衡温度为90℃，传输线温度为110℃，定量环温度为105℃，顶空平衡时间45 min，进样持续时间为0.5min。
39.需要说明的是，进样口温度的设定一般根据所用溶剂的沸点而定，通常需高于所用溶剂沸点30℃以上，并不低于0℃，且最好不要高于色谱柱所能耐受的最高温度，以保证样品能瞬间完全汽化以及延长色谱柱的使用寿命；检测器的一般要求是温度不低于0℃且最好不超过425℃，优选色谱仪的进样口为200℃，检测器温度250℃。
40.具体地，所使用的载气为本常用高纯氮气或氦气，优选为高纯度氮气，其中高纯度是指纯度范围≥99.999%。
41.在一些实施例中，采用分流进样的方式时，控制分流进样比为（5-50）:1；更优选为（10-20）:1，具体可以为5:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1等。
42.需要说明的是，进样的过程，既可以做分流进样，也可以不分流进样。针对不同检测对象的限度要求进行选择即可，以使灵敏度满足要求。在一些实施例中，采用分流进样时，可以根据本发明实施例结合本领域常识来确定分流比。分流比为本领域的常规技术术语，分流比的气流即为载气，具体的载气类型可以为高纯氮气，例如当分流比为5:1时，系指将一份进样量分成六份，取一份进行测定，另外五份随尾气排放出去。同理，当分流比为15:1时，系指将一份进样量分成十六份，取一份进行测定，另外十五份随尾气排放出去。
43.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
44.以下实施例和对比例所使用的仪器如下，所用试剂如表1所示。
45.仪器说明：（1）气相色谱仪（型号：gc8860、品牌：aniglent），顶空进样器（型号：7697a、品牌：aniglent）。（2）天平：万分之一电子天平（型号：fa1004b、厂家：上海佑科仪器仪表有限公司）。
46.表1 所用试剂种类说明实施例1本实施例提供一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法，以二甲基亚砜为溶剂，以氨水为反应液，包括如下步骤：空白溶液：精密量取溶剂2.0ml，反应液0.1ml置于20ml顶空瓶，轧盖密封即得空白溶液。
47.对照品溶液：取胺类溶剂对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并制成每1ml中约含胺类溶剂500μg的对照品储备液；精密量取对照品贮备液2.0ml，反应液0.1ml置于20 ml顶空瓶中，轧盖密封即得对照品溶液。
48.供试品溶液：称取本品0.2 g，精密称定，置于20 ml顶空瓶，加入1.0ml溶剂使其溶解，加入反应液0.1ml反应5min，再加入1.0ml溶剂，轧盖密封得每毫升约95.2mg的供试品溶液。
49.采用气相色谱法对以上溶液进行检测，色谱条件：色谱柱：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的db-624（60m
×
0.53mm
×
3μm）石英毛细管柱；升温程序：初始温度为40℃，保持5min，以8℃/min升温至120℃，保持10min，以20℃/min升温至200℃，保持5min。进样口温度:200℃；fid检测器温度：250℃；色谱柱流速：2.5 ml/min；氢气流量：30ml/min；空气流量：300 ml/min；尾吹气（n2）流量：25 ml/min；分流比：15：1；定量环体积：1 ml；顶空平衡温度：90℃；传输线温度110℃；定量环温度105℃；顶空平衡时间45 min；进样持续时间：0.5min。
50.外标一点法测定2,5-dioxopyrrolidin-1-yl (6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate中的胺类溶剂含量。
51.具体公式如下：ai：供试品溶液色图谱中溶剂i的峰面积；as：对照品溶液色图谱中溶剂i的峰面积；ms：对照品中溶剂i的称样量，mg；vs：对照品溶液稀释体积，ml；m
供
：供试品称样量，mg；v
供
：供试品溶液稀释体积，ml；pi：溶剂i对照品的含量。
