一种核酸检测试剂盒及其应用

1.本发明涉及一种核酸检测试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。


背景技术：

2.液体活检是以肿瘤生物标志物为检测对象，根据非入侵性的取样方法得到肿瘤干细胞信息内容，辅助癌症治疗的无损检测技术。ctdna是循环肿瘤基因(循环肿瘤dna)，是肿瘤细胞在坏死或凋亡过程中产生的，是一种特征性的肿瘤生物标志物。通过液体活检对如egfr阳性患者的t790m突变等的ctdna进行定量检测，有助于检测出患者血液中的肿瘤细胞。但是，由于癌症早期患者血液中ctdna的含量非常低，其定量检测具有挑战性。
3.目前，传统的通过液体活检对ctdna进行定量检测的技术主要有聚合酶链反应(pcr)、微珠状乳剂扩增和磁性技术(beaming)、dna测序等。但是，这些方法具有测试时间长、程序繁琐以及成本高昂等问题，这使得基于ctdna的液体活检在临床应用中存在一定的局限性。因此，有必要开发一种灵敏度高、实时、步骤简单且低成本的ctdna定量检测方法用于癌症筛查和诊断，为决定癌症的临床治疗、评估癌症的治疗效果、监测癌症的复发转移进展提供关键信息。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供了一种基于crispr/cas12a、hcr(杂交链式反应)和fret(荧光共振能量转移)的核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括修饰有供体荧光标记的核酸发夹探针a、修饰有受体荧光标记的核酸发夹探针b、引发链、cas12a蛋白和crrna；所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b能够在引发链的作用下发生杂交链式反应形成双链，并且，所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间能够发生荧光共振能量转移，同时，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为0～16个碱基；所述引发链能够在cas12a蛋白的反式切割活性下发生裂解；所述cas12a蛋白能够和crrna结合形成靶向靶标核酸的二元复合物；所述供体荧光标记的发射波长能够作为受体荧光标记的激发波长。
5.在本发明的一种实施方式中，所述供体荧光标记包括羧基荧光素、dabcyl或cy3；所述受体荧光标记包括四甲基罗丹明、glu(荧光标记葡萄糖)或cy5。
6.在本发明的一种实施方式中，所述供体荧光标记为羧基荧光素，所述受体荧光标记为四甲基罗丹明。
7.在本发明的一种实施方式中，所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为2～5个碱基。
8.在本发明的一种实施方式中，所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为3个碱基。
9.在本发明的一种实施方式中，所述核酸检测试剂盒还包括缓冲液。
10.在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液包括neb缓冲液或pbs缓冲液。
11.本发明还提供了一种核酸检测方法，所述方法为：使用上述核酸检测试剂盒对待测样本进行检测，先将引发链、cas12a蛋白、crrna和待测样本混合，得到孵育体系；将孵育体系进行孵育，得到孵育液；将孵育液、核酸发夹探针a和核酸发夹探针b混合，得到反应体系；先将反应体系进行反应，得到反应液，再记录反应液在供体荧光标记的激发波长下的荧光光谱，接着计算反应液在供体荧光标记的发射波长和受体荧光标记的发射波长处的荧光强度变化，最后根据荧光强度变化和靶标核酸浓度之间的线性关系计算待测样本中靶标核酸的浓度。
12.在本发明的一种实施方式中，所述荧光强度变化情况的计算方法包括计算反应液在供体荧光标记的发射波长和受体荧光标记的发射波长处的荧光强度比，计算反应液在供体荧光标记的发射波长和受体荧光标记的发射波长处的荧光强度差，计算反应液在供体荧光标记的发射波长处的荧光强度的降低，或者，计算反应液在受体荧光标记的发射波长处的荧光强度的增加。
13.在本发明的一种实施方式中，当供体荧光标记为羧基荧光素，受体荧光标记为四甲基罗丹明时，所述方法为：使用上述核酸检测试剂盒对待测样本进行检测，先将引发链、cas12a蛋白、crrna和待测样本混合，得到孵育体系；将孵育体系进行孵育，得到孵育液；将孵育液、核酸发夹探针a和核酸发夹探针b混合，得到反应体系；先将反应体系进行反应，得到反应液，再记录反应液在480nm激光激发下，500nm到650nm之间的荧光光谱，接着根据公式y＝i
f(520)
/i
f(580)
计算反应液在520nm和580nm处的荧光强度比，最后根据荧光强度比和靶标核酸浓度之间的线性关系计算待测样本中靶标核酸的浓度。
14.在本发明的一种实施方式中，所述孵育体系中，引发链的浓度为10～400nm，cas12a蛋白的浓度为50～500nm，crrna的浓度为50～500nm。
15.在本发明的一种实施方式中，所述孵育体系中，引发链的浓度为100～400nm。
16.在本发明的一种实施方式中，所述孵育体系中，引发链的浓度为300nm。
