一种血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系及其制备方法

1.本发明属于纳米技术与生物医药领域，特别涉及一种血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系及其制备方法。


背景技术：

2.目前，临床上针对三阴性乳腺癌(tnbc)的标准治疗方案仍然是手术治疗和化疗，但tnbc相较于其他亚型乳腺癌更易发生远处转移，而且临床上有相当一部分患者对化疗耐药。另外，tnbc是一类具有高度异质性的混合型肿瘤，临床上在对tnbc的治疗上缺乏明确靶点及靶向治疗。因此，寻找tnbc更加有效的治疗方式是临床亟待解决的难点和重点。同时，tnbc患者病情发展迅速。若在治疗过程中，能通过增强肿瘤部位成像实现对肿瘤发展的实时监测，将更利于肿瘤的治疗与监测。
3.随着对肿瘤微环境(tumor microenvironment,tem)的深入研究，研究者们发现tnbc由于缺氧和糖酵解肿瘤代谢特点，通常表现为酸性和高乳酸的肿瘤微环境。然而，这些肿瘤微环境特点影响肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,tams)向m2型巨噬细胞极化，也增加了血管内皮因子(evgf)的表达，抑制了tnbc的肿瘤免疫，促进其增殖及转移。
4.乳酸氧化酶作为一种天然蛋白质酶，被视为黄素蛋白家族中的一员。乳酸氧化酶生成的efmnh2-pyruvate复合体不稳定，丙酮酸很快从复合体上分离下来，还原型中间体efmnh2被氧化，同时形成过氧化氢，由于反应过程中不需要外源辅酶作为电子受体，而具有较好的应用前景。然而，乳酸氧化酶作为一种非人源蛋白，自身具有免疫原性可能引起抗体反应等。另一方面，其被细胞内吞后受到细胞溶酶体蛋白酶的水解从而失活。
5.因此，通过合理设计一种仿生纳米平台成功递送乳酸氧化酶至肿瘤部位，通过消耗肿瘤细胞内外的乳酸起到调整肿瘤微环境，从而实现tnbc的铁死亡、免疫治疗效应和诊断，是至关重要的。


技术实现要素：

6.为解决上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系及其制备方法。
7.本发明提供的这种血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系的制备方法，包括如下步骤：
8.1)制备纳米级血小板膜(pm)；
9.2)制备鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅，包括如下步骤：
10.2-a.氨基化介孔二氧化硅(dmsns-nh2)的制备：将三乙醇胺溶解于去离子水中，在适宜温度下再加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠，混合均匀，得到混合液，接着向混合液中加入正硅酸乙酯，加热搅拌反应，反应结束后，离心、洗涤、干燥，得到初级产物，再将初
级产物加入由乙醇和浓盐酸组成的混合溶剂中继续水浴搅拌，结束后，离心、洗涤、干燥，得到介孔二氧化硅；将介孔二氧化硅溶解于甲苯中，再加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，加热回流，待反应结束后，离心、洗涤、干燥，得到氨基化介孔二氧化硅；
11.2-b.鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅(tmsl)的制备：在室温下，将乳酸氧化酶与氨基化介孔二氧化硅按配比混合，得到混合液，接着将鞣酸溶液和fecl3·
6h2o溶液逐滴加入混合液中，超声分散，再加入3-(n-吗啉)丙磺酸缓冲液，搅拌，离心，得到鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅；
12.3)制备血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系(pm@tmsl)：将鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅与纳米级血小板膜超声融合后，过滤、离心，得到血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系。