52.本实施例的空白溶液图谱如图1所示。
53.试验例1测试实施例1提供方法的系统适用性，对照品溶液连续顶空进样六针，胺类溶剂的峰面积的rsd值不得超过10.0%，保留时间rsd值不得过1.0%。系统适应性测试结果如表2所示。
54.表2系统适用性结果表由表2可知，6针对照品溶液连续顶空分析六次，胺类溶剂的峰面积rsd值为1.1%，保留时间rsd值为0.01%，系统适用性良好。
55.试验例2
测试实施例1提供检测方法的专属性，结果如表3所示，定位溶液图谱如图2所示。
56.胺类溶剂定位溶液配制：准备20 ml 顶空瓶，精密加入2.0ml溶剂， 0.1ml反应液，加入胺类溶剂1μl，立即扎盖密封，作为定位溶液。
57.表3专属性结果表由表3可知，空白基线平稳，不干扰待分析溶剂的检测。胺类溶剂定位溶液与系统适用性溶液中胺类溶剂的保留时间一致，该方法专属性良好。
58.试验例3测试实施例1提供检测方法的重复性，结果如表4所示。
59.测试方法：（1）对照品溶液贮备液：称取胺类溶剂对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并制成每1ml中约含胺类溶剂500μg的对照品溶液贮备液。
60.（2）重复性样品溶液：精密移取对照品储备液12.5ml置于25ml量瓶，加入溶剂稀释至刻度，摇匀，即作为溶液a；称取6份0.2g2,5-dioxopyrrolidin-1-yl(6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate，精密称定，置于20 ml顶空瓶中，加入溶液a 1.0ml使溶解，加入反应液0.1ml反应5min，再加入溶液a 1.0ml，轧盖密封即得6份平行供试液。
61.（3）分别按实施例1中的方法，取6份平行供试液进行气相色谱顶空进样分析，并计算6份平行供试液对应的2,5-dioxopyrrolidin-1-yl (6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate中胺类溶剂含量，结果见下表：表4 重复性结果表名称胺类溶剂的含量%供试液010.2304供试液020.2367供试液030.2298供试液040.2314供试液050.2400供试液060.2327rsd（%）1.7由表4可知，重复性6份供试液中胺类溶剂含量rsd不高于10.0%，该方法重复性良好。
62.试验例4测试实施例1提供检测方法的定量限、检测限，结果如表5和表6所示。
63.测试方法：（1）胺类溶剂定量限贮备液：称取胺类溶剂0.5031g，精密称定，置于100ml量瓶中，加入溶剂，稀释至刻度线，摇匀，记溶液b；移取溶液b 1.0ml置于100ml量瓶中，加入溶剂，稀释至刻度，摇匀，记溶液c；移取溶液c 1.0ml置于100ml量瓶中，加入溶剂，稀释至刻度线，摇匀，即得胺类溶剂定量限储备液。
64.（2）胺类溶剂检测限贮备液：精密量取胺类溶剂定量限贮备液12.5ml置于25ml量瓶中，加入溶剂，稀释至刻度，摇匀，即得胺类溶剂检测限贮备液。
65.（3）分别精密移取2.0ml胺类溶剂定量限、检测限贮备液置于20ml顶空瓶中，加入0.1ml反应液，轧盖密封，照实施例1进样，信噪比约为10时的浓度为定量限，定量限样品连续进样6次；信噪比约为3时的浓度为检测限，检测限样品连续进样3次。
66.由表5，表6可知，胺类溶剂定量限为0.000474mg/ml，占供试品浓度百分比0.0005%，检测限为0.000237mg/ml，占供试品浓度百分比0.0002%，该方法灵敏度高。
67.表5定量限结果表注：表5中loq-1至loq-6分别表示三乙胺定量限1-6次进样结果。表6 检测限结果表
注：表6中lod-1至lod-3分别表示三乙胺检测限1-3次进样。
68.试验例5对实施例1提供检测方法进行线性和范围试验，结果如表7所示，胺类溶剂的线性溶液图谱如图3所示。