17.在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，核酸发夹探针a的浓度为300～700nm，核酸发夹探针b的浓度为300～700nm。
18.在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，核酸发夹探针a的浓度为300～600nm，核酸发夹探针b的浓度为500～700nm。
19.在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，核酸发夹探针a的浓度为400nm，核酸发夹探针b的浓度为600nm。
20.在本发明的一种实施方式中，所述孵育的温度为17～57℃、时间为0.5～4h。
21.在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为27～37℃、时间为1～3h。
22.在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为37℃、时间为2h。
23.在本发明的一种实施方式中，所述待测样本为血清或血浆。
24.在本发明的一种实施方式中，所述靶标核酸为ctdna或dna病毒。
25.在本发明的一种实施方式中，所述dna病毒包括hbv或hpv。
26.本发明还提供了上述核酸检测试剂盒或上述核酸检测方法在核酸检测中的应用。
27.本发明技术方案，具有如下优点：
28.本发明提供了一种基于crispr/cas12a、hcr(杂交链式反应)和fret(荧光共振能量转移)的核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括修饰有供体荧光标记的核酸发夹探
针a、修饰有受体荧光标记的核酸发夹探针b、引发链、cas12a蛋白和crrna，其中，所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b能够在引发链的作用下发生杂交链式反应形成双链，并且，所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间能够发生荧光共振能量转移，同时，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为0～16个碱基，所述引发链能够在cas12a蛋白的反式切割活性下发生裂解，所述cas12a蛋白能够和crrna结合形成靶向靶标核酸的二元复合物。使用所述核酸检测试剂盒对待测样本中的靶标核酸进行定量检测时，在待测样本中没有靶标核酸存在的情况下，cas12a反式切割活性被沉默，引发链被保留，该引发链能够触发后续的核酸发夹探针a和核酸发夹探针b之间的hcr反应，形成长的dsdna纳米线，dsdna纳米线中供体和受体靠得很近，导致了它们之间的fret过程；在待测样本中有靶标核酸存在的情况下，cas12a/crrna的二元复合物特异性识别靶标核酸，cas12a反式切割活性被激活，裂解引发链，从而削弱后续的hcr反应和fret过程。使用所述核酸检测试剂盒对待测样本中的靶标核酸进行定量检测能够依靠crispr/cas12a在短时间内高效识别靶标核酸，并且，能够依靠crispr/cas12a和杂交链式反应进行双重信号放大，具有特异性高、灵敏度高、实时、步骤简单且低成本的优势。同时，使用所述核酸检测试剂盒对待测样本中的靶标核酸进行定量检测操作简便，无需任何洗涤，这有利于在体外和活细胞中进行准确的定量测量。
29.进一步地，所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为2～5个碱基。此设置能够达到较佳荧光共振能量转移效率，使得供体和受体之间的fret过程更显著，进而提高对靶标核酸的检测灵敏度。
30.进一步地，所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为3个碱基。此设置能够达到最佳荧光共振能量转移效率，使得供体和受体之间的fret过程更显著，进而提高对靶标核酸的检测灵敏度。
31.进一步地，所述孵育体系中，引发链的浓度为100～400nm。此设置能够达到最佳荧光共振能量转移效率，使得供体和受体之间的fret过程更显著，进而提高对靶标核酸的检测灵敏度。
32.进一步地，所述孵育体系中，引发链的浓度为300nm。此设置能够达到最佳荧光共振能量转移效率，使得供体和受体之间的fret过程更显著，进而提高对靶标核酸的检测灵敏度。
33.进一步地，所述反应体系中，核酸发夹探针a的浓度为300～600nm，核酸发夹探针b的浓度为500～700nm。此设置能够达到最佳荧光共振能量转移效率，使得供体和受体之间的fret过程更显著，进而提高对靶标核酸的检测灵敏度。
34.进一步地，所述反应体系中，核酸发夹探针a的浓度为400nm，核酸发夹探针b的浓度为600nm。此设置能够达到最佳荧光共振能量转移效率，使得供体和受体之间的fret过程更显著，进而提高对靶标核酸的检测灵敏度。
35.进一步地，所述反应的温度为27～37℃、时间为2～4h。此设置能够达到最佳荧光共振能量转移效率，使得供体和受体之间的fret过程更显著，进而提高对靶标核酸的检测灵敏度。
36.进一步地，所述反应的温度为37℃、时间为2h。此设置能够达到最佳荧光共振能量转移效率，使得供体和受体之间的fret过程更显著，进而提高对靶标核酸的检测灵敏度。