13.所述步骤1)中，制备纳米级血小板膜的步骤具体为：收集小鼠全血标本，置于含有肝素抗凝剂的试管中，通过离心和洗涤从全血中分离出血小板，再通过反复冻融提取出血小板膜，将血小板膜悬置于磷酸盐缓冲溶液中，超声处理，得到纳米级血小板膜。
14.所述步骤2-a中，所述三乙醇胺(tea)、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、水杨酸钠、正硅酸乙酯(teos)的质量体积比为(0.3～0.5)g：(0.1～0.6)g:(0.05～0.2)g：(1～6)ml；所述初级产物与混合溶剂的质量体积比为(0.15～0.5)g：(20～120)ml；所述混合溶剂中，乙醇与浓盐酸的体积比为(20～90)ml：(0.2～1.2)ml；所述介孔二氧化硅与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量体积比为(0.1～0.5)g：(0.1～2)ml。
15.所述步骤2-a中，适宜温度为60～100℃；加热搅拌反应的温度为60～100℃，时间为1～4h；继续搅拌的温度为60～90℃，继续搅拌的时间为4～10h；加热回流的温度为60～100℃，加热回流的时间为2～8h。
16.所述步骤2-b中，乳酸氧化酶与氨基化介孔二氧化硅的质量比为(100～400)μg:(100～400)μg；所述鞣酸溶液的浓度为20～40mm，fecl3·
6h2o溶液的浓度为20～50mm，3-(n-吗啉)丙磺酸缓冲液的浓度为10～40mm，ph为7.4；所述氨基化介孔二氧化硅、鞣酸溶液、fecl3·
6h2o溶液与3-(n-吗啉)丙磺酸缓冲液的质量体积比为(100～400)μg:(1～10)μl：(1～10)μl：(200～2000)μl。
17.所述步骤3)中，鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅的质量与纳米级血小板膜的个数之比为(100～200)μg:(106～108)个。
18.根据上述制备方法制得的血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系。
19.所述血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系，所述乳酸氧化酶负载于氨基化介孔二氧化硅的孔洞中，鞣酸铁涂层位于氨基化介孔二氧化硅的表面，血小板膜包裹鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅。
20.所述血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系中，乳酸氧化酶的封装率为94％～97％。
21.所述血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系在制备靶向治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。
22.本发明的原理：
23.本发明的血小板膜伪装鞣酸铁(fe
iii
ta)涂层负载乳酸氧化酶(lox)的氨基化介孔二氧化硅(dmsns-nh2)纳米体系(pm@tmsl)，首先通过血小板膜表达的p-选择素对tnbc细胞表面高表达的cd44受体的主动靶向及epr效应的被动聚集作用进而靶向tnbc部位。随后，pm@tmsl被内吞入肿瘤细胞内并形成酸性内涵体，体系表面涂层的fe
iii
ta在酸性内涵体或溶酶体环境中因羟基基团被质子化导致交联剂的快速破坏和薄膜解聚，产生“质子海绵效应”进而实现溶酶体逃逸，成功将乳酸氧化酶(lox)靶向递送至肿瘤细胞，lox通过消耗肿瘤细胞内外的乳酸，一方面减少tams向m2巨噬细胞极化甚至m2巨噬细胞反极化成m1巨噬细胞，解除肿瘤的免疫抑制作用。另一方面，乳酸氧化酶可氧化乳酸产生h2o2，而且鞣酸(ta)可将释放的fe
3+
还原成fe
2+
，通过工业化的芬顿效应将h2o2转化为羟基自由基(ho
·
)，过多的活性氧可损伤肿瘤细胞线粒体，从而导致肿瘤细胞发生凋亡。铁死亡作为一种铁依赖的新型细胞程序死亡方式，铁死亡过程中的脂质过氧化(lpo)水平与细胞氧化环境(如h2o2)有着紧密联系，因此本发明纳米体系能够诱导细胞铁死亡。同时，ta作为一种邻苯二酚衍生物，与fe
3+