69.测试方法：（1）胺类溶剂限度贮备液：称取胺类溶剂0.4944g，精密称定，置于100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，记溶液b；移取溶液b 1.0ml置于100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，记溶液c；移取溶液c 1.0ml置于100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得胺类溶剂限度贮备液。
70.（2）胺类溶剂对照品贮备液：称取胺类溶剂0.5138g，精密称定，置于100ml量瓶，加入溶剂稀释至刻度，即得胺类溶剂对照品贮备液。
71.（3）线性溶液：限度线性溶液：精密移取胺类溶剂限度贮备液2.0ml至20ml顶空瓶，加入0.1ml反应液，轧盖密封，即得。
72.25%线性溶液：精密量取胺类溶剂对照品溶液贮备液0.25ml置于10ml量瓶中，加入溶剂稀释至刻度，精密移取溶液2.0ml至20ml顶空瓶，加入0.1ml反应液，轧盖密封，即得。
73.50%线性溶液：精密量取胺类溶剂对照品溶液贮备液0.50ml置于10ml量瓶中，加入溶剂稀释至刻度，精密移取溶液2.0ml至20ml顶空瓶，加入0.1ml反应液，轧盖密封，即得。
74.100%线性溶液：精密量取胺类溶剂对照品溶液贮备液1.0ml置于10ml量瓶中，加入溶剂稀释至刻度，精密移取溶液2.0ml至20ml顶空瓶，加入0.1ml反应液，轧盖密封，即得。
75.150%线性溶液：精密量取胺类溶剂对照品溶液贮备液1.5ml置于10ml量瓶中，加入溶剂稀释至刻度，精密移取溶液2.0ml至20ml顶空瓶，加入0.1ml反应液，轧盖密封，即得。
76.200%线性溶液：精密量取胺类溶剂对照品溶液贮备液2.0ml置于10ml量瓶中，加入溶剂稀释至刻度，精密移取溶液2.0ml至20ml顶空瓶，加入0.1ml反应液，轧盖密封，即得。
77.按照实施例1色谱条件依次进样，记录色谱图。以胺类溶剂浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，拟合标准工作曲线。胺类溶剂的标准工作曲线见下表7所示。
78.表7 胺类溶剂线性结果表
由表7可知，在0.00047mg/ml~0.96888 mg/ml（0.1%～200.0%限度浓度）范围内，胺类溶剂线性方程为：y=10047x-5.0672，相关系数r=0.9998；线性关系良好。
79.试验例6对实施例1提供检测方法进行准确度试验，结果如表8所示。
80.测试方法：（1）空白样品溶液：称取本品0.2g，精密称定，分别置于20 ml顶空瓶中，加入1.0ml溶剂溶解，然后加入0.1ml反应液反应5min，再加入1.0ml溶剂，扎盖密封即得，平行配制3份。
81.（2）准确度溶液：50%准确度溶液：称取本品0.2g，精密称定，分别置于20 ml顶空瓶中，加入1.0ml溶剂溶解，然后加入0.1ml反应液反应5min，再加入0.5ml对照品储备液及0.5ml溶剂，扎盖密封即得，平行配制3份。
82.100%准确度溶液：称取本品0.2g，精密称定，分别置于20 ml顶空瓶中，加入1.0ml溶剂溶解，然后加入0.1ml反应液反应5min，再加入1.0ml对照品储备液，扎盖密封即得，平行配制3份。
83.150%准确度溶液：称取本品0.20g，精密称定，分别置于20 ml顶空瓶中，加入1ml对照品储备液溶解，然后加入0.1ml反应液反应5min，再加入1.5ml对照品储备液及0.5ml溶剂，扎盖密封即得，平行配制3份。
84.（3）按照实施例1色谱条件配制对照品溶液。（4）取对照品溶液，空白样品溶液，各浓度准确度溶液按实施例1色谱条件各进行3次进样分析，胺类溶剂回收率测得值应在80%~120%的范围内；回收率测得值的rsd不得过
10.0%。
85.表8回收率试验结果注：表8中利用回收率表示准确度。
86.由表8可知，胺类溶剂的平均回收率为97.5%，rsd为2.4%；符合规定，该方法回收率高。
87.试验例7对实施例1提供检测方法进行耐用性试验，结果如表9所示。
88.相对于实施例1色谱条件变化为：改变色谱柱流速：
±
0.2ml/min；改变顶空平衡时间：
±
2min；改变顶空平衡温度：
±
2℃。