附图说明
37.图1：核酸检测试剂盒的检测原理。
38.图2：cas12a切割引发链可行性验证结果。
39.图3：cas12a的反式切割可行性验证结果。
40.图4：hcr可行性验证结果。
41.图5：hcr-fret可行性验证结果。
42.图6：反应整体可行性验证结果。
43.图7：荧光基团修饰位置示意图。
44.图8：不同碱基距离下的荧光光谱。
45.图9：不同碱基距离下的荧光强度比。
46.图10：不同核酸发夹探针浓度下的荧光共振能量转移效率。
47.图11：不同引发链浓度下的荧光共振能量转移效率。
48.图12：不同反应时间下的荧光共振能量转移效率。
49.图13：不同反应温度下的荧光共振能量转移效率。
50.图14：不同ctdna浓度下的荧光光谱。
51.图15：荧光共振能量转移效率与ctdna的浓度之间拟合而得的线性方程。
52.图16：全dna中ctdna检测灵敏度评价结果。
53.图17：不同靶标下的荧光光谱。
具体实施方式
54.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
55.下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
56.实施例1：一种核酸检测试剂盒
57.本实施例提供了一种基于crispr/cas12a、hcr和fret的核酸检测试剂盒(核酸检测试剂盒的检测原理见图1)，所述核酸检测试剂盒由以羧基荧光素为供体荧光标记的核酸发夹探针a、以四甲基罗丹明为受体荧光标记的核酸发夹探针b、引发链、cas12a蛋白(lbcas12a蛋白酶，购自广州美格生物科技有限公司)和crrna组成；所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b能够在引发链的作用下发生杂交链式反应形成双链，并且，所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为3个碱基；所述引发链能够在cas12a蛋白的反式切割活性下发生裂解；所述cas12a蛋白能够和crrna结合形成靶向靶标核酸的二元复合物。
58.实施例2：一种核酸检测方法
59.本实施例提供了一种基于crispr/cas12a、hcr和fret的核酸检测方法，所述方法使用实施例1的核酸检测试剂盒，包括如下步骤：
60.步骤一：将引发链4000rpm下离心60s后，使用1
×
neb缓冲液2.1(购自neb公司)溶解至浓度为10μm，得到引发链溶液；将核酸发夹探针a4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液(购自上海生工生物有限公司)溶解至浓度为10μm，得到核酸发夹探针a溶液；将核酸发夹探针b 4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液溶解至10μm，得到核酸发夹探针b溶液；将核酸发夹探针a溶液和核酸发夹探针b溶液分别于95℃加热5min，得到发夹环a溶液和发夹环b溶液；将cas12a蛋白用1
×
neb缓冲液2.1溶解至浓度为1μm，得到cas12a溶液；将crrna用1
×
neb缓冲液2.1溶解至浓度为1μm，得到crrna溶液；
61.步骤二：将1μl cas12a溶液、1μl crrna溶液、2μl引发链溶液与2μl待测样本混合，得到孵育体系；将孵育体系在37℃下孵育1h，得到孵育液；在孵育液中加入20μl发夹环a溶液、20μl发夹环b溶液和140μl pbs缓冲液，得到反应体系；将反应体系在37℃下反应2h，得到反应液；通过荧光分光光度计记录反应液在480nm激光激发下，500nm到650nm之间的荧光光谱；根据公式y＝i
f(520)
/i
f(580)
计算反应液在520nm和580nm处的荧光强度比；根据荧光强度比和靶标核酸浓度之间的关系计算得到待测样本中靶标核酸的浓度。
62.实验例1：核酸检测试剂盒的可行性验证
63.本实验例对实施例1中核酸检测试剂盒的可行性进行验证，验证过程如下：
64.1、实验材料
65.以核苷酸序列如seq id no.1(ctccaccgtgcagctcatcatgcagctcatgcccttcg)所示的ctdna作为靶标核酸；根据靶标核酸，设计核苷酸序列如seq id no.2(aattcctgcttgttctctcttaagagaaagagagaacaagca)所示的核酸发夹探针h1、核苷酸序列如seq id no.3(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctttctctt)所示的核酸发夹探针h2、核苷酸序列如seq id no.4(aattcctgcttgttctctctt(fam)aagagaaagagagaacaagca)所示的核酸发夹探针h3、核苷酸序列如seq id no.8(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctttct(tamra)ctt)所示的核酸发夹探针h5、核苷酸序列如seq id no.6(aagagagaacaagcaggaatt)所示的引发链和核苷酸序列如seq id no.7(uaauuucuacuaaguguagaugcaugagcugcaugaugagcug)所示的crrna；序列均由上海生工公司合成和纯化。