形成配位络合物并涂层于氨基化介孔二氧化硅，可增强材料磁性用于三阴性乳腺癌磁共振成像诊断。
24.本发明的有益效果：
25.1)本发明纳米体系是一种集诊疗于一体化的多模式仿生靶向纳米药物系统，利用tnbc的固有特性高表达cd44受体、高乳酸肿瘤微环境、富含铁及脂质，能够实现诊疗一体化。
26.2)本发明纳米体系通过fe
iii
ta涂层氨基化树枝状介孔二氧化硅，具有生物相容性好，磁共振成像多功能及溶酶体逃逸的优点，实现乳酸氧化酶蛋白质的有效运输，通过消耗肿瘤细胞内外乳酸实现tnbc免疫治疗及凋亡。同时，ta实现fe
3+
与fe
2+
的循环供给，利用芬顿反应诱导tnbc铁死亡，实现了集诱发tnbc凋亡、免疫治疗与铁死亡的多模式组合疗法。
27.3)本发明纳米体系通过天然血小板膜伪装负载乳酸氧化酶(lox)的氨基化介孔二氧化硅(dmsns-nh2)，既降低了网状内皮系统对纳米体系的吞噬清除作用，又增强了纳米体系的靶向能力。
附图说明
28.图1为本发明的制备流程图。
29.图2为实施例1制得的各粒子的tem图以及sds-page蛋白分析结果图：a、b、c、d、e分别为dmsns-nh2、tms、pm、pm@tms、pm@tmsl的tem图；f为lox、pm@tmsl、pm的sds-page蛋白分析结果图。
30.图3为实施例1制得的pm@tmsl的haadf-stem及元素mapping结果图(n、si、fe、s)。
31.图4为tms的haadf-stem及元素mapping结果(n、si、fe)；
32.图5中a为pm对4t1细胞的靶向实验结果图；b为raw264.7细胞对rhb标记的tmsl、pm@tmsl吞噬实验结果图；c为western blot实验：pm、pm@tmsl的cd47、p-选择素蛋白表达情况。
33.图6为dmsns-nh2@lox的溶酶体逃逸试验结果图。
34.图7为pm@tmsl的溶酶体逃逸实验结果图。
35.图8中a为tmsl、pm@tmsl的溶血试验结果图；b为huvec细胞的cck-8试验结果图；c
为hmc细胞的cck-8试验结果图。
36.图9为mtt试验检测lox、pm@tmsl对细胞活力的影响结果图。
37.图10中a为calcein-am/pi染色试验结果图；b为活性氧荧光结果图；c为c11bodipy 581/591脂质过氧化荧光探针试验结果图。
38.图11中a为凋亡流式细胞术结果图；b为活性氧流式细胞术结果图。
39.图12为pm@tmsl的体外抑制4t1肿瘤细胞转移结果图：a为细胞transwell迁移实验结果；b、c分别为0h、24h的细胞划痕实验结果；d为细胞迁移；e为划痕实验的imagej分析情况(ns＝non-significant,
**
p《0.005,
***
p≤0.0005，
****
p＜0.0001)。
40.图13为pm@tmsl纳米体系对肿瘤的靶向结果图。
41.图14中a为各组肿瘤组织的m1、m2巨噬细胞免疫荧光图(cd206:绿色；cd86:红色)；b为各组肿瘤组织的he染色图。
42.图15为肉眼肿瘤组织图。
具体实施方式
43.实施例1
44.按如图1所示的制备流程制备pm@tmsl，具体步骤如下：
45.1)纳米级血小板膜(pm)制备：
46.采用balb/c雌性小鼠全血标本，置于含有肝素抗凝剂的试管中，通过离心和洗涤从全血中分离出血小板，再通过反复冻融提取出血小板膜，将血小板膜悬置于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，超声处理5min(42khz，100w)，制得pm。
47.2)fe
iii
ta涂层负载lox的dmsns-nh2(tmsl)制备：
48.dmsns-nh2制备：将0.4g三乙醇胺溶解于5ml ddh2o中，转入至50ml烧瓶中，80℃油浴，磁力搅拌25min；然后加入0.2g十六烷基三甲基溴化铵和0.084g水杨酸钠，80℃油浴，磁力搅拌30min；快速向上述混合物中加入3ml正硅酸乙酯，80℃油浴并适度搅拌2h，离心，用乙醇洗涤3次纯化，70℃烘箱干燥过夜，得到初级产物。取0.2g初级产物加入40ml乙醇和0.6ml浓盐酸组成的混合溶剂中，60℃油浴并磁力搅拌6h,离心后用乙醇洗涤3次，置于80℃烘箱干燥过夜，经研磨后得到树枝状介孔二氧化硅(dmsns)。将0.3g dmsns加入到盛有100ml甲苯的烧瓶中，80℃油浴加热至澄清后，然后加入0.5ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，于80℃油浴加热回流4h，离心，用甲苯溶液洗涤3次，置于80℃烘箱干燥过夜，经研磨后得到dmsns-nh2。