89.表9耐用性结果表名称含量（%）初始0.2304流速2.4ml/min0.2363流速2.6ml/min0.2345平衡时间43min0.249平衡时间47min0.2257平衡温度88℃0.2397平衡温度92℃0.2301均值0.2351rsd%3.5由表9可知，统计标准条件和改变条件下胺类溶剂的含量rsd不高于10.0%，该方法耐用性良好。
90.试验例8采用本实施例方法对n-甲基吗啉、n,n-二异丙基乙胺等胺类溶剂进行测定，各胺类溶剂均能有效定量检出。测试图谱见附图4。
91.对比例1与实施例1的区别仅在于：空白溶液、对照品溶液和供试品溶液配置过程中均不加入反应液。
92.结果显示：供试品溶液中胺类试剂无法检出，酸性底物干扰胺类试剂测定。
93.对比例2与实施例1的区别仅在于：色谱柱的种类不同，具体为：选用以 5％苯基-亚芳基，95％二甲基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱。
94.采用色谱条件为：升温程序：初始温度40℃，保持5 min，以8℃/min升温至120℃，保持2 min，以23℃/min升温至200℃，保持5min；进样口设置：温度：200℃；分流比：20:1；载气：高纯氮气；色谱柱流速：1.0ml/min；fid检测器设置：温度：250℃；氢气流量：30 ml/min;空气流量：300 ml/min;尾吹气（n2）：25 ml/min；顶空进样器设置：顶空平衡温度：80℃；顶空平衡时间：30 min；传输线温度100℃ 定量环温度90℃；进样持续时间：0.5min；溶液配制为：溶剂：二甲基亚砜（dmso），反应液：氨水；空白溶液：精密量取溶剂2.0ml，0.1ml反应液置于20ml顶空瓶，轧盖密封即得空白溶液；供试品溶液：称取本品0.2 g，精密称定，置于20 ml顶空瓶中，加入溶剂1.0ml溶剂使溶解，加入反应液0.1ml反应5min，再加入溶剂1.0ml，轧盖密封得每毫升约95.2 mg的供试品溶液；对照品溶液贮备液：分别取甲醇对照品，乙醇对照品、异丙醇对照品、乙腈对照品，二氯甲烷对照品，甲基叔丁基醚对照品、乙酸乙酯对照品、四氢呋喃对照品，三乙胺对照品，正庚烷对照品，n,n-二甲基甲酰胺对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并制成每1ml中约含甲醇300 μg、乙醇500 μg、异丙醇8000 μg、乙腈41μg、二氯甲烷600μg、甲基叔丁基醚500 μg、乙酸乙酯500 μg、四氢呋喃72μg、三乙胺500μg 、n,n-二甲基甲酰胺88μg、正庚烷500μg的对照品储备液；精密量取对照品贮备液2.0 ml，反应液0.1ml置于20 ml顶空瓶中，轧盖密封即得对照品溶液。在上述色谱条件和溶液配制条件下进行方法初筛。
95.结果显示：相较于实施例，使用本色谱柱进行试验，正庚烷与三乙胺之间的分离度r小于1.5，且乙腈与n,n-二甲基甲酰胺未有响应，不满足色谱定量要求。
96.对比例3与实施例1的区别仅在于：色谱柱的种类不同，具体为选用以 5%苯基95%二甲基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱；采用色谱条件为升温程序：初始温度40℃，保持5 min，以8℃/min升温至120℃，保持2 min,以23℃/min升温至200℃，保持5min；进样口设置：温度：200℃；分流比：20:1；载气：高纯氮气；色谱柱流速：2.5ml/min；fid检测器设置：温度：250℃；氢气流量：30 ml/min;空气流量：300 ml/min；尾吹气（n2）：25 ml/min；顶空进样器设置：顶空平衡温度：80℃；顶空平衡时间：30 min；传输线温度100℃ 定量环温度90℃；进样持续时间：0.5min。溶液配制为：溶剂：二甲基亚砜（dmso），反应液：氨水；空白溶液：精密量取溶剂2.0ml，0.1ml反应液置于20ml顶空瓶，轧盖密封即得空白溶液；供试品溶液：称取本品0.2 g，精密称定，置于20 ml顶空瓶中，加入溶剂1.0ml溶剂使溶解，加入反应液0.1ml反应5min，再加入溶剂1.0ml，轧盖密封得每毫升约95.2 mg的供试品溶液；对照品溶液贮备液：分别取甲醇对照品，乙醇对照品、异丙醇对照品、乙腈对照品，