66.2、实验过程
67.2.1、crispr/cas12a切割可行性的验证
68.实验一：使用浓度为15％(m/v，g/100ml)的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。将引发链4000rpm下离心60s后，使用1
×
neb缓冲液2.1(购自neb公司)溶解至浓度为1μm，得到引发链溶液；将cas12a蛋白用1
×
neb缓冲液2.1溶解至浓度为1μm，得到cas12a溶液；将crrna用1
×
neb缓冲液2.1溶解至浓度为1μm，得到crrna溶液；将靶标核酸使用纯水溶解至浓度为1nm，得到待测样本；将1μl cas12a溶液、1μl crrna溶液、2μl引发链溶液与2μl待测样本混合，得到反应体系；将反应体系在37℃下反应30min，得到反应液；将反应液于65℃下加热5min终止反应，得到反应产物；先将反应产物与上样buffer(购自赛默飞公司)按照体积比5:1的比例进行混合，然后加入到泳道中，80v电泳90min，电泳结束后，取出凝胶并在gelred染液(购自赛默飞公司)中染色30min，染色结束后，取出凝胶洗脱干净，用凝胶成像仪进行紫外成像，对条带进行分析，分析结果见图2。
69.实验二：使用5’端连接有6-fam(6-羧基荧光素)、3’端连接有bhq1(淬灭基团)的单链dna荧光探针ttatt(fq探针链)进行验证。将fq探针链4000rpm下离心60s后，使用1
×
neb
缓冲液2.1(购自neb公司)溶解至浓度为5μm，得到fq探针链溶液；将cas12a蛋白用1
×
neb缓冲液2.1溶解至浓度为1μm，得到cas12a溶液；将crrna用1
×
neb缓冲液2.1溶解至浓度为1μm，得到crrna溶液；将靶标核酸使用纯水溶解至浓度为1nm，得到待测样本；将1μl cas12a溶液、1μl crrna溶液、2μl fq探针链溶液与2μl待测样本混合，得到反应体系(总体积20μl)；将反应体系在37℃下反应30min，得到反应液；将反应液于65℃下加热5min终止反应，得到反应产物；在反应产物中加入180μl的纯水后，通过荧光分光光度计记录在480nm激发光激发下，500nm到600nm之间的荧光光谱，检测结果见图3。为避免样品之间的干扰，在每次测量之前，用70％(v/v)乙醇和蒸馏水洗涤比色皿。
70.由图2可知，泳道4较泳道1、2、3中出现了新条带，表明了crrna可以和ctdna结合产生rna/dna双链。泳道7与泳道4、5、6相比，其中靶标链消失，且crrna/dna链的位置下移，表明只有cas12a、crrna、ctdna均存在的情况下，才能激活cas12a的切割活性，切割靶标链。同时泳道7中消失的还有引发链i，表明引发链也被切割了。这表明了crispr/cas12a切割单链dna是可行的。
71.由图3可知，当靶标不存在时，无荧光响应，当靶标存在时产生荧光。这表明cas12a的切割活性可以在靶标存在的情况下被激活，切割体系中的单链荧光探针。综上可以说明crispr/cas12a切割单链dna是可行的。
72.2.2、杂交链式反应可行性验证
73.使用浓度为15％(m/v，g/100ml)的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。将引发链4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液(购自neb公司)溶解至浓度为100nm，得到引发链溶液；将核酸发夹探针h1 4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液溶解至浓度为1μm，得到核酸发夹探针h1溶液；将核酸发夹探针h2 4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液溶解至1μm，得到核酸发夹探针h2溶液；将核酸发夹探针h1溶液和核酸发夹探针h2溶液分别于95℃加热5min，得到发夹环h1溶液和发夹环h2溶液；将10μl引发链溶液、10μl发夹环h1溶液与10μl发夹环h2溶液混合，得到反应体系(总体积30μl)；将反应体系在37℃下反应2h，得到反应液；先将反应液与上样buffer(购自赛默飞公司)按照体积比5:1的比例进行混合，然后加入到泳道中，80v电泳90min，电泳结束后，取出凝胶并在gelred染液(购自赛默飞公司)中染色30min，染色结束后，取出凝胶洗脱干净，用凝胶成像仪进行紫外成像，对条带进行分析，分析结果见图4。
74.由图4可知，在泳道4中未有新的条带产生，证明了当引发链不存在时，发夹环h1和h2能够在溶液中保持完整的发夹结构，并不发生hcr。由泳道5和泳道4对比可以发现，泳道5中在靠近胶孔的位置产生了新的较为明亮的dna条带，此为hcr产物(dsdna)。由此证明了hcr的可行性。
75.2.3、hcr介导的荧光共振能量转移的可行性验证