49.tmsl制备：将300μg lox和100μg dmsns-nh2在室温下磁力搅拌4h，得到dmsns-nh2@lox，随后，逐滴加入1μl 25mm ta溶液和2.5μl 38mm fecl3·
6h2o溶液，进行简单超声和搅拌，再加入500μl3-(n-吗啉)丙磺酸缓冲液(mops，20mm，ph7.4)，磁力搅拌5min，10000g*10min离心，得到fe
iii
ta涂层负载lox的dmsns-nh2。
50.3)血小板膜伪装的fe
iii
ta涂层负载lox的dmsns-nh2(pm@tmsl)的制备：
51.将150μg tmsl与107个纳米级pm超声融合10min(42khz,100w)，随后使用200nm膜孔径的多孔注射器过滤器过滤5次，离心14000rpm*15min，得到pm@tmsl。
52.实施例2
53.按如图1所示的制备流程制备pm@tmsl，具体步骤如下：
54.1)纳米级血小板膜(pm)制备：
55.采用balb/c雌性小鼠全血标本，置于含有肝素抗凝剂的试管中，通过离心和洗涤从全血中分离出血小板，再通过反复冻融提取出血小板膜，将血小板膜悬置于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，超声处理5min(42khz，100w)，制得pm。
56.2)fe
iii
ta涂层负载lox的dmsns-nh2(tmsl)制备：
57.dmsns-nh2制备：将0.3g三乙醇胺溶解于5ml ddh2o中，转入至50ml烧瓶中，60℃油浴，磁力搅拌30min；然后加入0.1g十六烷基三甲基溴化铵和0.05g水杨酸钠，60℃油浴，磁力搅拌30min；快速向上述混合物中加入1ml正硅酸乙酯，80℃油浴并适度搅拌1h，离心，用乙醇洗涤3次，60℃烘箱干燥过夜，得到初级产物。取0.15g初级产物，加入20ml乙醇和0.2ml浓盐酸，60℃油浴并磁力搅拌6h,离心后用乙醇洗涤3次，置于80℃烘箱干燥过夜，经研磨后得到树枝状介孔二氧化硅(dmsns)。将0.1g dmsns加入到盛有100ml甲苯的烧瓶中，80℃油浴加热至澄清后，然后加入0.1ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，于60℃油浴加热回流4h，离心，用甲苯溶液洗涤3次，置于80℃烘箱干燥过夜，经研磨后得到dmsns-nh2。
58.tmsl制备：将100μg lox和100μg dmsns-nh2在室温下磁力搅拌4h，得到dmsns-nh2@lox，随后，逐滴加入1μl 40mm ta溶液和1μl 50mm fecl3·
6h2o溶液，进行简单超声和搅拌，再加入200μl 3-(n-吗啉)丙磺酸缓冲液(mops，20mm，ph7.4)，磁力搅拌5min，10000g*10min离心，得到fe
iii
ta涂层负载lox的dmsns-nh2。
59.3)血小板膜伪装的fe
iii
ta涂层负载lox的dmsns-nh2(pm@tmsl)的制备：
60.将100μg tmsl与106个纳米级pm超声融合10min(42khz,100w)，随后使用200nm膜孔径的多孔注射器过滤器过滤5次，离心14000rpm*15min，得到pm@tmsl。
61.实施例3
62.按如图1所示的制备流程制备pm@tmsl，具体步骤如下：
63.1)纳米级血小板膜(pm)制备：
64.采用balb/c雌性小鼠全血标本，置于含有肝素抗凝剂的试管中，通过离心和洗涤从全血中分离出血小板，再通过反复冻融提取出血小板膜，将血小板膜悬置于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，超声处理5min(42khz，100w)，制得pm。
65.2)fe
iii
ta涂层负载lox的dmsns-nh2(tmsl)制备：