二氯甲烷对照品，甲基叔丁基醚对照品、乙酸乙酯对照品、四氢呋喃对照品，三乙胺对照品，正庚烷对照品，n,n-二甲基甲酰胺对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并制成每1ml中约含甲醇300 μg、乙醇500 μg、异丙醇8000 μg、乙腈41μg、二氯甲烷600μg、甲基叔丁基醚500 μg、乙酸乙酯500 μg、四氢呋喃72μg、三乙胺500μg 、n,n-二甲基甲酰胺88μg、正庚烷500μg的对照品储备液；精密量取对照品贮备液2.0 ml，反应液0.1ml置于20 ml顶空瓶中，轧盖密封即得对照品溶液。在上述色谱条件和溶液配制条件下进行色谱柱筛选。
97.结果显示：相较于实施例，使用本色谱柱进行试验，正庚烷和三乙胺之间的分离度r依然小于1.5，未满足色谱定量要求。
98.对比例4与实施例1的区别仅在于：色谱柱的种类不同，具体为选用以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱；采用色谱条件为：初始温度40℃，保持5 min，以8℃/min升温至120℃，保持2 min,以23℃/min升温至200℃，保持5min；进样口设置：温度：200℃；分流比：20:1；载气：高纯氮气；色谱柱流速：2.5ml/min；fid检测器设置：温度：250℃；氢气流量：30 ml/min；空气流量：300 ml/min；尾吹气（n2）：25 ml/min；顶空进样器设置：顶空平衡温度：80℃；顶空平衡时间：30 min；传输线温度100℃ 定量环温度90℃；进样持续时间：0.5min。溶液配制为：溶剂：二甲基亚砜（dmso），反应液：氨水；空白溶液：精密量取溶剂2.0ml,0.1ml反应液置于20ml顶空瓶， 轧盖密封即得空白溶液；供试品溶液：称取本品0.2 g，精密称定，置于20 ml顶空瓶中，加入溶剂1.0ml溶剂使溶解，加入反应液0.1ml反应5min，再加入溶剂1.0ml，轧盖密封得每毫升约95.2 mg的供试品溶液；对照品溶液贮备液：分别取甲醇对照品，乙醇对照品、异丙醇对照品、乙腈对照品，二氯甲烷对照品，甲基叔丁基醚对照品、乙酸乙酯对照品、四氢呋喃对照品，三乙胺对照品，正庚烷对照品，n,n-二甲基甲酰胺对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并制成每1ml中约含甲醇300 μg、乙醇500 μg、异丙醇8000 μg、乙腈41μg、二氯甲烷600μg、甲基叔丁基醚500 μg、乙酸乙酯500 μg、四氢呋喃72μg、三乙胺500μg 、n,n-二甲基甲酰胺88μg、正庚烷500μg的对照品储备液；精密量取对照品贮备液2.0 ml，反应液0.1ml置于20 ml顶空瓶中，轧盖密封即得对照品溶液。在上述色谱条件和溶液配制条件下继续色谱柱筛选。
99.结果显示：使用与实施例相同色谱柱试验，待测的十一个组分（甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、n,n-二甲基甲酰胺）完全分离，满足色谱定量要求。
100.对比例5与实施例1的区别仅在于：对色谱条件进行持续优化，最终选择：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱；升温程序：初始温度为40℃，保持5min，以8℃/min升温至120℃，保持10min，以20℃/min升温至200℃，保持5min。进样口温度:200℃；fid检测器温度：250℃；色谱柱流速：2.5 ml/min；氢气流量：30ml/min；空气流量：300 ml/
min；尾吹气（n2）流量：25 ml/min；分流比：15：1；定量环体积：1 ml；顶空平衡温度：90℃；传输线温度110℃；定量环温度105℃；顶空平衡时间45 min；进样持续时间0.5min。
101.结果显示：通过各优化条件胺类溶剂含量检出结果对比试验，各溶剂的分离情况，峰型，检出结果等综合考虑，初步确定待研究即实施例1方法。