76.将引发链4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液(购自neb公司)溶解至浓度为100nm，得到引发链溶液；将核酸发夹探针h3 4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液溶解至浓度为1μm，得到核酸发夹探针h3溶液；将核酸发夹探针h5 4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液溶解至1μm，得到核酸发夹探针h5溶液；将核酸发夹探针h3溶液和核酸发夹探针h5溶液分别于95℃加热5min，得到发夹环h3溶液和发夹环h5溶液；将10μl引发链溶液、10μl发夹环h3溶液与10μl发夹环h5溶液混合，得到hcr-fret体系(总体积30μl)；将反应体系在37℃
下反应2h，得到反应液；在反应液中加入140μl pbs缓冲液后，通过荧光分光光度计记录在480nm激发光激发下，500nm到600nm之间的荧光光谱，检测结果见图5。为避免样品之间的干扰，在每次测量之前，用70％(v/v)乙醇和蒸馏水洗涤比色皿。
77.由图5可知，当引发链不存在时，体系中只有h3或者h5时，光谱图中均只能观察到一个峰。当引发链存在时，光谱图中可以观察到520nm处和580nm处两个峰。原因是当引发链触发了hcr过程，两个荧光基团在空间上彼此靠近，此时用供体的激发光激发时，供体的发射光可以激发受体发出荧光，此为荧光共振能量转移现象。表明hcr-fret系统已成功构建。
78.2.4、反应整体的可行性验证
79.将引发链4000rpm下离心60s后，使用1
×
neb缓冲液2.1(购自neb公司)溶解至浓度为1μm，得到引发链溶液；将cas12a蛋白用1
×
neb缓冲液2.1溶解至浓度为1μm，得到cas12a溶液；将crrna用1
×
neb缓冲液2.1溶解至浓度为1μm，得到crrna溶液；将靶标核酸使用纯水溶解至浓度为1nm，得到待测样本；将1μl cas12a溶液、1μl crrna溶液、2μl引发链溶液与2μl待测样本混合，得到孵育体系；将孵育体系在37℃下反应30min，得到孵育液；将核酸发夹探针h3 4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液溶解至浓度为500nm，得到核酸发夹探针h3溶液；将核酸发夹探针h5 4000rpm下离心60s后，使用pbs缓冲液溶解至500nm，得到核酸发夹探针h5溶液；在孵育液中加入20μl的核酸发夹探针h3溶液和20μl核酸发夹探针h5溶液，得到反应体系；将反应体系于37℃下反应2h，得到反应产物；在反应产物中加入140μl的纯水后，通过荧光分光光度计记录在480nm激发光激发下，500nm到600nm之间的荧光光谱，检测结果见图6。
80.由图6可知，当靶标存在时，激活cas12a酶的切割活性，切割溶液中的引发链，使得hcr过程无法进行，无法产生fret。因此在荧光图谱中，只能观察到fam的发射峰。当靶标不存在时，无法激活cas12a酶的切割活性，因此不会切割体系中的引发链，保持完整，并能成功触发下游的hcr-fret。因此在荧光光谱中可以看到fam和tamra的发射峰。由此可以确定该策略整体是可行的，并且可以根据荧光共振能量转移效率(fret效率，即tamra与fam的发射峰的峰值比值)对体系中的靶标浓度进行定量。
81.实验例2：供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离对核酸检测试剂盒性能的影响
82.本实验例探究了供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离对核酸检测试剂盒性能的的影响，实验过程如下：
83.1、实验材料
84.以核苷酸序列如seq id no.1(ctccaccgtgcagctcatcatgcagctcatgcccttcg)所示的ctdna作为靶标核酸；根据靶标核酸，设计核苷酸序列如seq id no.4(aattcctgcttgttctctctt(fam)aagagaaagagagaacaagca)所示的核酸发夹探针h3、核苷酸序列如seq id no.5(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctttctctt(tamra))所示的核酸发夹探针h4、核苷酸序列如seq id no.8(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctttct(tamra)ctt)所示的核酸发夹探针h5、核苷酸序列如seq id no.9(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctt(tamra)tctctt)所示的核酸发夹探针h6、核苷酸序列如seq id no.10(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctct(tamra)ctttctctt)所示的核酸发夹探针h7、核苷酸序列如seq id no.11(aagagagaacaagcaggaatttgctt(tamra)gttctctctttctctt)所示的
核酸发夹探针h8、核苷酸序列如seq id no.6(aagagagaacaagcaggaatt)所示的引发链和核苷酸序列如seq id no.7(uaauuucuacuaaguguagaugcaugagcugcaugaugagcug)所示的crrna；序列均由上海生工公司合成和纯化(核酸发夹探针h3～核酸发夹探针h8的设计思路见图7)。
85.2、实验过程