66.dmsns-nh2制备：将0.5g三乙醇胺溶解于5ml ddh2o中，转入至50ml烧瓶中，100℃油浴，磁力搅拌30min；然后加入0.6g十六烷基三甲基溴化铵和0.2g水杨酸钠，100℃油浴，磁力搅拌30min；快速向上述混合物中加入6ml正硅酸乙酯，80℃油浴并适度搅拌2h，离心，用乙醇洗涤3次纯化，80℃烘箱干燥过夜，得到初级产物。取0.5g初级产物，加入90ml乙醇和1.2ml浓盐酸，90℃油浴并磁力搅拌8h,离心后用乙醇洗涤3次，置于80℃烘箱干燥过夜，经研磨后得到树枝状介孔二氧化硅(dmsns)。将0.5g dmsns加入到盛有100ml甲苯的烧瓶中，80℃油浴加热至澄清后，然后加入2ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，于100℃油浴加热回流4h，离心，用甲苯溶液洗涤3次，置于80℃烘箱干燥过夜，经研磨后得到dmsns-nh2。
67.tmsl制备：将200μg lox和100μg dmsns-nh2在室温下磁力搅拌4h，得到dmsns-nh2@lox，随后，逐滴加入10μl 20mm ta溶液和10μl 20mm fecl3·
6h2o溶液，进行简单超声和搅拌，再加入2000μl 3-(n-吗啉)丙磺酸缓冲液(mops，20mm，ph7.4)，磁力搅拌5min，10000g*10min离心，得到fe
iii
ta涂层负载lox的dmsns-nh2。
68.3)血小板膜伪装的fe
iii
ta涂层负载lox的dmsns-nh2(pm@tmsl)的制备：
69.将200μg tmsl与108个纳米级pm超声融合10min(42khz,100w)，随后使用200nm膜孔径的多孔注射器过滤器过滤5次，离心14000rpm*15min，得到pm@tmsl。
70.实施例4pm@tmsl体系的特性研究
71.1、粒子尺寸与微观测试
72.使用透射电镜(tem)对实施例1制备的pm、dmsns-nh2、tmsl及pm@tmsl的尺寸进行检测，其结果如图2所示，pm粒径：88.63
±
11.03nm；dmsns-nh2粒径：82.14
±
1.19nm；tmsl的水合粒径为110nm；pm@tmsl粒径：66.31
±
5.85nm。pm@tmsl为球形纳米颗粒，在水溶液中具有良好的分散性。
73.对实施例1制得的pm@tmsl进行sds-page、super-edx mapping元素分析，结果如图2、3所示。从图2、3结果可以看出，pm@tmsl成功制备，并通过bradfford蛋白测量法得到lox的封装率为94％。
74.2、生物相容性及cck8毒性测试
75.对实施例1制备的tmsl、pm@tmsl的溶血率进行测试。取健康人新鲜红细胞，用pbs稀释为5％，分别将tmsl、pm@tmsl(终浓度为0、0.01、0.1、1、10、50、100、200μg/ml)加入红细胞稀释液中，37℃孵育2h，其结果如图8中a所示，在最高浓度200μg/ml时，tmsl、pm@tmsl的溶血率分别为0.56％
±
0.070％、0.49％
±
0.081％，均低于纳米材料溶血率国际值5％。
76.对实施例1制备的tmsl、pm@tmsl被巨噬细胞吞噬情况进行测试。将raw264.7铺于6孔板中，待贴壁后加入tmsl、pm@tmsl(30μg/ml)处理巨噬细胞1h后，在荧光显微镜下观察拍照。其结果如图5中b所示，tmsl被巨噬细胞大量吞噬，而血小板膜伪装的tmsl仅少量吞噬，表明血小板膜的伪装赋予了tmsl逃避网状内皮系统吞噬清除的能力。
77.测试材料tms、pm@tms的毒性：按实施例1方法制得tms、pm@tms，只是在步骤2)中不加lox。
78.tms、pm@tms对人脐静脉内皮(huvec)细胞、人肾小球系膜(hmc)细胞的cck8毒性试验：huvec、hmc细胞铺于96孔板中，分别将tms、pm@tms(终浓度为0、5、10、20、40、60、80、100、200μg/ml)加入上述96孔板中，孵育24h后进行cck8试验检测细胞毒性，结果见图8中b、c所示。从图中可以看出，在最高浓度200μg/ml时，tms、pm@tms处理的huvec细胞活力分别为98.49％
±
1.68％、98.45％
±
5.81％，tms、pm@tms处理的hmc细胞活力分别为103.27％
±
4.80％、101.71％
±
7.86％，基本是没有细胞毒性。
79.3、溶酶体逃逸测试