102.综上所述，本发明提供一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法，建立一套操作简单，定量准确并且实用的方法，以测定酸性底物中胺类溶剂含量的气相分析方法，特别是酸性底物2,5-dioxopyrrolidin-1-yl (6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate。主要具备以下优点：（1）本发明实施例所提供的方法专属性强，胺类溶剂具有良好的相关性，灵敏度高，重复性好，能够准确快速的测定待测底物中胺类溶剂的含量。特别用于2,5-dioxopyrrolidin-1-yl (6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate中的胺类溶剂的定量分析时，本发明的方法可以使2,5-dioxopyrrolidin-1-yl (6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate的回收率达到97.5%以上，准确度高，保证了2,5-dioxopyrrolidin-1-yl (6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate的安全限度，从而更进一步保证了终产品司美格鲁肽的用药安全。
103.（2）经方法学研究，本发明所提供的检测方法中对于胺类溶剂的检测灵敏度可达0.0002%，远低于2,5-dioxopyrrolidin-1-yl (6s,12s)-12-(3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl)-2,2,9,9-tetramethyl-4,7,10,13-tetraoxo-6-((1-trityl-1h-imidazol-4-yl)methyl)-3-oxa-5,8,11,14-tetraazahexadecan-16-oate中的胺类溶剂0.5%的限度要求。本发明所提供的检测方法检测胺类溶剂的线性相关系数可达0.9998，线性关系良好。
104.（3）本发明还可同步测定合成多肽或者其余酸性底物中用到的其他试剂，如甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、正庚烷、n,n-二甲基甲酰胺实用性优异。
105.（4）检验维护成本低，操作简便，无需配备价格高昂和成本较高的衍生化试剂；使用常规试剂二甲基亚砜、氨水即可完成实验，无需使用丙酮等易制毒试剂。
106.需要说明的是，本发明所提供的检测方法中的胺类溶剂以胺类溶剂做示例性说明，其限度参考于ich q3c（r8）残留溶剂指导原则毒理学数据。
107.以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法，其特征在于，包括：将酸性底物与有机溶媒和碱性反应液混合得到供试品溶液；将胺类溶剂对照品、所述有机溶媒和所述碱性反应液混合得到对照品储备溶液；采用气相色谱法对所述供试品溶液和所述对照品储备溶液进行检测，利用外标一点法计算所述酸性底物中胺类溶剂的含量；其中，所述碱性反应液选自氨水和氢氧化钠溶液中的至少一种。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有机溶媒选自二甲基亚砜、n-n二甲基乙酰胺和异丙醇中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，在所述供试品溶液中，所述酸性底物的浓度为50mg/ml-200mg/ml。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，每0.2g所述酸性底物对应碱性反应液的用量为0.01ml-0.50ml；经所述碱性反应液处理之后，所述供试品溶液的ph值为7.5-8.0；所述供试品溶液的制备过程包括：先将所述酸性底物和部分所述有机溶媒混合，再与所述碱性反应液混合，然后再与剩余所述有机溶媒混合；采用外标一点法计算所述酸性底物中胺类溶剂的含量，具体公式如下：式中：a
i
表示供试品溶液色图谱中溶剂i的峰面积；a
s
表示对照品溶液色图谱中溶剂i的峰面积；m
s
表示对照品中溶剂i的称样量，mg；v
s
表示对照品溶液稀释体积，ml；m
供
表示供试品称样量，mg；v