86.分别以h3和h4、h3和h5、h3和h6、h3和h7、h3和h8作为触发hcr反应的核酸发夹探针对，参照实验例1中的2.4部分获得相对应的荧光光谱(荧光光谱见图8)和荧光强度比(荧光强度比见图9)。
87.由图8～9可知，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离(指核酸发夹探针对形成双链后供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离)对核酸检测试剂盒的荧光共振能量转移效率有影响，当供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为2～5个碱基时，能达到最佳荧光共振能量转移效率，而提升荧光共振能量转移效率能够使得供体和受体之间的fret过程更显著，进而提高对靶标核酸的检测灵敏度，因此，应控制供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为2～5个碱基。
88.实验例3：核酸发夹探针的浓度对核酸检测试剂盒性能的影响
89.本实验例探究了核酸发夹探针的浓度对核酸检测试剂盒性能的的影响，实验过程如下：
90.1、实验材料
91.以核苷酸序列如seq id no.1(ctccaccgtgcagctcatcatgcagctcatgcccttcg)所示的ctdna作为靶标核酸；根据靶标核酸，设计核苷酸序列如seq id no.4(aattcctgcttgttctctctt(fam)aagagaaagagagaacaagca)所示的核酸发夹探针h3、核苷酸序列如seq id no.8(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctttct(tamra)ctt)所示的核酸发夹探针h5、核苷酸序列如seq id no.6(aagagagaacaagcaggaatt)所示的引发链和核苷酸序列如seq id no.7(uaauuucuacuaaguguagaugcaugagcugcaugaugagcug)所示的crrna；序列均由上海生工公司合成和纯化。
92.2、实验过程
93.将核酸发夹探针h3使用pbs缓冲液溶解至400nm，得到核酸发夹探针h3溶液；将核酸发夹探针h5使用pbs缓冲液溶解至浓度分别为300nm、400nm、500nm、600nm、700nm，得到不同浓度的核酸发夹探针h5溶液；分别以h3和不同浓度的h5作为触发hcr反应的核酸发夹探针对，参照实验例1中的2.4部分获得相对应的荧光光谱，并计算荧光共振能量转移效率(fret效率，即tamra与fam的发射峰的峰值比值)，计算结果见图10。
94.将h3浓度固定在400nm，并将h5浓度从300nm逐渐增加到700nm。由图10可知，h5的浓度到600nm时，其fret效率达到最大值。因此最终选择400nm h3和600nm h5进行后续的条件优化。
95.实验例4：引发链的浓度对核酸检测试剂盒性能的影响
96.本实验例探究了引发链的浓度对核酸检测试剂盒性能的的影响，实验过程如下：
97.1、实验材料
98.以核苷酸序列如seq id no.1(ctccaccgtgcagctcatcatgcagctcatgcccttcg)所示的ctdna作为靶标核酸；根据靶标核酸，设计核苷酸序列如seq id no.4
(aattcctgcttgttctctctt(fam)aagagaaagagagaacaagca)所示的核酸发夹探针h3、核苷酸序列如seq id no.8(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctttct(tamra)ctt)所示的核酸发夹探针h5、核苷酸序列如seq id no.6(aagagagaacaagcaggaatt)所示的引发链和核苷酸序列如seq id no.7(uaauuucuacuaaguguagaugcaugagcugcaugaugagcug)所示的crrna；序列均由上海生工公司合成和纯化。
99.2、实验过程
100.将引发链使用pbs缓冲液溶解至浓度分别为10nm、50nm、100nm、200nm、300nm和400nm，得到不同浓度的引发链溶液；分别使用不同浓度的引发链溶液，参照实验例1中的2.4部分获得相对应的荧光光谱，并计算fret效率，计算结果见图11。
101.由图11可知，fret效率随着引发链浓度的升高而升高，当引发链的浓度达到200nm时，fret效率达到最大值。当引发链的浓度继续增加时，fret效率略有降低。因此在后续的条件优化中选择200nm的引发链。
102.实验例5：反应时间对核酸检测试剂盒性能的影响
103.本实验例探究了反应时间对核酸检测试剂盒性能的的影响，实验过程如下：
104.1、实验材料
105.以核苷酸序列如seq id no.1(ctccaccgtgcagctcatcatgcagctcatgcccttcg)所示的ctdna作为靶标核酸；根据靶标核酸，设计核苷酸序列如seq id no.4(aattcctgcttgttctctctt(fam)aagagaaagagagaacaagca)所示的核酸发夹探针h3、核苷酸序列如seq id no.8(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctttct(tamra)ctt)所示的核酸发夹探针h5、核苷酸序列如seq id no.6(aagagagaacaagcaggaatt)所示的引发链和核苷酸序列如seq id no.7(uaauuucuacuaaguguagaugcaugagcugcaugaugagcug)所示的crrna；序列均由上海生工公司合成和纯化。