80.对实施例1制备的dmsns-nh2@lox、pm@tmsl的溶酶体逃逸功能进行测试，将4t1细胞铺于6孔板中，待贴壁后加入dmsns-nh2@lox、pm@tmsl(30μg/ml)处理4t1细胞2h、4h、8h后，在荧光显微镜下观察拍照。其结果如图6、7所示，dmsns-nh2@lox、pm@tmsl在2小时被4t1细胞内吞至溶酶体，孵育4小时及8小时后，pm@tmsl从溶酶体中逃逸出来，但dmsns-nh2@lox仍未逃逸出溶酶体。表明pm@tmsl体系具有溶酶体逃逸的能力，实现lox的有效递送并发挥作用。
81.4、纳米粒子的靶向实验及生物分子机制研究
82.对实施例1制备的纳米级血小板膜(pm)对4t1细胞的靶向功能进行评估，将4t1细胞铺于6孔板中，待贴壁后加入纳米级血小板膜(pm)处理4t1细胞2h后，pbs缓冲液清洗2～3
遍，加入hoechst33342染料孵育15min。pbs清洗后于荧光显微镜下观察并拍照。结果如图5中a所示，pm对4t1细胞具有很强的靶向性。
83.对实施例1制备的纳米级血小板膜(pm)及pm@tmsl纳米体系免疫逃逸功能及靶向功能的分子机制进行研究。血小板膜表面的cd47分子具有防止血小板不被巨噬细胞吞噬和清除的重要分子标志物，同时，血小板膜表面尤其是活化后会高表达p-选择素，可以与4t1肿瘤细胞膜上的cd44受体特异性结合，实现对肿瘤细胞的主动靶向作用。我们使用western blotting实验检测纳米级血小板膜(pm)及pm@tmsl纳米体系的cd47及p-选择素分子的表达情况，图5中c结果表明纳米级血小板膜(pm)及pm@tmsl纳米体系均表达cd47及p-选择素分子。
84.5、pm@tmsl纳米体系的体外抗肿瘤作用及其机制研究1)检测lox对4t1细胞活力的影响，检测出lox的ic50值应用于后续实验。将4t1细胞接种于96孔板中(4000个cells/孔)，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的lox(0、1、10、50、100、200、250、500、1000、2500、10000ng/ml)，在37℃、5％ co2培养箱中孵育24h，利用mtt法检测细胞活力。如图9所示，4t1细胞的ic50值约为909.5ng/ml。
85.2)检测实施例1制备的pm@tmsl纳米体系对4t1细胞活力的影响，分为control、tms、lox、tmsl、pm@tmsl 5组，将对数生长期的4t1加入96孔板中(4000个cells/孔)，control、tms组不含lox，lox、tmsl、pm@tmsl组分别以含lox浓度1μg/ml加入4t1细胞并处理24小时后，利用mtt法检测各处理组对4t1细胞活力的影响。同时，将4t1细胞铺于6孔板中，待贴壁后进行以上同种处理，利用calcein-am/pi染色法检测各组处理的细胞死亡情况。如图10中a所示，pm@tmsl的细胞死亡数量最多。
86.3)对实施例1制备得到的pm@tmsl纳米体系在体外诱导4t1产生ros的效果进行分析。取对数生长期的4t1细胞铺于6孔板中，待贴壁后进行同2)中所述分组处理，control、tms组不含lox，lox、tmsl、pm@tmsl组分别以含lox浓度1μg/ml加入4t1细胞并处理24小时后，利用荧光试验及流式细胞术技术检测各处理组的ros水平，结果见图10中b、图11中b所示。图10中b结果表明pm@tmsl产生的ros荧光最多。图11中b结果显示pm@tmsl体系组的ros水平为76.7％，在所有处理组中，pm@tmsl体系组的ros水平最高。
87.对实施例1制备得到的pm@tmsl纳米体系在体外诱导4t1产生凋亡的效果进行定量分析。取对数生长期的4t1细胞铺于6孔板中，待贴壁后进行同2)中所述分组处理，control、tms组不含lox，lox、tmsl、pm@tmsl组分别以含lox浓度1μg/ml加入4t1细胞并处理24小时后，利用流式细胞术技术检测各处理组的凋亡水平，结果见图11中a所示。从图中可以看出，pm@tmsl体系产生的凋亡水平为84.9％，pm@tmsl体系组的凋亡水平最高。
88.4)对实施例1制备得到的pm@tmsl纳米体系在体外诱导4t1产生铁死亡的效果进行分析。通过c11bodipy581/591探针实验检测细胞铁死亡情况，将4t1细胞铺于6孔板中，待贴壁后进行同2)中所述分组处理，control、tms组不含lox，lox、tmsl、pm@tmsl组分别以含lox浓度1μg/ml加入4t1细胞并处理24小时后，利用c11bodipy581/591探针检测各处理组的脂质过氧化水平，结果见图10中c所示。从图中可以看出，pm@tmsl纳米体系脂质过氧化水平最高。