供
表示供试品溶液稀释体积，ml；p
i
表示溶剂i对照品的含量，%。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述对照品储备溶液中，胺类溶剂对照品的浓度为0.20mg/ml-1.00mg/ml。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酸性底物选自2，5-二氧代吡咯烷-1-基（6s，12s）-12-（3-（叔丁氧基）-3-氧代丙基)-2,2,9,9,9-四甲基-4，7，10，13-四氧代-6-（（1-三丁基-1h-咪唑-4-基）甲基）-3-氧杂-5，8，11，14-四氮杂十六烷-16-酸酯、(s)-22-羧基-1-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1，10，19，24-四氧代-3，6，12，15-四氧杂-9，18，23-三氮杂四十一烷酸、(s)-2-（2-叔丁氧羰基)氨基)-3-（1-三苯甲基
‑ꢀ
1h-咪唑-4-基)丙酰胺)-2-甲基丙酸中的至少一种；所述胺类溶剂选自三乙胺、n-甲基吗啉和n,n-二异丙基乙胺中的至少一种。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，按质量分数计，所采用的色谱柱的固定相包括：氰丙基苯基5%-7%和二甲基聚硅氧烷93%-95%；采用agilent8860气相色谱仪进行检测；采用顶空进样器进行加热，从而使所述有机溶媒悬浮于顶空瓶上端；
采用分流进样的方式时，控制分流进样比为（5-50）:1。8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，测试过程中的升温程序如下：控制初始温度为30℃-60℃，保持1min-18min，然后控制以5℃/min-25℃/min的升温速率升温至110℃-130℃，保持3min-10min，再以10℃/min-20℃/min的升温速率升温至190℃-210℃，保持3min-15min。9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，控制进样口温度为180℃-240℃，fid检测器温度为220℃-270℃；控制色谱柱流速为2.0ml/min-3.5ml/min，氢气流量为30ml/min-50ml/min；空气流量为300ml/min-500ml/min，尾吹气流量为25ml/min-50ml/min；定量环体积为0.5ml-2ml，顶空平衡温度为70℃-90℃，传输线温度为80℃-120℃，定量环温度85℃-120℃，顶空平衡时间为15min-50min，进样持续时间为0.1min-1.0min。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，控制进样口温度为190℃-210℃，fid检测器温度为240℃-260℃；控制色谱柱流速为2.3ml/min-2.7ml/min，氢气流量为30ml/min-35ml/min；空气流量为300ml/min-350ml/min，尾吹气流量为25ml/min-30ml/min；定量环体积为1.0ml，顶空平衡温度为85℃-90℃，传输线温度为105℃-115℃，定量环温度100℃-110℃，顶空平衡时间为40min-50min，进样持续时间为0.3min-0.7min。

技术总结
本发明公开了一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法，涉及分析化学技术领域。利用酸性底物与有机溶媒和碱性反应液混合制备供试品溶液，利用碱性反应液和酸性底物中的游离酸反应，防止游离酸会干扰测定过程，减少或避免基质效应，提高检测的准确性。本发明提供的检测方法线性范围宽、精密度好、简捷快速高效，能够很好地控制酸性底物的质量。很好地控制酸性底物的质量。很好地控制酸性底物的质量。


技术研发人员：杨斌 唐灿 唐云霞 黄安 吴涛
受保护的技术使用者：成都普康唯新生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/8/1