106.2、实验过程
107.在实验例1中的2.4部分的基础上，将反应时间分别调节为0.5h、1h、2h、3h、4h获得相对应的荧光光谱，并计算fret效率，计算结果见图12。
108.由图12可知，反应体系的fret效率随着时间的延长而升高，当反应时间达到2h时，其fret的效率达到最大值，当反应时间过长时，fret效率反而开始下降。因此，最佳的hcr-fret反应时间为2h。
109.实验例6：反应温度对核酸检测试剂盒性能的影响
110.本实验例探究了反应温度对核酸检测试剂盒性能的的影响，实验过程如下：
111.1、实验材料
112.以核苷酸序列如seq id no.1(ctccaccgtgcagctcatcatgcagctcatgcccttcg)所示的ctdna作为靶标核酸；根据靶标核酸，设计核苷酸序列如seq id no.4(aattcctgcttgttctctctt(fam)aagagaaagagagaacaagca)所示的核酸发夹探针h3、核苷酸序列如seq id no.8(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctttct(tamra)ctt)所示的核酸发夹探针h5、核苷酸序列如seq id no.6(aagagagaacaagcaggaatt)所示的引发链和核苷酸序列如seq id no.7(uaauuucuacuaaguguagaugcaugagcugcaugaugagcug)所示的crrna；序列均由上海生工公司合成和纯化。
113.2、实验过程
114.在实验例1中的2.4部分的基础上，将反应温度分别调节为17℃、27℃、37℃、47℃、57℃获得相对应的荧光光谱，并计算fret效率，计算结果见图13。
115.由图13可知，在5组反应温度中，当hcr-fret反应温度达到37℃时，其fret效率达到最高。当反应温度继续升高时，fret效率骤降。因此整个体系的反应温度为37℃。
116.实验例3：核酸检测试剂盒的性能验证
117.本实验例对实施例1中核酸检测试剂盒的性能进行验证，验证过程如下：
118.1、实验材料
119.设计核苷酸序列如seq id no.1(ctccaccgtgcagctcatcatgcagctcatgcccttcg)所示的ctdna、核苷酸序列如seq id no.4(aattcctgcttgttctctctt(fam)aagagaaagagagaacaagca)所示的核酸发夹探针h3、核苷酸序列如seq id no.8(aagagagaacaagcaggaatttgcttgttctctctttct(tamra)ctt)所示的核酸发夹探针h5、核苷酸序列如seq id no.6(aagagagaacaagcaggaatt)所示的引发链、核苷酸序列如seq id no.7(uaauuucuacuaaguguagaugcaugagcugcaugaugagcug)所示的crrna、核苷酸序列如seq id no.12(tgtactcaccggttccgcagaccacctgatccggacta)所示的非靶标链ntc、核苷酸序列如seq id no.13(ctccaccgtgcagcacatcatgcagctcatgcccttcg)所示的错配链mt1、核苷酸序列如seq id no.14(ctccaccgtgcagcacatgatgcagctcatgcccttcg)所示的错配链mt2、核苷酸序列如seq id no.15(ctccaccgtgcagcacatgatgcaggtcatgcccttcg)所示的错配链mt3；序列均由上海生工公司合成和纯化。
120.2、实验过程
121.2.1、ctdna检测灵敏性评价
122.将ctdna使用纯水溶解至浓度为0pm、1pm、10pm、20pm、40pm、60pm、80pm、100pm、120pm、200pm、400pm，得到不同浓度的ctdna溶液；以不同浓度的ctdna溶液作为待测样本，参照实验例1中的2.4部分获得相对应的荧光光谱，并计算fret效率，计算结果见图14；对1pm到120pm的范围内fret效率与ctdna浓度进行拟合计算，得到线性方程并计算出检测限，线性方程见图15；采用检测限(lod)评价该策略的灵敏度，计算公式：lod＝3σ/s，公式中，σ为11个空白样本的标准差，s为校准曲线得到的斜率。
123.2.2、全dna中ctdna检测灵敏度评价
124.将ctdna使用纯水溶解至浓度为800pm、1.6nm和2nm，得到不同浓度的ctdna溶液；将1μl不同浓度的ctdna溶液分别与1μl血浆中提取的dna溶液(使用dna提取试剂盒对血浆进行提取)混合，得到含不同浓度ctdna的靶标混合液；以不同浓度的ctdna溶液和含不同浓度ctdna的靶标混合液作为待测样本，参照实验例1中的2.4部分获得相对应的荧光光谱，并计算fret效率，计算结果见图16。
125.2.3、特异性评价