89.5)对实施例1制备得到的pm@tmsl纳米体系进行划痕试验，检测其对4t1细胞侵袭抑制作用。将4t1细胞铺于6孔板中，待贴壁长满6孔板后，用200μl的枪头进行划痕，pbs清洗
去除飘浮的细胞，显微镜下进行拍照，记为0h的状态。进行同2)中所述分组处理，control、tms组不含lox，lox、tmsl、pm@tmsl组分别以含lox浓度1μg/ml加入4t1细胞，显微镜下观察并记录24h的细胞情况。通过imagej软件处理各组处理后的细胞侵袭情况并进行统计。各组处理后的细胞侵袭情况见图12中b、c、e所示，从图中可以看出，pm@tmsl纳米体系对4t1细胞的侵袭抑制作用最强。
90.6)对实施例1制备得到的pm@tmsl纳米体系进行transwell试验，检测其对4t1细胞的转移抑制作用。将2.5
×
104个细胞加入8μm的transwell上层小室中，再分别进行control、tms、lox、tmsl、pm@tmsl分组处理。在transwell下层小室中加入含10％胎牛血清(fbs)的rpmi-1640培养基，孵育24h后，用4％多聚甲醛固定，结晶紫进行染色。在显微镜下观察并记录4t1细胞的迁移情况，结果见图12中a、d所示。从图中可以看出，pm@tmsl纳米体系对4t1细胞的迁移抑制作用最强。
91.6、pm@tmsl的体内抗肿瘤作用及其机制研究
92.1)对实施例1构建的tmsl、pm@tmsl纳米体系的肿瘤靶向能力进行检测。建立皮下荷瘤鼠模型，当皮下荷瘤小鼠体积达到100mm3时及肺部转移瘤小鼠造模成功后，通过尾静脉注射cy5标记的tmsl、pm@tmsl各100μl。通过小动物多模式成像系统检测上述体系在体内分布情况，结果见图13所示。从图中可以看出，相比较tmsl，pm@tmsl对肿瘤的靶向效果更好。
93.2)对实施例1构建的pm@tmsl纳米体系的体内抗肿瘤作用进行检测，按上述方法构建皮下荷瘤鼠模型，当皮下荷瘤小鼠体积达到100mm3时及肺部转移瘤小鼠造模成功后，随机分为control、tms、lox、tmsl、pm@tmsl共5组进行治疗，治疗浓度以lox 200μg/kg为标准。每隔1天给药1次，治疗14天后将小鼠安乐死，取出小鼠肿瘤组织拍照记录各组治疗后肿瘤大小。各处理组治疗14天后的肉眼肿瘤组织见图15所示，从图中可以看出pm@tmsl处理组的肿瘤最小，抗肿瘤效果最好。
94.3)对实施例1构建的pm@tmsl纳米体系的体内免疫治疗效应进行分析。将治疗14天后的小鼠安乐死并取出小鼠肿瘤组织，进行组织免疫荧光染色分析肿瘤组织的m1与m2巨噬细胞极化情况，结果见图14中a所示。从图中可以看出，pm@tmsl处理组的m2巨噬细胞基本极化为m1巨噬细胞，调节肿瘤相关巨噬细胞免疫微环境，促进肿瘤的免疫治疗效应。图14中b显示pm@tmsl处理组的肿瘤坏死最严重，抗肿瘤效果最好。

技术特征：
1.一种血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系的制备方法，包括如下步骤：1)制备纳米级血小板膜；2)制备鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅，包括如下步骤：2-a.氨基化介孔二氧化硅的制备：将三乙醇胺溶解于去离子水中，在适宜温度下再加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠，混合均匀，得到混合液，接着向混合液中加入正硅酸乙酯，加热搅拌反应，反应结束后，离心、洗涤、干燥，得到初级产物，再将初级产物加入由乙醇和浓盐酸组成的混合溶剂中继续水浴搅拌，结束后，离心、洗涤、干燥，得到介孔二氧化硅；将介孔二氧化硅溶解于甲苯中，再加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，加热回流，待反应结束后，离心、洗涤、干燥，得到氨基化介孔二氧化硅；2-b.鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅的制备：在室温下，将乳酸氧化酶与氨基化介孔二氧化硅按配比混合，得到混合液，接着将鞣酸溶液和fecl3.6h2o溶液逐滴加入混合液中，超声分散，再加入3-(n-吗啉)丙磺酸缓冲液，搅拌，离心，得到鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅；3)制备血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系：将鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅与纳米级血小板膜超声融合后，过滤、离心，得到血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，制备纳米级血小板膜的步骤具体为：收集小鼠全血标本，置于含有肝素抗凝剂的试管中，通过离心和洗涤从全血中分离出血小板，再通过反复冻融提取出血小板膜，将血小板膜悬置于磷酸盐缓冲溶液中，超声处理，得到纳米级血小板膜。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2-a中，所述三乙醇胺、十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸钠、正硅酸乙酯的质量体积比为(0.3～0.5)g：(0.1～0.6)g:(0.05～0.2)g：(1～6)ml；所述初级产物与混合溶剂的质量体积比为(0.15～0.5)g：(20～120)ml；所述混合溶剂中，乙醇与浓盐酸的体积比为(20～90)ml：(0.2～1.2)ml；所述介孔二氧化硅与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量体积比为(0.1～0.5)g：(0.1～2)ml。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2-a中，适宜温度为60～100℃；加热搅拌反应的温度为60～100℃，时间为1～4h；继续搅拌的温度为60～90℃，继续搅拌的时间为4～10h；加热回流的温度为60～100℃，加热回流的时间为2～8h。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2-b中，乳酸氧化酶与氨基化介孔二氧化硅的质量比为(100～400)μg:(100～400)μg；所述鞣酸溶液的浓度为20～40mm，fecl3·
6h2o溶液的浓度为20～50mm，3-(n-吗啉)丙磺酸缓冲液的浓度为10～40mm、ph为7.4；所述氨基化介孔二氧化硅、鞣酸溶液、fecl3·
6h2o溶液与3-(n-吗啉)丙磺酸缓冲液的质量体积比为(100～400)μg:(1～10)μl：(1～10)μl：(200～2000)μl。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅的质量与纳米级血小板膜的个数之比为(100～200)μg:(106～108)个。7.一种根据权利要求1～6所述制备方法制得的血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系。
8.根据权利要求7所述的纳米体系，其特征在于，所述乳酸氧化酶负载于氨基化介孔二氧化硅的孔洞中，鞣酸铁涂层位于氨基化介孔二氧化硅的表面，血小板膜包裹鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅。9.根据权利要求7所述的纳米体系，其特征在于，所述乳酸氧化酶的封装率为94％～97％。10.一种根据权利要求7所述的纳米体系在制备靶向治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系及其制备方法。所述制备方法包括如下步骤：1)制备纳米级血小板膜；2)制备鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅；3)制备血小板膜伪装鞣酸铁涂层负载乳酸氧化酶的氨基化介孔二氧化硅纳米体系。本发明纳米体系是一种集诊疗于一体化的多模式仿生靶向纳米药物系统，具有生物相容性好，磁共振成像多功能及溶酶体逃逸的优点，能实现集诱发TNBC凋亡、免疫治疗与铁死亡的多模式组合疗法。免疫治疗与铁死亡的多模式组合疗法。免疫治疗与铁死亡的多模式组合疗法。


技术研发人员：桂嵘 刘海艇 聂新民 李建 黄蓉 黄雪原 董航 陆路
受保护的技术使用者：中南大学湘雅三医院
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/7/31