126.将ctdna、非靶标链ntc、错配链mt1、错配链mt2和错配链mt3分别使用纯水溶解至浓度为1.2nm，得到不同dna链溶液；以不加靶标作为空白对照，不同dna链溶液作为待测样本，参照实验例1中的2.4部分获得相对应的荧光光谱，并计算fret效率，计算结果见图17。
127.由图14可知，3种浓度的靶标在两种条件下的fret效率相接近，表明本试剂盒及方法具有一定的抗干扰能力，可以抵抗临床样本中其他dna的干扰。
128.由图15可知，检测范围：1～400pm，检测限：0.316pm，线性方程y＝-0.0117x+
1.9625，r2＝0.9939，可见，在1pm到120pm的范围内fret效率与ctdna的浓度具有良好的线性相关性。
129.由图16可知，3种浓度的靶标在两种条件下的fret效率相接近，表明本试剂盒及方法具有一定的抗干扰能力，可以抵抗临床样本中其他dna的干扰。
130.由图17可知，当dna链浓度一致时，靶标链对应的荧光共振能量转移效率与错配链均不一致，说明本试剂盒及方法具有识别单碱基错配的能力。当非靶标链ntc参与实验时，其fret效率接近空白对照组，说明本试剂盒及方法具有高特异性。
131.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒包括修饰有供体荧光标记的核酸发夹探针a、修饰有受体荧光标记的核酸发夹探针b、引发链、cas12a蛋白和crrna；所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b能够在引发链的作用下发生杂交链式反应形成双链，并且，所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间能够发生荧光共振能量转移，同时，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为0～16个碱基；所述引发链能够在cas12a蛋白的反式切割活性下发生裂解；所述cas12a蛋白能够和crrna结合形成靶向靶标核酸的二元复合物；所述供体荧光标记的发射波长能够作为受体荧光标记的激发波长。2.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述供体荧光标记包括羧基荧光素、dabcyl或cy3；所述受体荧光标记包括四甲基罗丹明、glu或cy5；所述核酸发夹探针a和核酸发夹探针b形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间的距离为2～5个碱基。3.如权利要求1或2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒还包括缓冲液。4.如权利要求3所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括neb缓冲液或pbs缓冲液。5.一种核酸检测方法，其特征在于，所述方法为：使用权利要求1～4任一项所述的核酸检测试剂盒对待测样本进行检测，先将引发链、cas12a蛋白、crrna和待测样本混合，得到孵育体系；将孵育体系进行孵育，得到孵育液；将孵育液、核酸发夹探针a和核酸发夹探针b混合，得到反应体系；先将反应体系进行反应，得到反应液，再记录反应液在供体荧光标记的激发波长下的荧光光谱，接着计算反应液在供体荧光标记的发射波长和受体荧光标记的发射波长处的荧光强度变化，最后根据荧光强度变化和靶标核酸浓度之间的线性关系计算待测样本中靶标核酸的浓度。6.如权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于，所述孵育体系中，引发链的浓度为10～400nm，cas12a蛋白的浓度为50～500nm，crrna的浓度为50～500nm。7.如权利要求5或6所述的核酸检测方法，其特征在于，所述反应体系中，核酸发夹探针a的浓度为300～700nm，核酸发夹探针b的浓度为300～700nm。8.如权利要求5～7任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为17～57℃、时间为0.5～4h。9.如权利要求5～8任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，所述反应的温度为27～37℃、时间为1～3h。10.权利要求1～4任一项所述的核酸检测试剂盒或权利要求5～9任一项所述的核酸检测方法在核酸检测中的应用。

技术总结
本发明涉及一种核酸检测试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a、HCR和FRET的核酸检测试剂盒，包括修饰有供体荧光标记的核酸发夹探针A、修饰有受体荧光标记的核酸发夹探针B、引发链、Cas12a蛋白和crRNA，其中，核酸发夹探针A和核酸发夹探针B能够在引发链的作用下发生杂交链式反应形成双链，核酸发夹探针A和核酸发夹探针B形成双链后，供体荧光标记和受体荧光标记之间能够发生荧光共振能量转移，同时，两者之间的距离为0～16个碱基，引发链能够在Cas12a蛋白的反式切割活性下发生裂解，Cas12a蛋白能够和crRNA结合形成靶向靶标核酸的二元复合物。物。物。


技术研发人员：韩坤 鞠婷 吴雪兰 翟星帏 李靖雯
受保护的技术使用者：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/7/31